Determinazione di microcistine e nodularina nei mitil
5.3 Risultati e discussione 1 Validazione del metodo
A causa della mancanza di un materiale di riferimento certificato per la quantificazione delle microcistine nei mitili, la valutazione dell’esattezza, delle rese di estrazione, della ripetibilità e dell’effetto matrice è stata condotta utilizzando una matrice esente dagli analiti alla quale sono state aggiunte delle quantità note di una soluzione contenente le cianotossine (50 ng assoluti) e di una contenente lo standard interno ENK (200 ng assoluti).
È stata valutata la linearità della risposta strumentale utilizzando delle soluzioni contenenti le cianotossine (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 pg µL-1) e lo standard interno (2 pg µL-1) diluiti nella matrice ottenuta come descritto in §5.2.3.
Le soluzioni così ottenute sono state iniettate ripetutamente (n=3) al fine di valutare come la precisione strumentale venga influenzata dalla matrice. In tabella 5.1 vengono riportati i parametri relativi alle curve di calibrazione ottenute in matrice e quelli della precisione strumentale.
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Tabella 5.1. Parametri delle curve di calibrazione (m indica la pendenza e q l'intercetta) e della precisione
strumentale a quattro livelli di concentrazione
m q R2 CV% 0.01 pg µL-1 CV% 0.1 pg µL-1 CV% 1 pg µL-1 CV% 10 pg µL-1 MC LA 0.4042 - 0.0182 0.9896 1 7 3 6 MC LY 0.1433 - 0.0103 0.9969 6 8 4 3 MC YR 0.1131 - 0.0048 0.9894 2 1 4 4 NOD 0.1825 - 0.008 0.9937 6 3 8 3 MC LR 0.1437 - 0.0081 0.9938 3 6 3 2 MC LW 0.9587 - 0.1122 0.9875 8 9 6 7 MC LF 0.5987 - 0.0482 0.9963 3 5 3 4 MC RR 0.7297 - 0.0363 0.9918 3 6 1 4
I valori del coefficiente di variazione percentuale (CV%) relativi al rapporto tra l’area del picco delle cianotossine e quella del picco dell’ENK risultano sempre inferiore al 10% (tabella 5.1), dimostrando come la matrice non incida sulla precisione strumentale. Karlsoon et al. [11] hanno condotto degli studi simili sullo sviluppo di un metodo per la determinazione delle cianotossine in tessuti animali e hanno evidenziato come l’analisi ripetuta di matrici estratte in una soluzione 75% metanolo non purificate portasse a delle deviazioni standard percentuali piuttosto elevate, sottolineando la necessità di introdurre una procedura SPE.
Il presente studio dimostra come l’uso di una piccola quantità di matrice (20 mg) diluita in 20 mL di metanolo e quindi ridiluita con acqua alla fine della procedura ha permesso di ridurre l’effetto matrice. Questo è stato possibile grazie all’utilizzo di un metodo strumentale estremamente sensibile descritto nel § 2.2 e all’uso di una SFR preparata in matrice.
L’effetto matrice che si verifica a seguito dell’analisi della matrice ottenuta mediante la procedura descritta nel § 5.2.3 è stato valutato come descritto da Matuszewski et al. [12]. In figura 5.1 si può notare come una quantificazione condotta mediante una curva di calibrazione preparata in acqua ultrapura porterebbe a una sottostima della concentrazione di ogni singola cianotossina ad eccezione della microcistina LW per la quale vi è un innalzamento del segnale. Questi risultati evidenziano come l’uso del metodo di quantificazione matrix-matched calibration è fondamentale per garantire un’affidabilità ai risultati. Lo standard interno pur eliminando problemi derivanti da errori casuali non riesce ad eliminare gli effetti matrice. Al fine di garantire un metodo accurato in cui l’effetto matrice venga minimizzato, la quantificazione è stata condotta usando uno standard interno preparato in matrice.
L’efficienza di estrazione viene calcolata dal rapporto tra il valore di concentrazione vero in matrice, ottenuto aggiungendo la soluzione standard dopo il processo di estrazione, e il valore ottenuto dopo l’estrazione. Come si può notare dalla figura 5.1 i valori risultano prossimi al 100%, indicando come l’uso di questa SFR risulti ideale ai fini della quantificazione.
0 50 100 150 200 250 % ME% 20 37 51 59 24 28 180 55 RE% 93 81 90 97 78 74 87 90 PE% 19 30 46 58 19 21 156 49 LA LY YR NOD LR LF LW RR
Figura 5.1. Valutazione dell’effetto matrice (ME%), dell’efficienza di recupero (RE%) e dell’efficienza
del processo (PE%) percentuali relativi all’area delle cianotossine in campioni di mitili processati come descritto in § 5.2.3
La valutazione dell’esattezza della procedura di quantificazione con lo standard interno ENK è stata fatta mediante la stima dell’errore percentuale medio, calcolato come la differenza tra il valore ottenuto e quello realmente aggiunto alla matrice. Alla matrice processata come descritto in § 5.2.3 sono stati aggiunti 50 ng assoluti di una soluzione contenente tutte le cianotossine investigate e 200 ng assoluti delle soluzione dello standard interno ENK.
