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UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN FARMACIA
TESI DI LAUREA
TERAPIE INNOVATIVE PER IL TRATTAMENTO DEL CANCRO: SVILUPPO
DI SMALL MOLECULES QUALI INIBITORI DELLE PROTEINE
ANTIAPOPTOTICHE DELLA FAMIGLIA BCL-2
ANNO ACCADEMICO 2016-2017
RELATORI:
Prof.ssa
SABRINA TALIANI
Dott.ssaSILVIA SALERNO
CANDIDATO:
MATTEO FELSINI
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INDICE
INTRODUZIONE……….. 4
• Caspasi: Enzimi di demolizione cellulare………... 7
• Due distinti ma convergenti pathways per attivare le caspasi………... 8
• La famiglia Bcl-2: l’interruttore del ciclo vita/morte della cellula……….11
• Come viene azionato l’interruttore apoptotico Bcl-2...……….14
• Un enigma evolutivo...……….18
• Funzioni fisiologiche dei membri della famiglia Bcl-2. Proteine pro-sopravvivenza………..20
• Bax/Bak……….22
• Proteine BH3-only………....23
• Beclin-1: Un collegamento apparente tra Bcl-2 e autofagia………..25
• Il ruolo delle proteine della famiglia Bcl-2 nella cancerogenesi……26
• Il ruolo cruciale delle proteine della famiglia Bcl-2 nella terapia del cancro………....31
TERAPIE INNOVATIVE PER IL TRATTAMENTO DEL CANCRO: SVILUPPO DI SMALL MOLECULES QUALI INIBITORI DELLE PROTEINE ANTIAPOPTOTICHE DELLA FAMIGLIA BCL-2……….34
• Inibitori duali Bcl-xL/Bcl-2: ABT-737 e ABT-263 (Navitoclax).….37 • Inibitori Pan-Bcl-2: Gossipolo e derivati……….40
• Inibitori Pan-Bcl-2: Obatoclax………....……….42
• Inibitori duali di Bcl-2/Mcl-1: S1 e Derivati...……...….…………...43
• Inibitori selettivi di Mcl-1: Marinopirrolo A………...……...44
• Inibitore Mcl-1 selettivo: il derivato del Pirogallolo MIM1...……...45
• Inibitore selettivo di Mcl-1: 8-Idrossichinoline………...47
• Inibitore selettivo di Mcl-1: eterocicli 5,6-fusi, sostituiti in 3 da un acido carbossilico………...………48
• Inibitori selettivi di Bcl-2: Venetoclax………..……...50
• Inibitori selettivi di Bcl-xL: Wehi-539 e derivati...………..…...52
• Inibitori selettivi di Mcl-1: derivati di S1………....…..…..55
• Inibitori duali di Bcl-xL e Mcl-1: la strategia dell’ibridizzazione………..…………..56
3 • Inibitori Mcl-1 selettivi: arilsolfonammidi
3-N-(4-idrossinaftalen-1-il) sostituite………..59
• Inibitori Mcl-1 selettivi: acidi indol-2-carbossilici 3,7,N trisostituiti ………..61
• Inibitori Mcl-1: 2-(arilsolfonamido)benzoati e 2-idrossibenzoati (salicilati)………...63
• α-eliche sintetiche mimetiche di BH3………....……65
• Eliche intrecciate………69
• Un agonista Bax...………69
• Strategie per ottenere la selettività per i membri Della famiglia Bcl-2……….70
• Studi recenti………...…..73
CONCLUSIONI………76
4 INTRODUZIONE
I processi che portano alla morte cellulare si sono evoluti nel tempo per soddisfare alcune esigenze. Mentre alcuni organismi unicellulari possono ricorrere alla morte cellulare per ridurre il numero delle cellule in base alle riserve di nutrienti, gli organismi pluricellulari utilizzano il suicidio cellulare per importanti ed essenziali motivi.1 Durante l'embriogenesi, la morte cellulare modella i tessuti rimuovendo le cellule superflue, scavando i vasi, ad esempio, o eliminando le cellule interdigitali durante la formazione degli arti. Durante lo sviluppo neuronale, la morte cellulare è essenziale per adeguare il numero di neuroni ai target (ad es. altri neuroni o cellule muscolari). Negli adulti, la morte cellulare equilibra la proliferazione cellulare al fine di mantenere l'omeostasi in tessuti che si rinnovano rapidamente (ad esempio l'epitelio intestinale o il tessuto emopoietico) e, ad esempio, regola l'involuzione della ghiandola mammaria nello svezzamento e l’atrofia del timo nell’invecchiamento.2 La morte cellulare elimina
anche le cellule danneggiate irreparabilmente o potenzialmente pericolose, come quelle sottoposte a trasformazione neoplastica o i linfociti che bersagliano i propri tessuti.3 Infine, per limitare la diffusione degli agenti patogeni, il sistema immunitario, sia quello innato che quello adattativo, attacca le cellule infette, provocando una “corsa alle armi” in cui gli agenti patogeni sviluppano nuovi modi per prevenire il suicidio delle cellule ospiti, mentre le cellule ospitanti affinano le loro armi per uccidere le cellule infette.4
La principale modalità di morte cellulare programmata, l'apoptosi, è preponderante in diverse specie animali, ed è stata intensamente studiata nei
5 mammiferi, nel moscerino “Drosophila” della frutta, e nel verme “Caenorhabditis elegans”.
Dal punto di vista morfologico, l'apoptosi è caratterizzata dalla condensazione della cromatina, dalla contrazione del nucleo e del citoplasma, seguita dalla frammentazione della cellula in "corpi apoptotici", che sono rapidamente inghiottiti da cellule fagocitarie vicine, e infine digeriti nei lisosomi. La rimozione dei corpi cellulari, innescato dai segnali delle cellule morenti, è così rapida che l'apoptosi non è facilmente visibile dal punto di vista istologico, anche nei tessuti con un turnover cellulare massiccio, come il timo. A differenza della necrosi, l'apoptosi non provoca la rottura della membrana citoplasmatica, minimizzando così il rilascio di contenuto cellulare infiammatorio e il rischio di indurre autoimmunità.5
Le pietre miliari per la comprensione attuale dell'apoptosi sono state poste dalla confluenza di un gran numero di studi genetici su C. elegans con le scoperte riguardanti la genetica e la biochimica del cancro nei mammiferi. Il primo regolatore molecolare di morte cellulare accertato è emerso in seguito alla scoperta di una traslocazione cromosomica ricorrente in un linfoma follicolare umano che ha rivelato il gene BCL-2,6 prima sconosciuto. In uno studio è risultato che l'espressione di Bcl-2 rende le cellule emopoietiche in cultura refrattarie alla morte cellulare per eliminazione della citochina, e promuove l'accumulo delle cellule B in vivo, che spesso culmina in malattie autoimmuni o cancro (vedi sotto). Sorprendentemente, CED-9, che impedisce la morte cellulare programmata nel verme, è risultato essere l'omologo funzionale di Bcl-2 con un programma genetico parzialmente conservato (Figura 1). La scoperta che la proteina killer dei
6 vermi CED-3 somiglia a un nuovo tipo di proteasi dei mammiferi, ha suggerito che la demolizione delle cellule si basasse su cisteina proteasi aspartato specifiche, denominate poi caspasi. Successivamente, studi biochimici più fini, hanno reso noto che la cascata proteolitica inizia spesso sullo scaffold della proteina APAF-1, che si è rivelato l'omologo del CED-4 del verme. Collettivamente, queste ed altre scoperte discusse qui di seguito, hanno consentito di delineare il programma genetico per il controllo della morte apoptotica delle cellule, con numerosissimi possibili impieghi nella biologia e nel mantenimento della salute umana.7
Ci concentreremo sull'apoptosi nelle cellule dei mammiferi, perché i difetti nel suo controllo contribuiscono allo sviluppo di molte malattie dell’uomo,8 in particolare il cancro. In primo luogo descriveremo brevemente gli effettori dell’apoptosi, le caspasi, per poi concentrarsi sui suoi principali regolatori, in particolare la famiglia delle proteine Bcl-2. Discuteremo la funzione fisiologica dei membri della famiglia Bcl-2 ed i modi, non ancora del tutto chiariti, in cui le loro interazioni attivano il meccanismo apoptotico. Descriveremo brevemente il legame tra Bcl-2 e Beclin-1 per l’autofagia, un altro meccanismo di morte/sopravvivenza cellulare. Infine, discuteremo come l'apoptosi sia alterata nel cancro, limitando le attuali modalità di trattamento terapeutico, e come andare a modulare direttamente la macchina apoptotica possa offrire una nuova speranza per migliorare la terapia per il cancro e forse anche per certe malattie autoimmuni e infettive.
