INTRODUZIONE GENE

Cofattore della proteina

Localizzazione nel genoma Nome Sistematico (accessione) ADH1 NADH ChrXV (da 160594 a 159548) YOL086C

ADH2 NAD+ ChrXIII (da 874336 a 873290) YMR303C

ADH3 NADH ChrXIII (da 434787 a 435914) YMR083W

ADH4 NADH ChrVII (da 14910 a 16307) YGL256W

ADH5 NADH ChrII (da 533756 a 534811) YBR145W

ADH6 NADPH ChrXIII (da 912141 a 911059) YMR318C

ADH7 NADPH ChrIII (da 309067 a 310152) YCR105W

SFA1 NADH ChrIV (da 159605 a 160765) YDL168W Tabella. 1 I geni ADHs

1.3 I Mutanti ADHs

L’ alcol allilico (AA) o alcol etilenico è un composto di formula HO–CH2–

CH=CH2, con massa molecolare pari a 58,08 g/mol e una densità di 0,854

g/ml, che si presenta come un liquido incolore e solubile in acqua, caratterizzato da un odore pungente.

I suoi effetti inibitori sono stati ampiamente studiati nei batteri

Escherichia coli e Lactobacillus casei (Rees et al. 1993). Nei lieviti Candida albicans, Candida utilis, Pichia pastoris e S. cerevisiae produce lesione alla

membrana citoplasmatica, ai vari organelli cellulari e all’organizzazione del citoscheletro (Lemar et al. 2005.).

Studi condotti su topo (Serafini-Cessi, 1972) hanno messo in evidenza che in vivo l’alcol allilico è metabolizzato attraverso due differenti vie ossidative: una che porta alla formazione di acrolenia e l’altra che genera la formazione di epossidi come il glicidolo e successivamente il glicerolo (Patel

et al 1980).

La trasformazione dell’alcol allilico in acroleina avviene in presenza di NAD+ ed è uno step biochimico mediato dagli enzimi alcol deidrogenasi (ADHs). L’acroleina, acrilaldeide o 2-propenale è il più piccolo membro della serie delle aldeidi etileniche o olefiniche, ed è un composto con massa molecolare di 56,06 g/mol. La sua formula chimica è la seguente:

La tossicità dell’acroleina dipende dalla sua struttura chimica: la presenza dell’atomo di ossigeno causa la polarizzazione della molecola e rende quest’ultima in grado di reagire con reagenti nucleofilici e altri enzimi che presentano gruppi sulfidrilici o tiolici come centri di reazione, ad esempio le ADHs (Izard 1967).

In C. albicans, è stato osservato che trattamenti con alcol allilico 10mM generano la destabilizzazione nella superficie della parete cellulare bloccando la formazione delle pseudo-ife (Lemar et al. 2005).

Per quanto riguarda S. cerevisiae l’acroleina modifica le cinetiche cellulari, il bilancio redox e la mobilità elettroforetica delle proteine, attiva i meccanismi di degradazione delle riserve intracellulari di glutadione, causa l’ ossidazione dei lipidi destabilizzando le membrane cellulari e riduce l'attività delle ADHs (Wills e Phelps 1978).

Cellule in grado di sopravvivere in terreni contenenti alcol allilico, sono quelle che non lo trasformano in acroleina. Diversi mutanti resistenti all’alcol allilico sono stati isoltai e caratterizzati; la maggior parte delle mutazioni riguarda i geni ADH. Le mutazioni determinano nella proteina la sostituzione

di uno o più residui amminoacidici nella sequenza proteica, la modificazione nelle caratteristiche elettroforetiche (Hall e Wills 1987), una diversa affinità per il substrato, una diversa affinità per il NAD+ , mutazioni che riguardano il promotore e i fattori di trascrizione che regolano l’espressione genica.

I mutanti, che crescono sia in mezzi di coltura contenenti glucosio, glicerolo o etanolo, presentano un incremento nela quantità di NADH e NAD+ nel citoplasma (Wills 1976) e a partire dall’alcol allilico attivano la formazione di altri alcoli con la conseguente diminuzione della produzione di acroleina (Wills and Phelps 1978).