La soluzione dello standard interno invece è stata aggiunta alla fine del processo di filtrazione al fine di valutare la resa del processo preparativo. Le prove di esattezza e di resa riportate in tabella 5.2 sono state ripetute in triplo al fine di valutare la ripetibilità del metodo.
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Tabella 5.2. Valutazione delle performance del metodo mediante stima dell’errore percentuale, resa e
ripetibilità.
LA LY YR NOD LR LW LF RR
Errore medio % 4 8 -2 8 9 9 9 9
Resa media % 108 ± 9 107 ± 10 90 ± 3 101 ± 9 87 ± 7 101 ± 7 110 ± 10 100 ± 7
CV% 9 9 3 9 8 7 9 7
La procedura ideata permette di ottenere una quantificazione con il metodo dello standard interno accurata con errori medi percentuali sempre inferiori al ±10% e la resa del processo risulta prossima al 100%. Questo è stato possibile grazie all’utilizzo di un opportuno solvente estraente posto in largo eccesso rispetto la matrice e alla ripetizione in doppio della procedura estrattiva.
La procedura preparativa risulta ripetibile come evidenziato dai coefficienti di variazione percentuale ottenuto dai replicati delle rese di processo.
I limiti di rilevabilità (MDL) e di quantificazione (MQL) procedurali sono stati valutati analizzando una matrice priva di cianotossine al quale è stata aggiunta una quantità nota (200 ng ass) di standard interno ENK. I valori di MDL e MQL sono calcolati rispettivamente come tre e dieci volte la deviazione standard del bianco procedurale, i cui valori sono riportati in tabella 5.3.
LA LY YR NOD LR LW LF RR Bianco (ng ass) 0.50±0.01 0.56±0.01 3.44±0.01 3.38±0.01 0.59±0.02 0.05±0.01 0.89±0.01 0.30±0.02 MDL (ng ass) 0.04 0.04 0.02 0.03 0.05 0.04 0.02 0.05 MDL (ng/g) 2.21 1.97 1.04 1.72 2.34 2.24 0.99 2.45 MQL (ng ass) 0.15 0.13 0.07 0.11 0.16 0.15 0.07 0.16 MQL (ng/g) 7.35 6.57 3.47 5.75 7.80 7.46 3.31 8.16
I limiti di rilevabilità risultano piuttosto bassi e permettono la quantificazione delle cianotossine a livelli di ng/g, nonostante non venga effettuata nessuna operazione di concentrazione e anzi una diluizione 1 a 5 sia necessaria per diminuire il contenuto in solvente organico nell’iniezione e preservare la ritenzione cromatografica. Karlsoon et al. [11] hanno condotto uno studio nel quale viene riportato un confronto tra un metodo che utilizza la purificazione e pre-concentrazione mediante SPE e uno in cui questa fase viene omessa. I valori di MDL ottenuti nel presente lavoro sono paragonabili al metodo
di Karlsoon et al. [11] che utilizza la purificazione SPE mentre sono nettamente inferiori alla procedura che non la impiega.
Questo sottolinea come il metodo sviluppato possa essere una valida alternativa a un metodo che utilizza la più lunga e costosa procedura SPE.
5.4 Conclusioni
È stato messo a punto un metodo quantitativo per la determinazione delle microcistine LA, LY, LR, YR, RR, LW e LF e della nodularina nei mitili mediante HPLC-(-)ESI- MS/MS.
È stata validata una procedura preanalitica molto semplice che consta in un’estrazione e una filtrazione senza l’impiego di una purificazione lunga e costosa. È stata valutato come tale procedura permetta di ottenere dei risultati simili a quelli in cui viene usata l’SPE. L’effetto matrice è stato considerato nella quantificazione mediante l’uso di una soluzione utilizzata per il calcolo del fattore di risposta preparato in matrice.
Questo è il primo lavoro che impiega lo standard interno per la quantificazione delle microcistine e della nodularina in campioni tessutali. La procedura risulta accurata, ripetibile e con alte rese di estrazione. È stato verificato che la precisione strumentale non viene inficiata dall’effetto matrice.
I limiti di rilevabilità procedurali risultano simili e inferiori a quelli riportati in letteratura permettendo di analizzare le microcistine a livelli di ng su g di campione analizzato.
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5.5 Riferimenti bibliografici
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[12] B.K. Matuszewski, M.L. Constanzer, C.M. Chavez-Eng, Analytical Chemistry 70 (1998) 882.