7 Figura 1. Confronto tra il percorso di morte cellulare programmata in C. elegans e quella dei vertebrati che è più importante. Il lombrico, ha un omologo di Bcl-2 (CED-9), dei suoi induttori di apoptosi BH3-only (EGL-1), dell'attivatore caspasi Apaf-1 (CED-4) e della caspasi proteolitica (CED-3). Tuttavia, una grossa differenza è che CED-9 si lega e inibisce direttamente CED-4, fino a quando CED-4 viene spostato da EGL-1, mentre la Bcl-2 del vertebrato non lega Apaf-1, ma impedisce invece l'attivazione dei suoi fratelli pro-apoptotici Bax e Bak, impedendo così la loro permeabilizzazione del MOM ed il rilascio del citocromo c (cyt c), un cofattore essenziale per Apaf-1.7
Caspasi: enzimi di demolizione cellulare.
Indipendentemente dallo stimolo di morte iniziale o dal tipo di cellule, l'apoptosi culmina nella frammentazione di diverse centinaia di proteine e del DNA. Le cisteinil proteasi aspartato-specifiche, chiamate caspasi, mediano la proteolisi e attivano anche il CAD (DNAsi attivata da caspasi), strappando il suo
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chaperone/inibitore ICAD (inibitore del CAD), consentendo a CAD di tagliare la
cromatina in una caratteristica scala di nucleosomi. Per struttura e funzione, le caspasi si suddividono in due gruppi: caspasi iniziatrici (o apicali) e caspasi effettrici (o esecutrici). Le caspasi esecutrici, le caspasi-3, -6 e -7, eseguono quasi tutte le proteolisi cellulari ed attivano il CAD, vengono sintetizzate come singole catene zimogene (pro-forma cataliticamente inattiva), con brevi pro-domini. La cascata proteolitica inizia quando una caspasi iniziatrice li rompe in frammenti di circa 20 (p20) e 10 (p10) kDa, che si riuniscono nelle proteasi tetrameriche attive (p202p102). Le caspasi iniziatrici, come le caspasi-8 o -9, hanno pro-domini lunghi che, a seguito di un segnale apoptotico, li indirizzano a specifici scaffold proteici (FADD/Mort1 per caspasi-8 e Apaf-1 per caspasi-9, Figura 2), dove le modifiche conformazionali provocano la loro attivazione.9
Alcune caspasi hanno funzioni non apoptotiche. La caspasi-1 e i suoi adattatori, che elaborano pro-IL-1b e IL-18, svolgono un ruolo critico nelle risposte infiammatorie. Sorprendentemente, la caspasi-8 e il suo adattatore FADD sono essenziali non solo per l'apoptosi indotta dai “recettori di morte” (cfr sotto), ma anche per lo sviluppo di vasi sanguigni, per la differenziazione dei macrofagi e per la proliferazione di alcuni tipi di cellule. Per innescare l'apoptosi, la caspasi-8 deve essere elaborata in tetrameri p202p102, ma le funzioni non apoptotiche richiedono solo la sua forma non attivata. Quella forma può impedire che le chinasi RIP1 e RIP3 provochino necroptosi (necrosi programmata).10
Due distinti ma convergenti pathways per attivare le Caspasi.
9 convergono su effettori di attivazione delle caspasi (Figura 2). Il pathway “death
receptor” (o estrinseco), coinvolge la membrana plasmatica mediante il legame
con i membri della super famiglia del recettore del fattore di necrosi tumorale (TNF), contenenti domini di morte intracellulari, come Fas e TNF-R1. Questi recettori innescano l'apoptosi formando un “complesso di segnalazione di induzione di morte", all'interno del quale la proteina adattatrice FADD, assistita dall'adattatore TRADD, in certi recettori di morte (ad es. TNF-R1), recluta e attiva la caspasi-8 (e la caspasi-10, negli esseri umani e in certe altre specie, ma non nel topo). Nel pathway mitocondriale regolato da Bcl-2 (o intrinseco), segnali citotossici, tipo la privazione del fattore di crescita e l’esposizione al danno al DNA, o alle terapie per il cancro, causano l'apoptosi attraverso l’attivazione dei membri pro-apoptotici della famiglia delle proteine Bcl-2 (vedi sotto). La loro azione, porta al rilascio dallo spazio intermembranale mitocondriale, non solo del citocromo c, che innesca l'attivazione di APAF-1 mediata da caspasi-9, ma anche di altre proteine apoptogene, quali SMAC/DIABLO, che impediscono che la proteina inibitrice dell’apoptosi XIAP inibisca la caspasi.11
Esperimenti su topi geneticamente modificati hanno mostrato che FADD e caspasi-8 sono essenziali per l’apoptosi indotta dal recettore di morte, ma superflui per l'apoptosi innescata dal pathway mitocondriale. Al contrario, le cellule mancanti di caspasi-9 o del suo attivatore APAF-1, presentano difetti nell’apoptosi regolata da Bcl-2, ma non in quella indotta dal recettore di morte. Comunque, è interessante notare che, nonostante la perdita o l'inibizione della caspasi-8 consenta una sopravvivenza a lungo termine (clonogenica) di cellule stimolate dal recettore di morte, la perdita di caspasi-9 o di APAF-1 non consente
10 la sopravvivenza a lungo termine delle cellule se è coinvolto il pathway mitocondriale. Questo perché la permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP), tramite l’attivazione di Bax e Bak (vedi sotto) porta la cellula a morte. Anche in assenza dell'attività della caspasi, la respirazione ridotta seguita dal rilascio del citocromo c attiva un backup di morte cellulare e un programma di ripristino (Goldstein et al, 2000).7
Figura 2. I due principali pathways per l'attivazione della caspasi nei vertebrati: il recettore di morte, o il pathway estrinseco, che coinvolge i membri della famiglia dei recettori TNF sulla superficie cellulare, e il pathway mitocondriale o intrinseco regolato da Bcl-2. I recettori di morte portano, tramite l'adattatore FADD (con l'aiuto di TRADD in alcuni recettori di morte), all'attivazione della caspasi-8, che poi attiva gli effettori delle caspasi-3, -6 e -7. Caspasi-8 gestisce anche la proteina BH3-only Bid, e la Bid troncata (tBid) può quindi attivare il pathway regolato da Bcl-2. Su MOMP, questo pathway conduce all'attivazione della caspasi effettiva tramite Apaf-1 e caspasi-9. L’ubiquitina ligasi citosolica E3 XIAP, può inibire le caspasi -3 e -7 (e forse la caspasi-9), ma questa inibizione è bloccata da SMAC/DIABLO quando viene rilasciata dai mitocondri. L’ubiquitina ligasi cIAP1 e cIAP2, funzionano invece in parte prevenendo la formazione del complesso di segnale pro-apoptotico da TNF-R1 e regolando la prosurvival Percorsi di sopravvivenza NF-kB.7
11 La famiglia Bcl-2: l’interruttore del ciclo vita/morte della cellula.
La famiglia Bcl-2 dei vertebrati, contiene tre sottogruppi funzionali (Figura 3 A). Bcl-2 ed i suoi più stretti omologi (Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl1 e, Bcl-B nell’uomo) che contengono quattro domini di sequenze conservate (chiamati domini (BH) Bcl-2 omologhi), promuovono la sopravvivenza cellulare. Gli effettori pro-apoptotici Bax, Bak e il membro meno studiato Bok, mostrano una grande somiglianza con i loro analoghi pro-sopravvivenza, tra cui le caratteristiche strutturali di tutte e quattro le regioni BH. Nonostante questa somiglianza, una volta attivati, Bax e Bak provocano danni ai mitocondri piuttosto che proteggerli, ed entrambe queste proteine sono in grado di provocare la MOMP, indicando ridondanza funzionale. Infine, gli iniziatori dell’apoptosi, le proteine BH3-only (che includono Bad, Bik, Hrk, Bid, Bim, Bmf, Noxa e Puma) condividono l'uno con l'altro e con la famiglia Bcl-2 in generale solo il dominio BH3 di circa 26 residui. Questa α-elica anfipatica permette loro di connettersi e inattivare i corrispondenti pro-sopravvivenza e forse anche di legarsi temporaneamente a Bax e Bak ed attivarli (vedi sotto). Le proteine BH3-only sono attivate da distinti stimoli citotossici in vari modi, tra cui un aumento della trascrizione e modifiche post-traslazionali.7
Mentre la maggior parte delle proteine BH3-only non sono strutturate prima di legare proteine pro-sopravvivenza, Bid forma un fascio α-elicoidale simile a Bax o a Bcl-2, nonostante la mancanza di omologia di sequenza, tranne che per il dominio BH3. Bid può legare il recettore di morte e Bcl-2 regola il
pathway perché la sua rottura ad opera della caspasi-8 genera un segmento
12 2). Questo meccanismo di amplificazione attivato da tBid è essenziale per la morte indotta dal recettore di morte nelle cellule cosiddette di tipo 2, come gli epatociti, ma non è dispensabile nelle cellule di tipo 1, come i timociti.7
La famiglia Bcl-2 può essere considerata come un interruttore tripartito che imposta la soglia per la morte cellulare, principalmente attraverso interazioni tra proteine all'interno della stessa famiglia. I membri pro-sopravvivenza possono legarsi con elevata affinità ai membri di entrambi i sottogruppi Bax/Bak-like o BH3-only, attraverso l'associazione del dominio BH3 delle proteine apoptotiche con una tasca idrofobica sulla superficie delle proteine pro-sopravvivenza. Queste interazioni, tuttavia, mostrano specificità (Figura 3B, C). I profili di affinità delle proteine BH3-only per le proteine pro-sopravvivenza differiscono notevolmente: Bim, Puma e forse tBid legano tutte con alta affinità, mentre altre proteine BH3-only mostrano maggiore selettività (Figura 3B). Stranamente Bad lega Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w ma non Mcl-1 o A1, mentre Noxa interagisce fortemente solo con Mcl-1 e A1. Di conseguenza, l’elevata espressione di Bim o Puma uccide drasticamente le cellule, mentre Bad e Noxa possono effettivamente indurre la morte cellulare solo se coespressi. Bax e Bak differiscono anche nella loro interazione con le proteine pro-sopravvivenza (Figura 3C). Bak può essere legato strettamente da Bcl-xL e Mcl-1, ma poco da Bcl-2, mentre tutte le proteine pro-sopravvivenza probabilmente possono limitare l'attività di Bax.7
13 Figura 3. (A) I tre sottogruppi funzionali della famiglia Bcl-2. Sono indicate le sequenze maggiormente omologhe di Bcl-2 (domini BH) e le regioni delle α-eliche. Le proteine BH3-only condividono una omologia di sequenza solo all'interno del dominio BH3, che media l'associazione tra i membri della famiglia. Bid ha una struttura 3D definita, ma gli altri sono relativamente non strutturati. Il gruppo pro-sopravvivenza, che condivide quattro regioni di omologia di sequenza, include Bcl-B negli esseri umani ma il suo omologo nel murino (Boo) sembra essere inattivo a causa di una mutazione di residui essenziali in BH1. Il gruppo pro-apoptotico Bax/Bak, che include il poco studiato Bok, è notevolmente simile in sequenza e struttura al gruppo pro-sopravvivenza, inclusa un α-elica simile a BH4 vicino all’N-terminale. La maggior parte dei membri della famiglia contengono una regione transmembrana idrofobica C-terminale (TM), che media il loro targeting e ancoraggio al MOM e/o al ER, sia in modo costitutivo (ad esempio Bcl-2 o Bak) o dopo uno stimolo apoptotico (ad esempio Bcl-xL o Bax). (B,C) Interazioni predominanti all'interno della famiglia Bcl-2, incluse quelle di proteine BH3-only con i loro analoghi pro-sopravvivenza (B) e le importanti interazioni di quest'ultimo con Bax e Bak (C).7