Mutanti resistenti all’alcol allilico possono essere utlizzati come modello per investigare i meccanismi metabolici di vari microorgansimi e per condurre analisi genetiche di popolazione al fine di identificare fenomeni di microevoluzione molecolare in maniera analoga a quanto osservato per il sistema della β-galattosidasi di E.coli (Hall 1984). Sono stati isolati: mutanti per le ADHs utilizzando un mezzo di coltura contenente 1 mM di alcol allilico (AA) e YPD con 1% di glucosio che su gel di poliacrilamide presentano solo la banda Adh2 (mutanti adc) (Wills 1976); mutanti che non producono Adh2 (mutanti adr). Sono ottenuti in YPG 4% di glicerolo e 5mM di alcol allilico. Essi presentano esclusivamente attività per Adh1 e Adh3 e un decremento nella produzione di NAD+; mutanti non producono Adh3 (mutanti adm) ottenuti utilizzando terreno di coltura YPG con glicerolo al 4% e 50mM di alcol allilico. Studi recenti hanno messo in evidenza che anche nei mitocondri vi sono siti di riconoscimento per l’alcol allilico (Lemar et 2005). Mutanti petite di lievito sono in grado di sopravvivere in terreni contenenti fino a 60mM di alcol allilico; essi presentano un cilo vitale più lungo (Mazzoni et al. 2006).

Wills (1976) ha osservato che nei ceppi mutanti cambia la risposta all’ambiente spostando l’equilibrio tra alcol allilico e acroleina nella direzione dell’alcol allilico, cambiando così il bilancio NADH/NAD+ (Wills 1976).

Tra i numerosi casi di studio su mutanti resistenti ad alcol allilico si ricordano i lavori di:

1. Hall e Wills (1986). Utilizzando il ceppo di S. cerevisiae SC 288C hanno selezionato su alcol allilico i mutanti:

• LTR (low temperature resistant mutants) che presentano una temperature ottimale di crescita di 19°C.;

• HTR (high temperature resistant mutants) che presentano una temperatura ottimale di crescita di 37°C.

Questi mutanti sono diversi dagli altri casi di ceppi sensibili alla temperatura perché non presentano una disfunzione enzimatica o una denaturazione dell’enzima ma si ha un vero e proprio cambiamento chimico come risposta al cambiamento ambientale. La resistenza all’alcol allilico è strettamente correlata con la quantità di NADH e NAD+ presente nel citoplasma cellulare e l’attività di Adh1 si modifica in base alle modificazioni nel substrato di crescita; nei ceppi mutanti l’aggiunta di etanolo riduce gli effetti deleteri dell’alcol allilico reprimendo la crescita di colonie mutanti per ADH1 mentre l’acetaldeide incrementa la suscettibilità del lievito all’alcol allilico in quanto stimola la produzione di etanolo e NAD+ ad opera di ADH1 (Hall and Wills 1986);

2. Megnet nel 1967 ha condotto studi su Schizosacchaormyces plombe resistente ad AA. Egli ha osservato che l’alcol allilico non inibisce la crescita delle cellule wild type ma le inattiva in tempi diversi a seconda della loro sensibilità a questo particolare substrato. Differentamente da quanto osservato in S. cerevisiae, in S. plombe non si osservano differenze nei profili proteici e nell’attività di ADHs tra wild type e mutanti (Megnet 1967). Ciò che risulta modifcato sono le Km di ADHs per etanolo e il NAD+ _{con il conseguente accumulo di acetaldeide,}

glicerolo e NADH nel mezzo di coltura. A differenza dei WT i ceppi mutanti però non riescono a utilizzare il glicerolo come fonte di carbonio a causa della bassa contrazione di NAD+ cellulare.

3. Mazzoni et al. (2005) hanno individuato in Kluyveromyces lactis cresciuto in presenza di AA ed etanolo una mutazione, detta aar900,

che rende inattivo ADH4 stimolando l’espressione di ADH3. Le colonie mutanti mostrano un incremento della resistenza ai cationi monovalenti quindi questa mutazione coinvolge anche geni diversi oltre alle ADHs (Mazzoni et al. 2005);

4. Dmytruk et al. hanno osservato che i ceppi di Hanesula polymorpha su metanolo che sono anche resistenti all’alcol allilico (Dmytruk et al. 2007). Questi ceppi presentano un decremento dell’attività dell’alcol ossidasica (AOX). Questi mutanti sono utilizzati per gli studi di applicabilità di enzimi modificati nello sviluppo di biosensori.