Evidenze dell’esistenza di entrambe le vie, riduttiva e ossidativa, sono state ottenute in piante. L’elettrone necessario per ridurre il nitrito a NO può derivare dalla catena di trasporto degli elettroni ma la sua sintesi può essere mediata anche dalla nitrato reduttasi o avvenire spontaneamente in un ambiente acido. Anche se l’enzima responsabile della sintesi ossidativa non è stato fin qui identificato, si ritiene che essa possa procedere a partire da arginina, poliammine e idrossiammine (da Moreau et al., 2010).
Ingegnerizzare il metabolismo della prolina per potenziare la tolleranza a stress
Le conoscenze maturate sino ad oggi sul metabolismo della prolina sono state utilizzate per cercare di incrementare la capacità delle piante di tollerare condizioni di stress. Gli sforzi sono stati indirizzati per lo più alla manipolazione dei livelli di osmoliti compatibili, sulla base dell’assunto che l’aumentata produzione di questi composti possa aiutare la pianta a compiere aggiustamenti osmotici (Hayashi et al., 1997; Holmström et al., 1996; Kavi Kishor et al., 1995; Pilon-Smits et al., 1995; Sheveleva et al., 1997; Tarczynski et al., 1993). L’ingegnerizzazione delle vie metaboliche coinvolte ha, però, restituito successi marginali. Le concentrazioni ottenute, sia costitutive che inducibili, non sembrano essere tali da assicurare un effetto (Morgan, 1984, Kavi Kishor et al., 2005; Maggio et al., 2002).
Nel caso dell'iminoacido, però, considerando che le concentrazioni indotte fisiologica- mente a seguito di condizioni di stress sembrano configurare un blando impatto sullo stato d’idratazione della cellula, alcuni autori hanno proposto che il meccanismo alla base dell'effetto proteggente sia in realtà correlato alla capacità di stabilizzare membrane, proteine e strutture subcellulari (Rhodes & Samaras, 1994; Yancey, 1994), o di proteggere la funzionalità cellulare dal danno ossidativo (Bohnert & Shen, 1999). Questo potrebbe consentire l'ottenimento di multiresistenze crociate a stress biotici e abiotici.
Il primo tentativo volto all’ottenimento di piante transgeniche con alti livelli di prolina e aumentata tolleranza agli stress fu fatta su piante di tabacco ingegnerizzate con il gene per la P5CR di patata. Nonostante che l’attività enzimatica aumentasse di circa 50 volte rispetto al wild type, non ne derivò un significativo aumento di prolina libera (La Rosa et al., 1991). Successivamente si capì che l’enzima limitante nella via biosintetica è la P5CS, e che nelle
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piante sovraesprimenti la P5CR questo enzima era limitato dalla mancanza di substrato. L’importanza della P5CR venne comunque confermata da esperimenti in cui la sua espressione veniva ridotta tramite tecnologia antisenso. Le piante cosi ottenuto avevano un contenuto in prolina più basso e mostravano una maggiore sensibilità allo stress e una più bassa percentuale di produzione di semi (De Ronde et al., 2000).
I primi risultati vennero in seguito ottenuti con il gene P5CS isolato da Vigna aconitifolia e posto sotto il controllo del promotore 35S del virus del mosaico del tabacco. In piante di tabacco trasformate con il costrutto già in condizioni normo-osmotiche si riscontravano alti livelli di trascritto, accompagnati da un aumento dei livelli di proteina e da un contenuto in prolina libera circa 14 volte più elevato rispetto ai controlli. In condizionid i stress osmotico, però, la differenza diminuiva molto, e le piante transgeniche accumulavano solo il doppio di prolina rispetto al wild type, pur essendo più tolleranti al sale (Figura 32; Kavi Kishor et al., 1995). Questo fatto suggeriva l’esistenza di una regolazione stringente del suo accumulo. In effetti studi sull’enzima purificato dimostrarono che la P5CS è regolata allostericamente da prolina, con una concentrazione inibente al 50% pari a 6 mM (Hu et al., 1992; Zhang et al., 1995). Le piante di tabacco stressate osmoticamente possono però accumulare prolina nel citosol fino a livelli di più di 130 mM (Binzel et al., 1987; Delauney & Verma, 1993). Per spiegare questo paradosso è stato proposto che l’enzima possa subire dei cambiamenti conformazionali e perdere la regolazione a feedback in condizioni di stress (Boggess et al., 1976a, 1976b).