14 Come viene azionato l'interruttore apoptotico Bcl-2.
Sono stati proposti due modelli distinti, seppure uno non escluda l’altro, per descrivere come l'interazione tra le tre fazioni Bcl-2 attivi Bax e Bak, e quindi produca MOMP (Figura 4).
Figura 4. Modelli relativi alla modalità con cui le proteine BH3-only attivano Bax e Bak. (A) Nel modello di attivazione diretta, le proteine attivatrici BH3-only (Bim, tBid e probabilmente Puma), tramite il loro dominio BH3 (triangolo rosso), possono impegnarsi e attivare direttamente Bax (o Bak), ma nelle cellule sane i membri pro-sopravvivenza della famiglia ('Bcl-2 et al'), impediscono questo con sequestro degli attivatori BH3-only. Dopo un segnale apoptotico, le proteine sensibilizzatrici BH3-only (ad es. Bad, Noxa, Bik) liberano gli attivatori per raggiungere Bax o Bak. La forma citosolica inattiva di Bax, ha il suo dominio BH3 bloccato e la sua elica idrofobica C terminale (a9) si trova nella sua scanalatura di superficie, ma è durante l'attivazione che l'elica viene esposta e può bersagliare Bax alla membrana. (B) Nel modello di attivazione indiretta, le proteine BH3-only necessitano di legarsi solo ai loro analoghi pro-sopravvivenza, che prevalentemente impediscono l'attivazione di Bax e Bak sequestrando qualsiasi Bax o Bak che diventa attivo ('primed') per l'esposizione del suo dominio BH3 (triangolo rosso). (C) il modello di priming-capture-displacement proposto qui, include le caratteristiche dell'attivazione diretta e indiretta. In esso, qualsiasi Bax o Bak che viene attivato, sia spontaneamente che per mezzo di proteine BH3-only o di altri segnali (ad esempio la fosforilazione), viene immediatamente catturato da un analogo pro-sopravvivenza, fino a quando viene evitata una ulteriore attivazione di Bax o Bak ad opera di proteine BH3-only (ad esempio Bad o Bim). Gli Bax o Bak inattivati possono quindi formare dimeri e oligomeri superiori (vedere la Figura 5).7
15 Il modello di attivazione diretta (Figura 4A) postula che certe proteine BH3-only (chiamate "attivatori"), cioè Bim, tBid e probabilmente Puma, devono legare in modo transiente ed attivare Bax e Bak, mentre le altre proteine BH3-only, chiamate "sensibilizzatori" (ad esempio Bad, Noxa), possono legare solo i loro corrispettivi pro-sopravvivenza ('Bcl-2 et al' in Figura 4A). In questo modello, le proteine Bcl-2 pro-sopravvivenza funzionano sequestrando gli “attivatori” e l'apoptosi procede quando i "sensibilizzatori" spiazzano gli attivatori dalle proteine pro-sopravvivenza, permettendo loro di legarsi e attivare Bax e Bak. È stato provato che le proteine attivatrici BH3-only interagiscono con una superficie idrofobica dell’ansa di Bax e Bak che ricorda quella delle proteine pro-sopravvivenza, ma loro possono invece (o in aggiunta) legarsi ad un sito distale coinvolgendo α-eliche 1 e 6 di Bax. Il legame di alcuni domini BH3 a Bax o a Bak, è stato descritto come "hit and run" (transitorio e di bassa affinità) e questo cosiddetto "sito posteriore" non è stato ancora ben definito. Uno studio molto recente ha fornito un forte sostegno per l'attivazione diretta di Bak ad opera di Bim, tBid e, sorprendentemente, Noxa, ma, queste hanno chiaramente dimostrato di legarsi al "sito anteriore" di Bak. Forse possono essere usati entrambi i siti, uno per promuovere l’attivazione iniziale di Bax/Bak e l'altra per reclutare ulteriori molecole Bax (Bak) (vedi sotto).7
Il modello di attivazione indiretta (Figura 4B) postula che, probabilmente anche nelle cellule sane, alcune molecole Bax e Bak assumono (forse spontaneamente) una "conformazione primaria", cioè una conformazione in cui il loro dominio BH3 è esposto, e che i membri della famiglia pro-sopravvivenza prevengono l'apoptosi legandosi a questo dominio, impedendo così a Bax e Bak di
16 oligomerizzare (vedi sotto). In questo modello, il ruolo primario di tutte le proteine BH3-only è di legarsi alle proteine pro-sopravvivenza, e l'apoptosi può avvenire solo quando tutte le proteine pro-sopravvivenza relative sono state neutralizzate, liberando così il Bax o Bak “primario” per oligomerizzare e causare la MOMP. In accordo con questo modello, le molecole Bax con mutazioni del dominio BH3, che impediscono il loro sequestro da parte dalle proteine pro-sopravvivenza, provocano una apoptosi incontrollata. Recentemente sono stati studiati in vivo i modelli diretto e indiretto utilizzando topi gene-targeted in cui il dominio BH3 di Bim (che lega tutte le proteine pro-sopravvivenza Bcl-2 e possibilmente Bax) è stato sostituito in situ con quello di Bad, Noxa o Puma, creando alleli che codificano rispettivamente per BimBad (che lega solo 2, Bcl-xL, Bcl-w), BimNoxa (che lega solo Mcl-1, A1) e BimPuma (che lega tutte le proteine pro-sopravvivenza Bcl-2, ma non Bax). I risultati hanno mostrato che, per una morte cellulare ottimale, Bim deve essere in grado di legare tutti i membri della famiglia anti-apoptotica Bcl-2, come nel modello indiretto, ma che la sua interazione con Bax può contribuire ad uccidere le cellule, suggerendo che la morte fisiologica delle cellule può seguire entrambi i modelli.
I due modelli potrebbero rappresentare pathways alternativi di morte cellulare, oppure diverse tappe di un singolo pathway. Ad esempio, nel modello “priming-capture-displacement” (Figura 4C) è stato proposto che l’attivazione diretta delle proteine BH3-only sia almeno uno dei modi in cui vengono generati Bak e Bax “primari”, ma che gli analoghi pro-sopravvivenza catturano immediatamente la forma primaria di Bax e Bak, fino a che le proteine BH3-only non la spiazzano, come nel modello di attivazione indiretta.7
17 È interessante notare che i membri della famiglia pro-sopravvivenza possono regolare Bax e Bak in diversi modi. Secondo un recente report, Bax nelle cellule sane trasloca spontaneamente dal citosol per associarsi perifericamente con i mitocondri, ma Bcl-xL si lega a Bax e lo ritrasloca nel citosol, dove questo eterodimero si dissocia. Inoltre, il modello “embedded together” suppone che Bax e Bcl-2 interagiscano solo dopo che entrambi sono stati riarrangiati per nascondere le loro eliche α5 e α6, così come la α9 terminale, all'interno della MOM (vedi sotto). Inoltre, in sistemi semplificati che utilizzano proteine ricombinate con liposomi o mitocondri isolati, tBid si lega rapidamente alla membrana e recluta Bax, ma il suo reclutamento viene ostacolato da Bcl-xL, che potrebbe sequestrare sia tBid che Bax, finchè l'aggiunta di Bad spiazza Bax da Bcl-xL.
