Parallelamente allo sviluppo degli indoli sostituiti, i ricercatori di AbbVie
hanno utilizzato la tecnica 1H-13C HSQC NMR per studiare una libreria di 17000
molecole relativamente alla loro affinità per Mcl-1 marcato con 13C.36 Come
saggio ortogonale è stato impiegato FPCA (fluorescence polarization competition assay); i risultati dell'NMR, combinati con le buone affinità dei ligandi e la fattibilità sintetica hanno portato all'identificazione di due famiglie chimiche di inibitori di Mcl-1 adatti per un ulteriore sviluppo: i derivati arilsulfonammidici e i salicilati. La progettazione structure-based di un hit arilsolfonammidico ha portato
alla scoperta di 38 (Figura 19), con un IC50 per l’interazione Mcl-1/Bim di 30 nM.
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rivelato che l'acido carbossilico forma un ponte salino con Arg263, residuo analogo a Asp67 del peptide Bim-BH3; l'anello fenilico periferico dell'etere bifenilico raggiunge la tasca p1, ed il gruppo naftilico si lega nella tasca p2, molto più profonda della corrispondente Leu62 di Bim.
Allo stesso modo, la progettazione structure-based con la modellistica computazionale, è stata utilizzata per ottimizzare il salicilato lead, ottenendo il
composto 40, con IC50 di 0.57 μM, e quindi un aumento della potenza di 280
volte. La struttura cocristallizzata dell'analogo 41 ha confermato la modalità di legame ipotizzata, che coinvolge un ponte salino con Arg263, mentre l'anello 5- fenilico e la sua catena n-propilica si trovano rispettivamente nelle tasche p2 e p1 (Figura 25, a destra). Il profilo di selettività di queste due famiglie di inibitori per le proteine della famiglia Bcl-2 è al momento sconosciuto, poiché sono stati presentati dati solo per l'inibizione di Mcl-1. Sarà interessante accertare se la capacità del gruppo naftilico di 39 di interagire profondamente nella tasca p2 di Mcl-1 (e forse anche quello del salicilato 40) contribuisca alla selettività, come sembra essere il caso di grandi gruppi idrofobici, come ad esempio la porzione
naftilica nel composto 36 di AbbVie34 e il 4-cloro-3,5-dimetilfenile del lavoro di
Fesik.27 Infine, i dati sulle cellule non sono ancora riportati, quindi non è chiaro se
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Figura 24. Inibitori di Mcl-1 basati su 2-(arilsulfonammido)benzoati e salicilati sostituiti che sono stati ottenuti da frammenti iniziali di HSQC NMR.
Figura 25. Strutture cocristalline (superficie di Connolly) di Mcl-1 legata ai composti 39 (sinistra, codice PDB codice 4OQ5) e 41 (destra, codice PDB, 4OQ6) colorate per tipo di atomo (grigio=carbonio (Bcl-xL); verde=carbonio (39 o 41); rosso=ossigeno; blu=azoto; giallo=zolfo).
α-ELICHE SINTETICHE MIMETICHE DI BH3.
Sono stati sviluppati molti BH3-mimetici attraverso la progettazione di ligandi sintetici che siano complementari alle anse idrofobiche sulle superfici delle proteine Bcl-2 e che possano quindi inserirsi nelle sottotasche. Una strategia
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alternativa consiste nel cercare di mimare direttamente l'α-elica di BH3 con piccole molecole non-peptidiche. Questi mimetici dell'α-elica appartengono a una gamma di scaffold chimici che garantiscono il corretto orientamento angolare e spaziale delle loro catene laterali per imitare gli i, i+3/4 e i+7 (e talvolta i+11) delle catene laterali che sono proiettate da una faccia dell'α-elica del dominio BH3. Oltre agli α-elica mimetici classici a struttura terfenilica e tris- picolinammidica, sono stati decorati in maniera opportuna anche tereftalammidi, fenilpiperazinotriazine, e una varietà di altri scaffold per mimare una faccia
dell'elica di BH3.37,38,39 I derivati terfenilici rimangono tra i più potenti α-elica
BH3-mimetici, con valori di Ki pari a 114 nM per Bcl-xL. Sebbene molti mimetici
