Introduzione 1 L’ocratossina A

Le ocratossine sono delle micotossine prodotte da numerose specie appartenenti ai generi Aspergillus e Penicillium. Sono dei metaboliti secondari e quindi non hanno un ruolo evidente nella crescita dell’organismo produttore [1].

Le ocratossine sono dei pentachetidi, derivanti dall’isocumarina legati a L-fenilalanina, in cui la variante più diffusa e più tossica è l’ocratossina A, sebbene esista anche l’analogo declorurato, l’ocratossina B, e i rispettivi esteri metilenici ed etilenici (figura 11.1). N H O O O Cl COOH OH N H O O O COOH OH N H O O O Cl OH EtO O Ocratossina B

OTB Ocratossina C_OTC

Ocratossina A

OTA

Figura 11.1. Strutture chimiche delle più comuni ocratossine.

L’ocratossina A risulta molto più tossica dell’ocratossina B e viene formata rapidamente

in vivo dall’ocratossina C per idrolisi del gruppo etilenico.

È un composto cristallino incolore, solubile nei solventi organici polari, debolmente solubile in acqua e solubile in una soluzione acquosa di bicarbonato [2]. L'ocratossina A è un acido debole contenente un gruppo carbossilico con pKa di 4.4 e un gruppo

idrossilico con pKa 7.3 [3].

L'ocratossina A è un composto piuttosto stabile, resistente al calore e in soluzione alcolica può essere conservato a - 18°C senza perdite anche per anni, purchè venga

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mantenuta al buio. La tossina è stabile in condizioni acide purchè il pH non sia inferiore a 1, condizione in cui avviene l'idrolisi acida del legame ammidico [4].

Una grande varietà di prodotti alimentari tra i quali cereali, frutta, caffé, birra e vino possono venir contaminati dall’OTA. Nel caso in cui tali alimenti vengano utilizzati come mangimi, l'ocratossina A può andare a contaminare il sangue, i reni e il fegato di maiali e pollame anche se risulta scarso l'accumulo nei tessuti muscolari e adiposi e nelle uova. Tali alimenti possono rappresentare anche un potenziale pericolo per la salute umana [1].

Questa sostanza viene considerata una potente nefrotossina ed epatotossina con proprietà teratogene, mutageniche, cancerogeniche e immunosoppressive anche a livello di tracce. L’Organizzazione Mondale della Sanità (WHO) ha imposto un livello di tollerabilità giornaliero per l’OTA di 14 ng per kg di peso corporeo [5].

La regolamentazione europea fissa un livello massimo di ocratossina A compreso tra 3 e 10 ppb a seconda dei diversi prodotti alimentarie e ne abbassa il limite (0.5 ppb) per gli alimenti destinati a neonati.

Nel 1993, l’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha classificato l’ocratossina A come possibile cancerogena per l’uomo (gruppo 2B) [6].

L’esposizione umana per consumo di prodotti alimentari contaminati porta a livelli rivelabili nei fluidi umani, nel sangue e nei tessuti [7]. Nell’uomo il metabolismo è piuttosto lento con un’emivita di più di 30 giorni, a causa di un riassorbimento da parte del circolo entero-epatico, dal riassorbimento dalle urine dopo la secrezione tubulare e anche dal forte legame alle proteine plasmatiche [8].

11.1.2 I metodi di analisi: stato dell’arte

La cromatografia liquida ad elevate prestazioni accoppiata ad un rivelatore fluorimetrico è la tecnica analitica più utilizzata per l’analisi delle ocratossine e dei loro metaboliti grazie alle caratteristiche fluorimetriche insite nelle molecole. La tecnica offre la miglior selettività e sensibilità rispetto ad altri detector.

Valenta [9] riporta un'interessante review dove vengono schematizzati i più rilevanti metodi sviluppati per la determinazione dell'ocratossina A mediante tecniche di cromatografia liquida. Il metodo cromatografico più utilizzato è la separazione su colonna C18 mentre le fasi mobili devono essere acidificate per evitare pesanti fenomeni di tailing o adsorbimenti non specifici nella colonna a causa delle

caratteristiche acide della tossina. Le fasi mobili più comuni sono metanolo e acetonitrile con acido acetico o fosforico diluiti. La miscela acqua-acetonitrile presenta una minor viscosità rispetto a quella acqua-metanolo offrendo una miglior separazione. La rivelazione mediante detector a flurescenza viene condotta impostando un λexc = 330

nm e una λem = 460 nm. I limiti di rilevabilità di questo metodo variano a seconda del

metodo cromatografico utilizzato tra 0.005 e 4 ng mL-1 [9].

La cromatografia a coppia ionica viene usata nei metodi di Breitholtz-Emanuelsson et al. [10-12] per la determinazione della tossina nel sangue umano e nel latte bovino. La tecnica era stata precedentemente utilizzata per la determinazione dell'ocratossina A nel caffè [13] aggiungendo il contro-ione alla fase mobile.

L'uso del sistema LC-MS per la determinazione dell'ocratossina A è stata proposta per la prima volta da Abramson [14] e da Rajakyla et al. [15], utilizzando rispettivamente l'introduzione diretta del liquido e la thermospray come sistema di interfacciamento. Tuttavia tali metodi presentavano notevoli svantaggi in termini di robustezza, sensibilità ed erano piuttosto complessi da applicare.

Il primo lavoro che utilizza una strumentazione moderna può essere attribuito a Becker et al. [16], in cui è stato usato un sistema HPLC-ESI-MS/MS per la quantificazione dell'ocratossina A nel caffè, nella birra e nel grano. La molecola di ocratossina A viene analizzata in modalità positiva, in cui lo ione molecolare protonato ad m/z 404 viene frammentato portando ai frammenti ad m/z 386, 358 e 239 rispettivamente relativi alla perdita di acqua, di acqua e monossido di carbonio e della fenilalanina. L'analisi mediante acquisizione selected reaction monitoring viene condotta in modalità positiva in quanto la ionizzazione negativa porta allo ione deprotonato ad m/z 402 che frammenta portando al solo ione non specifico ad m/z 358 corrispondente alla perdita di acqua. È stato ottenuto un limite di rilevabilità di 20 pg, valore comparabile a quanto ottenuto con una rivelazione fluorimetrica.

Lau et al. [17] riportano un confronto tra l'interfacciamento mediante sorgente ESI e l'APCI sottolineando come l'ESI dimostri una maggiore sensibilità ionizzando positivamente l'analita.

Mentre con la rivelazione fluorimetrica la retta di calibrazione esterna risulta il metodo di quantificazione più usato, con la spettrometria di massa vi sono numerosi metodi nei quali viene usata la diluizione isotopica ottenendo quantificazioni più accurate [18].

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