Uno dei grandi misteri della morte cellulare è come Bax e Bak omo-oligomerizzano e distruggono la MOM. Sebbene non sia ancora disponibile una struttura 3D di forme attive di Bax o Bak, qualcosa è stato scoperto. Anticorpi e sonde biochimiche indicano che le strutture globulari di Bax e Bak inattivi sono sostanzialmente alterate da vari riarrangiamenti durante la loro attivazione. In particolare, in una fase iniziale, Bak espone il suo dominio BH3, che può intercalarsi nell’ansa parzialmente esposta di un'altra molecola di Bak ugualmente attivata, formando un dimero che sembra essere simmetrico (Figura 5A). Questi nuovi dimeri possono quindi multimerizzare in oligomeri più grandi attraverso un'interfaccia diversa che coinvolge la elica α6 di Bak. Si pensa che l’oligomerizzazione di Bax proceda in modo simile. Tuttavia, il sito "posteriore" di Bax proposto esclude la possibilità che Bax possa invece inserire un dominio
18 BH3 esposto in quel sito su un'altra molecola Bax, formando dimeri "asimmetrici" che potrebbero produrre una “ghirlanda” di monomeri (Figura 5B). In ogni caso, uno step fondamentale per la oligomerizzazione di Bax e Bak e la permeabilizzazione della membrana potrebbe essere l'inserimento delle loro eliche α5 e α6 come una forcella attraverso il doppio strato della MOM (Figura 5B).7
Non è chiaro se Bax e Bak producono omo-oligomeri di dimensioni definite, ma “pori” proteici abbastanza grandi da consentire l'uscita di tutte le proteine intermembranali probabilmente richiederebbero 8-12 unità proteiche. Tuttavia, gli oligomeri possono semplicemente creare pori lipidici di dimensione indefinita distruggendo il doppio strato lipidico. Per chiarire questi step cruciali, c'è una urgente necessità di determinare le strutture 3D delle forme attivate di Bax e Bak e dei loro eterodimeri con gli analoghi pro-sopravvivenza, preferibilmente ancorati all'interno della membrana.7
Un enigma evolutivo.
Dato il ruolo centrale della MOMP mediata da Bax/Bak nell’apoptosi dei vertebrati, è paradossale che la disfunzione mitocondriale giochi un ruolo poco importante in vermi e mosche. C. elegans non ha nessun equivalente pro-apoptotico a Bax/Bak e l’omologo CED-4 di APAF-1 nel verme non richiede l'attivazione del citocromo c per attivare la caspasi CED-3 (Figura 1).
19 Figura 5. Modelli che mostrano l’oligomerizzazione di Bax e Bak. (A) In questo modello di multimerizzazione dei dimeri, dopo l'attivazione ad opera di un segnale apoptotico, Bak (o Bax) estrude prima il suo dominio BH3, che permette di impegnare un'altra molecola "Bak" (o Bax) "primaria" per formare un dimero "simmetrico" (faccia a faccia). Questi dimeri poi multimerizzano su un'altra interfaccia, come quella tra le eliche α6, per formare i grandi oligomeri che provocano MOMP, permettendo al citocromo c (cyt c) di uscire nel citosol (Dewson et al, 2009). (B) In un modello alternativo, basato sull’ipotesi che alcuni domini BH3 possano impegnare un nuovo sito "posteriore" su Bax, Bak primario (o Bax) può attivare la parte posteriore di un'altra molecola attivata per formare un dimero asimmetrico (fronte-a-schiena), che potrebbe essere esteso con l'assunzione di monomeri. In questo modello, è raffigurato l'inserimento della forcella a5-a6, così come l'a9. Tale inserzione potrebbe anche essere caratterizzata dal modello illustrato in (A).7
Invece CED-9 sequestra direttamente CED-4, fino a quando EGL-1 si lega a CED-9, liberando CED-4 per attivare CED-3. Inoltre, mentre gli omologhi di Bcl-2 svolgono un ruolo cruciale per la sopravvivenza cellulare nei vermi e nei vertebrati, questo ruolo nei Drosophila è ricoperto dal controllo diretto delle caspasi ad opera delle IAPs, anziché dalle due proteine della mosca correlate a Bcl-2, e la disfunzione mitocondriale non è coinvolta. Rimane ancora oscuro il motivo per cui l'apoptosi sia strettamente legata alla MOMP regolata da Bcl-2 nei vertebrati ma non negli invertebrati più studiati.7
20 Funzioni fisiologiche dei membri della famiglia Bcl-2.
Proteine pro-sopravvivenza.7
Studi che utilizzano topi transgenici e con geni knockout, hanno messo ben in luce le funzioni biologiche dei membri della famiglia Bcl-2. La sovraespressione di Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 o A1 in cellule linfoidi e in altre cellule emopoietiche, protegge la cellula da diversi segnali citotossici, sia fisiologici (ad es. privazione di citochine) che esterni (ad esempio radiazioni γ, farmaci chemioterapici), svolgendo un ruolo di “guardiano”. La sovraespressione delle proteine pro-sopravvivenza nei linfociti porta alla linfoadenopatia, che, nel caso di Bcl-2 e Mcl-1, può raramente (ma significativamente) progredire a linfoma maligno. La sovraespressione di Bcl-2 (ma non Mcl-1) può anche provocare una malattia renale fatale simile al lupus eritematoso sistemico umano (SLE), dimostrando che difetti a livello del processo apoptotico possono promuovere malattie autoimmuni.
Differenti tipi di cellule dipendono in modo diverso dalle singole proteine pro-sopravvivenza, presumibilmente a causa della variabilità del profilo di espressione e della selettività delle interazioni (Figura 3B e C). Ad esempio, i topi
bcl-2-/- sviluppano: (i) la sindrome del rene policistico fetale (PKD), dovuta alla morte delle cellule stem/progenitrici dell’epitelio renale embrionale; (ii) l’ingrigimento prematuro, dovuto alla morte dei progenitori dei melanociti; (iii) l'immunodeficienza, dovuta all'invecchiamento delle cellule B e T. Da notare che tutti questi disturbi degenerativi vengono eliminati con l’assenza concomitante di Bim (nel caso di PKD, anche perdita di un singolo allele Bim), dimostrando che Bim e Bcl-2 sono i principali regolatori reciprocamente antagonisti dei processi di
21 vita/morte in questi tipi di cellule.
I tipi cellulari più colpiti dalla perdita di Bcl-x includono i progenitori eritroidi fetali, alcune popolazioni neuronali, cellule germinali maschili, timociti immaturi (CD4+ CD8+), epatociti e piastrine. I topi bcl-x-/- muoiono entro 14-15
giorni per grave anemia e degenerazione neuronale e i maschi bcl-x+/- presentano fertilità fortemente ridotta. È interessante notare che la perdita di Bim ripristina la fertilità nei maschi bcl-x+/- e impedisce l’invecchiamento eritroideo causato da una completa perdita di bcl-x, ma non salva i neuroni, così gli embrioni bim-/-bcl-x -/-muoiono ancora intorno al giorno 15. Quindi, l'interazione Bim-Bcl-xL determina il destino dei progenitori eritroidi e delle cellule germinali maschili, ma Bim non è l’unica proteina BH3-only che regola la sopravvivenza neuronale.
La perdita di Mcl-1 ha effetti importanti: la sua perdita completa causa mortalità embrionale preimpianto, e studi sulla delezione hanno dimostrato che Mcl-1 è importante per la sopravvivenza delle cellule emopoietiche, per i progenitori linfoidi B e T immaturi e per la loro restante progenie, per le cellule B germinali attivate, per i granulociti e i macrofagi attivati, per alcune popolazioni neuronali nel cervello embrionale e per gli epatociti.
Bcl-w e A1 potrebbero avere ruoli più limitati. Sebbene Bcl-w sia ampiamente espressa, la sua perdita provoca difetti notevoli solo nella spermatogenesi adulta e nelle cellule epiteliali dell'intestino tenue, che diventano più sensibili al danno del DNA. Il topo ha almeno tre geni a1 espressi, e la perdita di uno di essi (a1a) accelera l'apoptosi nei granulociti e nei mastociti.
Collettivamente, questi risultati supportano la convinzione che la sopravvivenza della maggior parte, se non di tutte, le cellule dei vertebrati dipende
22 da uno o più dei guardiani Bcl-2-like. Questo è in accordo con il punto di vista che la morte è l'impostazione predefinita per la maggior parte delle cellule, a meno che esse non ricevano segnali positivi da altre cellule. Più probabilmente, i segnali paracrini trasmessi dai fattori di crescita e dai contatti cellula o cellula-matrice, promuovono la sopravvivenza della maggior parte delle tipologie di cellula attraverso l'up-regulation di vari membri anti-apoptotici della famiglia Bcl-2, oltre a limitare l'espressione e/o l'attività di particolari proteine BH3-only.