Figura 32. Fenotipo di piante di tabacco wild type e sovraesprimenti la P5CS di V.
aconitifolia in condizioni di stress salino
(A) Le piante allo stadio di quattro foglie sono trasferite in vasi di vermiculite contenenti 400 mM NaCl ed esaminate dopo 3 settimane di trattamento. (B) radici di piante di 6 settimane sottoposte a disidratazione fino alla fioritura (da Kavi Kishor et al., 1995).
Piante di tabacco trasformate con il gene di V. aconitifolia sottoposto a mutagenesi sito- specifica in modo da eliminare l’inibizione a feedback hanno mostrato di accumulare più prolina rispetto sia al wild type che a quelle trasformate con il gene non modificato (Zhang et al., 1995). Anche in altri sistemi, come riso (Zhu et al., 1998), grano (Sawahel & Hassan, 2002) o
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pomodoro (Hmida-Sayari et al., 2005), la trasformazione con una P5CS posta sotto il controllo di un promotore forte ha prodotto livelli più alti di prolina libera e una conseguente maggiore tolleranza allo stress osmo-salino. Un risultato ancora più marcato è stato ottenuto nel caso della microalga verde Chlamydomonas reinhardtii. In questo caso l’alga la sovraespressione del gene esogeno induce un aumento dei livelli costitutivi di prolina libera dell’80%, determinando una crescita più rapida e una maggiore resistenza al cadmio (Siripornadulsil et al., 2002).
Se una possibile spiegazione dell’accumulo di prolina inferiore alle attese nelle piante transgeniche può risiedere nell’inibizione da prodotto della P5CS, un ulteriore fattore negativo potrebbe essere legato alla sua rapida riossidazione a glutamato (Maggio et al., 2002; Kavi Kishor et al., 2005). Allo scopo di elucidare il ruolo del catabolismo della prolina a questo riguardo, sono state generate linee transgeniche di Arabidopsis con aumentata o ridotta ossidazione dell’aminoacido (Mani et al., 2002; Nanjo et al., 1999). Nelle linee trasformate con un costrutto per la ProDH in orientamento senso (AtProDH-S) non si sono osservati cambiamenti sostanziali nelle concentrazioni di prolina libera, nè nel conseguente livello di osmotolleranza. La somministrazione di prolina esogena migliora però la capacità di tollerare condizioni di stress osmotico (Mani et al., 2002). Dal momento che il catabolismo della prolina potrebbe essere collegato alla respirazione e alla sintesi di ATP, una spiegazione di questo comportamento potrebbe risedere nella maggiore disponibilità energetica delle linee AtProDH-S cui viene fornita prolina esogena. Infatti anche se il catabolismo dell’aminoacido è represso in condizioni di stress, queste linee transgeniche mantengono comunque dei livelli apprezzabili di ProDH. Un'altra ipotesi, sulla base di quanto descritto in riso (Iyer & Caplan, 1998), è che nelle piante transgeniche si venga ad accumulare P5C e che questo a sua volta funga da secondo messaggero, attivando geni coinvolti nei fenomeni di osmotolleranza. Tali ipotesi al momento, però, non hanno trovato un riscontro sperimentale. Per quanto riguarda piante antisenso, sono stati riportati risultati contrastanti. In esperimenti precedenti (Nanjo et al., 1999) piante AtProDH- AS risultavano osmotolleranti. Invece nello stesso studio (Mani et al., 2002) le linee ProDH-AS accumulano prolina in condizioni normo-osmotiche a livelli più alti del wild type ma non mostrano un aumento dell’osmotolleranza. In uno studio comparativo le due linee antisenso hanno mostrato di accumulare livelli simili di prolina sia in condizioni normo-osmotiche che di stress, ma hanno confermato il diverso comportamento in ambiente salino (Mani et al., 2002).
Oggi, a distanza di quasi venti anni dai primi risultati, non si è ancora arrivati a ottenere piante transgeniche in grado di conciliare una adeguata produttività con una accresciuta tolleranza allo stress. Questo potrebbe essere dovuto al costo metabolico eccessivo di una sovrapproduzione costitutiva di prolina, ma anche all'instaurarsi di un ciclo futile tra sintesi e catabolismo dell'iminoacido. A complicare ulteriormente la comprensione della regolazione del metabolismo della prolina vi sono il complesso e ancora poco conosciuto sistema di trasporto intratissutale e i potenziali effetti tossici legati al catabolismo di questo composto.