dell'elica siano particolarmente lipofili, è possibile ottenere la selettività per Bcl- xL rispetto a Mcl-1 e viceversa, così come rispetto alle altre interazioni proteina- proteina correlate. Inoltre, utilizzando lo scheletro purinico e la rigida struttura lineare del difenilacetilene, sono state introdotte α-eliche BH3-mimetiche anfipatiche con 2 facce, che, da una parte, riproducono la funzionalità idrofobica chiave e, dal lato opposto, conservano un residuo di aspartato. Due α-elica BH3- mimetici, che sono stati caratterizzati più approfonditamente, sono il derivato terfenilico BH3-M6 (42) e l'oligoarilammide JY-1-106 (43), mostrati in Figura 26. Il composto 42, proiettando i gruppi isobutilici e benzilici in modo analogo alle porzioni idrofobiche delle α-eliche di BH3, funziona come inibitore pan-Bcl-2 in
vitro (valori IC50 di 1.5 μM e 4.9 μM rispettivamente per i complessi Bcl-xL/Bak e Mcl-1/Bim) e nelle cellule tumorali, liberando proteine pro-apoptotiche, ed inducendo l'apoptosi in modo caspasi- e Bax-dipendente. Inoltre, è stato dimostrato che 42 sinergizza con l'inibitore del proteosoma CEP-1612,
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promuovendo la morte di cellule A549, presumibilmente in parte inibendo la degradazione delle proteine proapoptotiche. L'oligoarilammide 43 mostra un
profilo di affinità simile al terfenile 42, con valori IC50 di 0.394 μM e 10 μM,
rispettivamente per la rottura delle interazioni proteina-proteina Bcl-xL/Bak/BH3 e Mcl-1/Bak/BH3. Saggi di coimmunoprecipitazione nella linea cellulare REN che sovraesprime Bcl-xL/Mcl-1- hanno indicato che 43 riesce a distruggere le interazioni di Bcl-xL/Bak e Mcl-1/Bak. Il composto 43 promuove la morte cellulare nelle cellule tumorali indipendentemente dal livello di espressione di Mcl-1 ed è capace di superare la resistenza associata con l'inibitore selettivo Bcl- xL 1 negli studi di citotossicità, presumibilmente a causa della specificità intrinseca per pan-Bcl-2 di 43. La rilevazione della presenza di PARP frammentato ha suggerito che la morte cellulare è avvenuta tramite il pathway apoptotico intrinseco (mitocondriale), il che è ulteriormente supportato da uno spostamento al verde del segnale fluorescente associato alla colorazione JC-1 e da un drastico aumento della popolazione di cellule apoptotiche risultato da un saggio TUNRL. Questi risultati sono tutti coerenti con la disattivazione molecolare di proteine antiapoptotiche Bcl-2. Infine, 43 è risultato capace di inibire la crescita tumorale in un modello xenograft di cancro polmonare murinico.
Sulla base degli α-elica mimetici a struttura terfenilica e terpiridinica di
Hamilton,40,41 il gruppo di Poulain ha sviluppato la nuova oligopiridina MR29072
(44),42 o Piridoclax, che, secondo la Surface Plasmon Resonance (SPR), è
selettivo per Mcl-1 rispetto a Bcl-xL. L'origine della selettività può essere dovuta al fatto che tale composto riesce a mimare in modo efficace la fenilalanina i+7 del
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ligando Mcl-1 selettivo Noxa, residuo che non è conservato nelle proteine BH3- only. Studi computazionali su 44 indicano che il gruppo che mima la catena laterale i+7 della fenilalanina si lega nella tasca p3, mediante interazioni π-π con His224, Phe228 e una piridina terminale risulta nelle vicinanze di Arg263, con la quale potrebbe eventualmente formare un legame a idrogeno. Il saggio di Trasferimento di energia di risonanza bioluminescenza conferma che 44 distrugge il complesso di Mcl-1/Bim nelle cellule. Infine, pyridoclax (44) induce apoptosi in cellule di cancro delle ovaie, del polmone e del mesotelioma, quando viene cosomministrato con Abt-737 (1) o in presenza di siRNA per Bcl-xL.
Figura 26. Gli α-elica mimetici sintetici 42 e 43 sono inibitori pan-Bcl-2, mentre 44 è un inibitore Mcl-1 selettivo.
α/ß-FOLDAMERI.
Un eccellente ligando per inibire le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 potrebbe essere il peptide BH3 stesso, ma, in generale, i peptidi penetrano male le cellule e possono anche subire digestione proteolitica. L'inclusione di amminoacidi non naturali è una strategia con la quale potrebbe essere raggiunta la
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stabilità enzimatica. Di conseguenza, sono stati modificati i peptidi BH3 Bim e Puma, portando a peptidi α/β-foldameri che sono selettivi per Bcl-xL ed esibiscono affinità duale per Bcl-xL/Mcl-1.