Bax/Bak.7
Studi condotti su topi privati di Bax o Bak, o di entrambi, hanno mostrano che le loro funzioni si sovrappongono ampiamente. Non è stata evidenziata nessuna anomalia nei topi bak-/-, ad eccezione di un leggero aumento delle piastrine e i topi bax-/- presentano solo una lieve iperplasia linfoide e sterilità maschile; quest'ultima perché una spermatogenesi appropriata richiede che l’eccesso di cellule germinali testicolari muoiano per avere il giusto rapporto tra cellule germinali e cellule di supporto. In netto contrasto, la maggior parte dei topi privi di Bax e Bak muoiono perinatalmente. Le anomalie di sviluppo includono la persistenza delle membrane interdigitali, e un aumento del numero di alcune popolazioni neuronali nel cervello. Un esiguo numero di topi bax-/-bak-/- rimane in vita per diverse settimane, e sviluppa una massiccia linfoadenopatia. I tessuti che presumibilmente sono stati forgiati dall’apoptosi appaiono istologicamente normali in questi animali, suggerendo che le loro cellule superflue possano essere state eliminate da Bok (Figura 3) o da processi di morte non apoptotici. Le cellule dei topi bax-/-bak-/- sono altamente resistenti agli stimoli citotossici che attivano il
23 pathway mitocondriale, ma, come previsto, i loro linfociti (cellule di tipo 1) restano sensibili alla morte indotta dal recettore di morte.
Proteine BH3-only.7
Gli stimoli di morte possono attivare molteplici proteine BH3-only, che possono anche variare in base al tipo di cellula. Tuttavia, l'analisi gene-targeted del topo ha rivelato che ciascuna proteina BH3-only svolge distinti ruoli fisiologici. Per esempio, Bim, uno degli elementi più importanti, è essenziale in molti tipi cellulari per l’apoptosi indotta dalla privazione del fattore di crescita e per la deplezione di timociti autoreattivi e di cellule B immature. Di conseguenza, i topi bim-/- sviluppano linfoadenopatia progressiva e, su un background misto C57BL/6x129SV, una malattia autoimmune simile alla Lupus eritematoso sistemico (SLE). Bim gioca un ruolo prevalente nella regolazione della morte cellulare indotta da stress del reticolo endoplasmatico (ER), mentre è meno importante per l'apoptosi indotta da danno del DNA, che è in gran parte guidata da p53.
I geni puma e noxa sono entrambi bersagli trascrizionali diretti del soppressore del tumore p53. I linfociti e alcuni altri tipi di cellule di topi puma -/-sono altamente resistenti alle radiazioni γ ed ai farmaci chemioterapici che inducono danni al DNA (ad esempio etoposide), dimostrando che Puma è il principale mediatore della risposta apoptotica mediata da p53 in quelle cellule. Puma regola anche l'apoptosi indotta da diversi insulti p53-indipendenti, come la delezione del fattore di crescita o il trattamento con glucocorticoidi o con gli esteri del forbolo. Stranamente, mentre la perdita di Noxa compromette solo
24 modestamente l'apoptosi indotta da radiazioni γ o da etoposide nei linfociti e nei fibroblasti, la stessa ha maggiore impatto rispetto alla perdita di Puma nell'apoptosi indotta da radiazioni UV nei fibroblasti e nei cheratinociti. Studi condotti su topi privi di Puma e Noxa, hanno dimostrato che questi geni sono responsabili di tutta l'attività pro-apoptotica indotta da p53 nei linfociti con DNA danneggiato, mettendo in discussione il significato fisiologico della risposta di p53 mitocondriale. Infatti, le mutazioni che ablano la funzione di attivazione della trascrizione di p53 in vivo annullano tutte le sue funzioni biologiche, inclusa la soppressione del tumore. Puma e Bim sembrano essere le più potenti proteine BH3-only in molti distretti, e la loro perdita concomitante rende molte cellule più refrattarie agli stimoli di morte cellulare rispetto alla perdita di uno solo dei due.
L'attivazione di Bid richiede la sua elaborazione da parte della caspasi-8 o di alcune altre proteasi (ad esempio caspasi-3, granzima B, Figura 2). Di conseguenza, Bid è essenziale per la morte indotta da FasL o TNF in alcuni tipi di cellule (cellule di tipo 2), inclusi gli epatociti e le cellule pancreatiche β, ma è ancora da dimostrare che Bid sia necessaria per le risposte al danno al DNA, per lo stress replicativo o per l’arresto del ciclo cellulare.
Sebbene alcuni studi su linee cellulari suggeriscono un coinvolgimento di Bmf nell’”anoikis” (apoptosi sul distacco delle cellule aderenti), le cellule endoteliali e i fibroblasti di topi bmf-/- si sono dimostrati normalmente sensibili a questo stress, probabilmente perché altre proteine BH3-only, in particolare Bim, collaborano con Bmf nell’anoikis. I linfociti Bmf deficitari sono tuttavia refrattari ai glucocorticoidi, e topi bmf-/- più vecchi accumulano cellule B in eccesso, dimostrando un ruolo di Bmf nell’omeostasi delle cellule B.
25 Le altre proteine BH3-only sembrano avere ruoli più limitati. Non appaiono anomalie in topi bik-/- o nelle loro cellule, ma i maschi privi sia di Bim
che di Bik non sono fertili a causa dell'apoptosi alterata delle cellule progenitrici immature, analogamente a quanto osservato nei maschi bax-/- (vedi sopra).
Sebbene Bad, come è riportato, sia regolato dai segnali del fattore di crescita, le cellule Bad-deficienti rimangono sensibili alla privazione di citochine e a diversi insulti citotossici. Il minor aumento delle piastrine in topi bad-/- probabilmente si riflette nel blocco ridotto del suo target Bcl-xL, il principale regolatore della sopravvivenza delle piastrine. Hrk è espresso a livelli molto alti (forse esclusivamente) nel cervello e per cellule neuronali hrk-/- in coltura è stata descritta solo un ritardo nel processo di morte.
Beclin-1: un collegamento apparente tra Bcl-2 e autofagia.7
La famiglia Bcl-2 può controllare non solo il processo apoptotico, ma anche l'autofagia, processo evolutivamente conservato per mantenere la sopravvivenza cellulare (ad es. quando i nutrienti sono limitati) per mezzo dell’auto-cannibalismo di componenti cellulari, compresi gli organelli. È stato riportato che Beclin-1, che è essenziale per l'inizio dell'autofagia, si lega ai membri anti-apoptotici della famiglia di proteine Bcl-2 attraverso un dominio BH3-like. L'associazione di Beclin-1 con Bcl-2, Bcl-xL o Mcl-1, secondo quanto riportato, blocca la sua capacità di attivare la chinasi PI3 Vps34 e innescare l’autofagia. Di conseguenza, una proteina BH3-only di affinità maggiore (come è la maggior parte), o un composto BH3 mimetico come ABT-737 (vedi sotto), può spiazzare Beclin-1 e consentire l'autofagia. Beclin-1 può anche essere spiazzato in
26 seguito a molti altri meccanismi, tra cui la mono-ubiquitinilazione, o la fosforilazione del suo dominio BH3. Stranamente, solo Bcl-2 sul ER e non sui mitocondri sembra bloccare l'induzione dell’autofagia. Questi risultati possono avere implicazioni per la cancerogenesi e per l’eventuale terapia (vedi sotto).
Il ruolo delle proteine della famiglia Bcl-2 nella cancerogenesi.7
La connessione di questa famiglia di proteine con il cancro è stata intuita per la prima volta quando si è scoperto che la sovraespressione di Bcl-2 previene la morte in vitro di cellule emopoietiche prive di citochine, e collabora con myc nell'immortalizzazione di cellule linfoidi, e nella linfomagenesi. Questa è stata la prima identificazione di un gene che regola la sopravvivenza cellulare e la prima evidenza che l'evasione dall'apoptosi contribuisce alla trasformazione neoplastica. Transgeni di Bcl-2 legati ad un enhancer genico Igh, imitando la translocazione t[14;18] umana, provocano tumori delle plasma cellule e leucemie linfocitiche ma non linfoma follicolare. Tuttavia, più recentemente, si è osservato che alti livelli di espressione di un transgene di Bcl-2 nel compartimento emopoietico provocano il linfoma follicolare, preceduto da un abbondante iperplasia germinale dipendente da cellule T CD4+, che si accumulano proprio a causa degli alti livelli di Bcl-2. Queste osservazioni indicano che la auto-traslocazione di Bcl-2 probabilmente è insufficiente a causare il linfoma follicolare umano e che la stimolazione cronica delle cellule T invece può contribuire. Inoltre, la lunga latenza dello sviluppo tumorale indica la necessità di ulteriori mutazioni oncogene.
27 nella trasformazione maligna. Infatti, i tumori che si sviluppano spontaneamente in topi bcl-2 transgenici mostrano spesso dei riarrangiamenti del gene myc, ed alcuni linfomi umani altamente aggressivi mostrano una traslocazione sia di myc (t8;14), che di bcl-2 [t14;18]. Alla base di questa sinergia c’è la sovraespressione di Myc, che non solo aumenta la proliferazione cellulare, ma in condizioni di stress (ad esempio la limitazione del fattore di crescita) promuove l'apoptosi. Bloccando l’apoptosi, Bcl-2 permette l’aumento dell’espansione del ciclo cellulare, col rischio di acquisire altre mutazioni.
Mcl-1 e Bcl-xL sono anch’essi pedine importanti nella cancerogenesi. La sovraespressione di Mcl-1 predispone i topi a diversi linfomi delle cellule B e, in particolare, a tumori emopoietici delle cellule staminali/progenitrici. Anche Bcl-xL e Mcl-1 sinergizzano con Myc nella linfomagenesi e nella plasmacitomagenesi, e tutti i membri pro-sopravvivenza della famiglia accelerano la leucemia mieloide indotta da Myc. Negli umani, l'espressione di Mcl-1 è sorprendentemente alta in molti casi di leucemia mieloide (AML), mieloma multiplo, e diversi tumori presentano una amplificazione dei geni Mcl-1 o Bcl-x.
Così come le proteine anti-apoptotiche promuovono la cancerogenesi, i membri della famiglia pro-apoptotica possono funzionare come soppressori del tumore. Quindi, la linfomagenesi indotta da Myc è accelerata dalla perdita di Bax, Bim, Puma e Bmf o Bad, perché quasi tutti contribuiscono all'apoptosi indotta da Myc. Myc attiva Puma attraverso una up-regulation di p53 dipendente da Arf,12 ma non è ancora chiaro come Myc riesca a regolare le altre proteine BH3-only. Anche la perdita di Bax accelera lo sviluppo del tumore al cervello in un modello transgenico, e la linfomagenesi del timo indotta da radiazioni γ viene intensificata
28 dalla perdita di Noxa, Bmf o entrambi Bim e Bad. Nei topi che deficitano sia di Bim che di Puma, i linfociti si accumulano maggiormente e alcuni sviluppano spontaneamente il linfoma. Comunque, i campioni mancanti di entrambi i principali target apoptotici di p53, puma e noxa, non sono inclini a sviluppare il tumore, probabilmente perché i target trascrizionali di p53 che mediano funzioni aggiuntive (ad es. arresto della crescita e senescenza), contribuiscono anche alla sua attività di soppressione del tumore.
E’ importante sottolineare che la perdita o la soppressione dei membri pro-apoptotici della famiglia Bcl-2 è stata rilevata anche nel cancro umano. Mutazioni di Bax appaiono in circa il 50% dei carcinomi del colon in pazienti con un difetto di riparazione del DNA, dovuto ad uno slittamento durante la replicazione nel gene umano Bax. Inoltre, il 17% dei linfomi a cellule mantellari mostra delezioni omozigoti di Bim, e i geni di Bok e Puma presentano delezioni alleliche in diversi tumori. In molti linfomi di Burkitt, Bim o Puma vengono epigeneticamente silenziati, spesso mediante ipermetilazione. In particolare, l'ipermetilazione di Bim correla con una minore remissione e una sopravvivenza più breve, e gli inibitori dell'istone-deacetilasi sono capaci di superare la chemioresistenza.
Anche i difetti nella trasmissione del segnale del recettore di morte Fas sono cancerogenici. Mutazioni in Fas o nei ligandi di Fas nei topi, o nei pazienti con sindrome linfoproliferativa autoimmune, non solo causano linfoadenopatia progressiva e malattie sistemiche autoimmuni, ma anche i soggetti che sopravvivono più a lungo sono predisposti al linfoma, a tumori delle plasmacellule e al sarcoma istiocitico. Anche alcune neoplasie umane non linfoidi mostrano mutazioni Fas, tra cui il 28% dei tumori della vescica.
29 Queste scoperte hanno portato alla luce l’ormai diffusa convinzione che l'evasione dall'apoptosi sia un segno distintivo del cancro. Tuttavia, dato che una percentuale relativamente piccola di patologie umane presenta anomalie che influenzano direttamente i geni delle proteine della famiglia Bcl-2 o del recettore di morte, la sopravvivenza delle cellule che hanno subito una trasformazione neoplastica più probabilmente dipende da pathways oncogenici a monte che alterano l'espressione dei membri della famiglia Bcl-2. Ad esempio, il database dell’espressione genica mostra livelli elevati di Bcl-2 nella maggior parte dei tumori linfoidi umani, inclusi non solo il linfoma follicolare (dovuta alla traslocazione t[14;18]), ma anche la leucemia linfocitica B-cronica (B-CLL) ed il mieloma multiplo. Da notare che, oltre la metà dei casi di B-CLL presentano delezioni o mutazioni in microRNAs (miR-15a, miR-16-1), che provocano down-regulation del mRNA di Bcl-2. Inoltre, in molti linfomi una attività deregolata di NF-kB può provocare up-regulation di A1 e Bcl-xL. Dal momento che la perdita anche di un solo allele Bim sostanzialmente accelera la linfomagenesi indotta da Myc, sarà importante esaminare i tumori umani alla ricerca di eventuali variazioni dei livelli dei regolatori che riducono la sua espressione almeno di due volte.
Le mutazioni a monte possono anche influenzare la stabilità e quindi l'attività dei membri della famiglia Bcl-2. In particolare, Mcl-1 è molto labile, ma il suo livello di espressione è elevato in diversi tumori a causa della perdita del soppressore del tumore FBW7, il componente legante il substrato di una E3 ubiquitina-ligasi, che può promuovere la degradazione di Mcl-1. Inoltre, in molti tumori linfoidi B, Mcl-1 è elevato a causa di una maggiore espressione della deubiquitinasi USP9X, che risparmia Mcl-1 dalla degradazione.
30 Forse, sebbene la sovraespressione di Bcl-2 promuova la linfomagenesi indotta da Myc e sia necessaria per una crescita sostenuta di tali linfomi, la perdita di Bcl-2 endogeno non pregiudica la linfomagenesi Myc-indotta. Presumibilmente, altri analoghi pro-sopravvivenza sostengono le cellule pre-leucemiche mentre esse stanno acquisendo le mutazioni che permettono loro la trasformazione e la progressione. Infatti, la perdita anche di un solo allele Mcl-1 protegge i topi dallo sviluppo di AML Myc-indotta. Identificare i membri pro-sopravvivenza della famiglia critici per lo sviluppo e la crescita sostenuta di diversi tipi di tumore dovrebbe fornire preziosi indizi per un intervento precoce e per migliorare il trattamento terapeutico della malattia (vedi sotto).
Nonostante l'evasione della morte cellulare contribuisca in modo significativo allo sviluppo del cancro, in determinate circostanze l’eccessiva morte cellulare in realtà può addirittura promuovere la cancerogenesi. In alcune razze di topo, l'irradiazione γ ripetuta a basse dosi causa il linfoma del timo, che origina da cellule staminali ematopoietiche derivanti dal midollo osseo che hanno subito mutazioni oncogeniche. La protezione dei leucociti differenziati dall’apoptosi indotta dalle radiazioni γ, dovuta alla perdita di Puma o alla sovraespressione di Bcl-2, impedisce la linfomagenesi ovviando la proliferazione compensativa di cellule ematopoietiche staminali/progenitrici mutate. Situazioni analoghe nelle malattie umane si ritrovano nel carcinoma epatocellulare di pazienti con cirrosi indotta da virus o alcolismo, che si sviluppa da cellule staminali o progenitrici, ripetutamente condotte attraverso cicli cellulari di morte e rigenerazione. Analogamente, la perdita di Mcl-1 nel fegato dei topi provoca apoptosi epatica sostenuta, rigenerazione e in ultima analisi il carcinoma. Inoltre, molti
31 sopravvissuti al tumore sviluppano nuovi tumori primari provocati dai cicli di radioterapia o chemioterapia, che provocano cicli di esaurimento delle cellule differenziate, che vengono continuamente rimpiazzate da cellule staminali/progenitrici, alcune delle quali hanno subito mutazioni oncogeniche.
Il ruolo cruciale delle proteine famiglia Bcl-2 nella terapia del cancro.7
È da tempo riconosciuto che la maggior parte dei tipi di cellule tumorali, quando esposte a terapie citotossiche, mostrano i segni distintivi dell’apoptosi, e che questo processo potrebbe essere critico per la risposta terapeutica. In effetti, nei topi la sovraespressione di Bcl-2, Bcl-xL o Mcl-1 protegge le cellule linfoidi e mieloidi dall’azione di molti agenti terapeutici (ad esempio radiazioni γ, glucocorticoidi, etoposide). Stabilito il ruolo essenziale del pathway regolato da Bcl-2, la combinazione con la perdita di Bax e Bak rende diversi tipi di cellule altamente resistenti a tali insulti citotossici, mentre una alterazione del pathway del recettore di morte non ha alcun impatto. Infatti, in diversi tipi di tumori umani, elevati livelli di Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 o A1/Bfl1 sono fortemente correlati con la chemioresistenza.13
Esperimenti su topi geneticamente modificati hanno rivelato che sono necessarie specifiche proteine BH3-only per iniziare l'apoptosi in risposta a diverse terapie antitumorali.14 Per gli agenti antitumorali che provocano un danno al DNA, il ruolo cruciale di p53 si esplica, in molti tipi di cellule, mediante i suoi target trascrizionali diretti puma e noxa, in verità Puma e, in misura minore, Noxa. L'apoptosi provocata dai glucocorticoidi, che vengono utilizzati per trattare alcune neoplasie linfoidi, richiede Bim, Puma e Bmf, e gli inibitori HDAC uccidono in
32 modo strettamente dipendente da Bim e Bmf. Anche la morte cellulare indotta da Taxolo è fortemente mediata da Bim.
Questi risultati ottenuti su cellule non trasformate, sono generalmente validi anche per linee cellulari derivate da tumori, anche se, sorprendentemente, è stato scoperto che l'efficiente uccisione dei tumori linfoidi B Myc-dipendenti non dipende solo da Puma e Noxa, ma anche da Bim. Poiché il danno al DNA delle cellule trasformate può innescare il pathway apoptotico regolato da Bcl-2 attraverso percorsi sia dipendenti che indipendenti da p53, Bim potrebbe essere coinvolto in quest'ultimo tipo, dato che sembra che p53 non lo regoli direttamente.
La scoperta che alcune proteine oncogeniche sono essenziali per la crescita di un tumore (“dipendenza oncogenica”) ha stimolato lo sviluppo di farmaci progettati per interagire con questi fattori chiave, che includono diverse chinasi oncogeniche. Come nella chemioterapia tradizionale, molti farmaci agiscono almeno in parte inducendo l'apoptosi. Così, la morte delle linee cellulari derivate da leucemia mielogena cronica (CML) trattate con Imatinib (Gleevec), che inibisce Bcr-Abl, la chinasi che causa questa malattia, sembra necessitare di Bim e, in misura minore, Bad. L'inattivazione di Bcr-Abl può attivare Bim in due modi: (i) per danneggiamento della via di segnale mediata da PI3K-Akt, consentendo così a FOXO3A di promuovere bim; (ii) impedendo la fosforilazione di Bim mediata da ERK, e quindi la sua ubiquitinilazione e degradazione proteosomiale.15 Ulteriori studi preclinici hanno dimostrato che Bim è fondamentale anche per la morte di linee cellulari derivate da tumori trattati con farmaci che agiscono su altre chinasi oncogeniche: recettori EGF nel cancro al polmone non a piccole cellule, il mutante B-Raf nel melanoma e nel cancro del
33 colon, e JAK2 nelle neoplasie mieloproliferative. Quindi, anche se i processi non apoptotici (ad esempio senescenza) possono contribuire a migliorare l'efficacia di queste terapie per il cancro, l'attivazione dell'apoptosi tramite le proteine BH3-only svolge un ruolo cruciale.
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Terapie innovative per il trattamento del cancro: sviluppo di small molecules quali inibitori delle proteine antiapoptotiche della famiglia Bcl-2.16
Come ampiamente descritto nell’Introduzione, l'apoptosi, o morte cellulare programmata, si manifesta attraverso due distinti pathways. Il percorso di apoptosi estrinseco è innescato da ligandi extracellulari che legano la superficie cellulare dei recettori della superfamiglia dei TNFR (recettori del fattore della necrosi tumorale). Il percorso di apoptosi intrinseco avviene invece esclusivamente all’interno della cellula, ed è regolato dalla famiglia delle proteine Bcl-2, che includono biomolecole pro-sopravvivenza e biomolecole pro-morte. Tutte le proteine Bcl-2 condividono uno o più di quattro domini omologhi (BH): BH1, BH2, BH3 e BH4.
Le proteine antiapoptotiche Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-W, Mcl-1 e A1/Bfl-1
possiedono tutte i domini BH da 1 a 4 e promuovono la sopravvivenza cellulare antagonizzando la funzione pro-morte delle proteine pro-apoptotiche, che possono essere suddivise nella famiglia dei domini BH3-only e in quella dei domini BH1-3.
I membri della famiglia BH3-only includono Bim, Bad, Bid, Puma e Noxa, mentre Bak e Bax sono membri della sottofamiglia BH1-3, e sono anche soprannominati “effettori pro-apoptotici”.
Le proteine anti-apoptotiche sequestrano e neutralizzano le proteine pro-apoptotiche legando i loro "domini di morte" BH3 α-elicoidali in specifiche tasche idrofobiche che legano BH3.
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Le basi molecolari per l'eterodimerizzazione tra proteine anti- e pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2 sono state inizialmente chiarite attraverso l'analisi NMR di un complesso tra Bcl-xL e un peptide corrispondente alla regione BH3 di Bak. Il peptide Bak si lega in una ansa idrofobica sulla superficie di
Bcl-xL formata dai domini BH1-3 e contemporaneamente si piega in una α-elica
anfipatica. Quattro residui idrofobici su una faccia di questa elica (Val74, Leu78, Ile81 e Ile85) proiettano le loro catene laterali in quattro sottotasche (p1-p4), situate nella tasca idrofobica di Bcl-xL, interagendo così con molteplici residui
idrofobici. La scansione della mutagenesi dell'alanina del peptide Bak ha
confermato l'importanza di questi residui nella formazione del complesso. Inoltre, sul fronte opposto, anche i residui carichi (Arg76, Asp83 e Asp84), contribuiscono alla stabilità del complesso; di questi, il più significativo è Asp83, in accordo con la sua vicinanza al residuo Arg139 di Bcl-xL.
Sono stati studiati tanti altri complessi eterodimerici Bcl-2 mediante analisi NMR e cristallografia a raggi X, rivelando che le α-eliche BH3 delle proteine pro-apoptotiche condividono una sequenza conservata di residui idrofobici nelle posizioni i, i+3/4, i+7, e i+11 lungo una faccia, così come un residuo di aspartato alla posizione i+5 sulla faccia opposta. Questi residui sono tutti fondamentali per la stabilità dei complessi eterodimerici con proteine anti-apoptotiche. Come caratterizzato per il complesso Bcl-xL-Bim-BH3 (Figura 6), questi residui idrofobici interagiscono con le sottotasche p1, p2, p3 e p4 della proteina anti-apoptotica, mentre l'aspartato lega un'arginina situata dall'altra parte dell’ansa. Una cosa importante è che le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 mostrano differenti profili di legame per le loro controparti pro-apoptotiche, in dipendenza
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della precisa morfologia delle tasche idrofobiche. Ad esempio, tutte le proteine anti-apoptotiche possono legare Bax, ma solo Bcl-xL e Mcl-1 possono legare Bak. Allo stesso modo, c'è differenza tra le proteine BH3: Bim, Bid e Puma possono legare tutte le proteine anti-apoptotiche, mentre Bad si lega solo a Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-W, e Noxa lega solo Mcl-1 e A1.
Figura 6. Una rappresentazione del complesso Bcl-xL−Bim-BH3 (PDB code 4QVF) con le sottotasche chiave e gli amminoacidi in rilievo. Le sigle in grassetto fanno riferimento a Bcl-xL, e quelle in corsivo si riferiscono all'α-elica di Bim-BH3. A sinistra: Superficie di Connolly, colorata per tipo di atomo (grigio=carbonio (Bcl-xL), verde=carbonio (Bim); rosso=ossigeno; blu=azoto; giallo=zolfo). A destra: rappresentazione priva di superfici della struttura di sinistra.
Inoltre, alcune proteine BH3-only, tra cui Bim e Bid, possono attivare direttamente Bak e Bax; il rilascio di Bak e Bax permette la loro oligomerizzazione, che determina la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna, attivando una cascata di demolizione: in primo luogo, viene rilasciato il citocromo c, che lega e attiva APAF1, il quale porta alla formazione di apoptosomi, che attivano la caspasi-9, e quindi la morte della cellula.
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Come precedentemente specificato, un segno distintivo del cancro è l'evasione dall'apoptosi, attribuita principalmente all’assenza del processo apoptotico mitocondriale, ed è spesso un fattore che contribuisce alla resistenza alla chemioterapia esistente. In particolare, attraverso la neutralizzazione di Bak e Bax, la sovraespressione delle proteine anti-apoptotiche Bcl-2 è associata allo sviluppo e alla progressione della patologia in una vasta gamma di tumori umani, compreso il cancro al pancreas e la leucemia mieloide acuta.
In questa ottica, sono state sviluppate piccole molecole, α-elica-mimetici di sintesi e peptidi “stapled”, in grado di mimare il dominio BH3 delle proteine pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2, per antagonizzare le proteine anti-apoptotiche, permettere il rilascio di Bak e Bax, e indurre così l'apoptosi.
In questa tesi, ci concentreremo su inibitori non peptidici sintetici delle proteine anti-apoptotiche Bcl-2, illustrando le loro modalità di legame, selettività ed attività in vivo nell’ottica dello sviluppo di una nuova potenziale terapia del cancro.
Inibitori duali BCL-XL/BCL-2: ABT-737 e ABT-263 (NAVITOCLAX).
ABT-737 (1, figura 7),17 sviluppato dai Laboratori Abbott nel 2005, è il
BH3 mimetico prototipo: è stato scoperto legando chimicamente frammenti in grado di legare Bcl-xL, identificati mediante uno screening NMR seguito da una progettazione structure-based.
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Figura 7. Struttura degli inibitori duali Bcl-xL/Bcl-2 1 e 2.
Supportata da dati strutturali emersi da uno studio NMR in soluzione, la struttura cristallina di 1 legato a Bcl-xL ha rivelato che l'anello fenilico si lega nella tasca p4, mentre il 4-clorobifenile si lega nella tasca p2, aprendola notevolmente di più rispetto a quanto avviene in seguito al legame dei ligandi BH3 (Figura 8, PDB).
Sebbene la funzione acilsolfonammidica sia stata progettata quale bioisostero della catena laterale dell'acido aspartico dei peptidi BH3, oltre a servire come punto di collegamento di due frammenti, la struttura cocristallina ha rivelato che essa interagisce mediante un legame a idrogeno con l'ammide della Gly138, anziché formare un ponte salino con il residuo Arg139v (Figura 7).
ABT-737 1 inibisce fortemente Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w (tutti con valori di
Ki < 1 nM), ma non riesce a legare Mcl-1 e A1 (entrambi con valori di Ki > 20
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tasche p2 sulle superfici di Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w e Mcl-1, e ad un diverso folding posteriore della proteina formato dall'elica α-3 sul lato della tasca p2 di Mcl-1.
Figura 8. Struttura cocristallina di 1 (colorata per tipo atomo: verde=carbonio, blu=azoto, rosso=ossigeno, giallo=zolfo, marrone=cloro) legato a Bcl-xL (PDB code 2YXJ). Sinistra: superficie di Connolly, colorata per tipo atomo (grigio=carbonio (Bcl-xL), verde=carbonio (1), rosso=ossigeno, blu=azoto; giallo=zolfo). A destra: rappresentazione senza le superfici della struttura di sinistra.
ABT-263 (2, Figura 7) o Navitoclax, è un analogo, biodisponibile per via orale, di ABT-737 1 che ha fornito dati interessanti nelle fasi di sperimentazione clinica I e II su vari tipi di tumori, inclusi la leucemia linfocitica cronica (CLL) ed il cancro polmonare a piccole cellule.
Il composto 2, come il composto 1, non si lega a Mcl-1; quindi, gli effetti antitumorali si osservano solo quando Mcl-1 è assente o debolmente espresso. Purtroppo, l’interesse suscitato da Navitoclax (2) è andato diminuendo a causa dell’insorgenza nei pazienti di una trombocitopenia transitoria, dose-limitante, che
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si verifica come conseguenza dell'inibizione di Bcl-xL nelle piastrine adulte e che porta alla loro morte. Nonostante questa tossicità, questa molecola (2) continua a svolgere un ruolo preponderante negli studi clinici, quando la trombocitopenia è mitigata, come terapia adiuvante.
INIBITORI PAN-BCL-2: GOSSIPOLO E DERIVATI.
Il Gossipolo (3, Figura 9),18,19 è un'aldeide polifenolica naturale, che è già
stata utilizzata in clinica per vari scopi terapeutici, inclusi quello contraccettivo orale maschile ed antimalarico. Prima di questo secolo, non si sapeva che il gossipolo funzionasse anche da mimetico di pan-BH, grazie all'isomero conformazionale R-(-) (AT-101) (4, Figura 9), che inibisce Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1
con valori di Ki rispettivamente di 320, 480, e 180 nM. Sulla base della struttura
del gossipolo, Wang e colleghi20,21 hanno sviluppato il composto TW-37 (5,
Figura 9), mediante un approccio di progettazione structure-based, che ha visto una semplificazione della molecola dal punto di vista chimico-sintetico e la eliminazione dei gruppi aldeidici tossici. TW-37 è simile ad un pan-BH3
mimetico, con valori di Ki per Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 rispettivamente di 290 nM,
1.11 μM e 260 nM, ed ha raggiunto studi clinici di fase I e II. Due degli ossidrili della funzione pirogallica di 5 erano stati previsti per instaurare legame a idrogeno con Asn143 e Arg146, analoghi di Gln102 e Asp99 del peptide Bim-BH3.
L’Apagossipolone (apoG2) (6, Figura 9), un altro derivato del gossipolo sempre privo dei due gruppi aldeidici, è capace di indurre apoptosi nelle cellule CLL primarie. Il Sabutoclax BI-97C1 (7, Figura 9), un derivato di apogossipolo, sembra legare le proteine Bcl-2 con maggior affinità rispetto agli altri derivati del
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gossipolo riportati. Ad ogni modo, tutti i derivati del gossipolo qui descritti mostrano diversi effetti secondari, che possono essere imputabili alle loro funzioni catecoliche, le quali possono condurre alla formazione di specie reattive dell'ossigeno, e come tali non sono autentici BH3 mimetici.
Figure 9. Gossipolo e derivati, inibitori di pan-Bcl-2.
(-)-BI-97D6 (8, Figura 9), l'isomero strutturale (-) di un derivato dell'apogossipolone (6), in cui i due gruppi isopropilici sono sostituiti da benzili, è in grado di distruggere il legame di Bcl-xL, Bcl-2, Mcl-1 e A-1 ad un peptide
fluorescente-marcato di Bak-BH3 con valori di IC50 rispettivamente di 76, 31, 25
e 122 nM. Il composto 8 inibisce la crescita cellulare delle cellule umane PC-3 di tumore alla prostata e delle cellule umane H23 di cancro polmonare a concentrazioni nel range del submicromolare, e mostra anche una limitata citotossicità nelle cellule in cui Bax/Bak sono assenti, indicando che il derivato
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uccide le cellule principalmente in presenza dei due suddetti domini. Inoltre, (-)-BI-97D6 (8) ha dimostrato efficacia in vivo in modelli xenograft di cancro alla prostata e in campioni di Bcl-2 di topi transgenici.
INIBITORI PAN BCL-2: OBATOCLAX.
Sebbene l'obatoclax (9, Figura 10)22 della GeminX Pharmaceutical
(GX15-070) può essere definito un pan-BH3 mimetico, esso si lega alle proteine Bcl-2 solo a concentrazione micromolare, nella stessa misura in cui ATB-737 (1) si lega a Mcl-1. Obatoclax uccide in modo efficiente sia le cellule wild-type, che le cellule Bax/Bak deficienti, attraverso una combinazione di effetti on- ed
off-target. In realtà, è stato suggerito che otobatoclax causi la morte cellulare
inducendo swelling mitocondriale e danni analoghi, piuttosto che agire specificatamente sulle proteine Bcl-2. Oltre a funzionare come un BH3 mimetico, 9 può attivare direttamente Bax in cellule di colangiocarcinoma, ed è in grado di superare la resistenza delle cellule maligne a ABT-737 (1), che come accennato in precedenza, non può legare Mcl-1. Questo è stato attribuito non tanto all’inibizione di Mcl-1 da parte di 9 ma, piuttosto, al fatto che questo induca
up-regulation di Noxa e conseguentemente la dissociazione di Mcl-1 da Bak.
Tuttavia, malgrado queste limitazioni che impediscono a questa molecola di essere un reale BH3 mimetico, 9 è entrato in diversi studi clinici per molti tipi di tumore.
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Figure 10. Un inibitore pan-Bcl-2.
INIBITORI DUALI di BCL-2/MCL-1: S1 E DERIVATI.
Song e colleghi,23,24 mediante screening su un’ampia libreria di composti,
hanno scoperto che il composto S1 (10, Figura 11), si lega a concentrazioni nel
range del nanomolare sia a Bcl-2 che a Mcl-1 (Kd 310 nM (Bcl-2), 58 nM (Mcl-1)), distruggendo le loro interazioni rispettivamente con Bax e Bak, causa l'apoptosi Bax/Bak-dipendente ed ha dimostrato efficacia in un modello animale. Successivamente, è stato appurato che questa molecola attiva le proteine BH3-only Noxa e Bim, che a loro volta spiazzano Bak dai complessi con Mcl-1, e quindi sembra che questo possa essere l'effettivo meccanismo con cui S1 uccide le cellule dipendenti da Mcl-1. Probabilmente potrebbe essere così anche per molti BH3 mimetici, poiché anche Beclin-1 si lega nella tasca di legame di BH3; S1 (10) impedisce l'interazione tra Bcl-2 e Beclin-1, portando aa autofagia della cellula oltre che ad apoptosi intrinseca.
Derivati di seconda generazione di S1 sono risultati pan-BH3 mimetici più potenti, come ad esempio il composto 11 (Figura 11) che inibisce Bcl-2, Bcl-xL, e
Mcl-1 con valori di IC50 rispettivamente di 20, 18 e 10 nM. Era stato ipotizzato
