0 25 50 75 100 0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0 att iv ità (% d e l c o n tro ll o ) Glu (mM)
100 mM (Tabella 11). Anche l’ornitina risulta inibente, se pur a concentrazioni più elevate. Che non si tratti di un effetto aspecifico è confermato dalla mancanza di inibizione da parte degli amino acidi non correlati al glutamato. L’inibizione esercitata da quest'ultimo mostra poi un andamento del tutto inatteso. A basse concentrazioni, comprese tra 0,1 e 10 mM, esso ha un effetto inibitorio, con una ID50 di circa 2mM e un meccanismo di tipo competitivo. A
concentrazioni superiori l'effetto sembra revertito (Figura 48). Solo a dosi altissime, superiori a 100 mM, l’attività torna a essere inibita. Contrariamente all’ornitina, all’arginina e (in condizioni normo-osmotiche) alla prolina, i livelli di glutamato nella cellula vegetale sono effettivamente compresi in un ambito di concentrazioni (1-20 mM; Obojska et al., 2004; Mazzucotelli et al., 2006) in cui tali effetti si potrebbero realmente verificare.
Tabella 11. Inibizione dell’attività della P5CR da parte di alcuni amino acidi
La concentrazione inibente al 50% l’attività della P5CR è stata calcolata utilizzando la regressione lineare dei valori di attività enzimatica espressi come percentuale dei controlli non trattati graficati contro il logaritmo della concentrazione di amino acido.
Amino acido IC50 (mM) L-Pro 84.3 ± 7.5 L-Ala 533 ± 52 Gly >1M L-Ser >1M L-Val 315 ± 25 L-Arg 72.3 ± 5.5 L-Orn 153 ± 13
Figura 48. Inibizione dell'attività della P5CR da parte del glutamato
L’attività è stata misurata in presenza di concentrazioni crescenti di acido glutamico. Una diminuzione della velocità catalitica, proporzionale alla concentrazione, è evidente fino a 10 mM. A livelli superiori l’inibizione reverte, ma oltre i 100 mM l’inibizione si manifesta nuovamente. Lo stesso pattern è stato ottenuto con l’enzima ricombinante espresso in E. coli.
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Se così fosse, la P5CR sarebbe costitutivamente inibita in vivo a meno che il glutamato non fosse disponibile a concentrazioni più elevate. Ulteriori evidenze sperimentali dovrebbero comunque essere ottenute per delineare un quadro preciso. Bisognerebbe ad esempio riuscire a misurare con precisione la concentrazione di glutamato libero, che può variare all’interno dei compartimenti cellulari, e non è nemmeno del tutto chiarito se l'enzima sia localizzato solo nel citosol o anche nei plastidi. Tali risultati, comunque, suggeriscono la possibilità che la sintesi di prolina venga ridotta quando il pool di glutammato è al di sotto di un livello ottimale. Meno chiaro è il meccanismo molecolare in grado di determinare il profilo bimodale evidenziato.
Ottenimento di anticorpi policlonali contro la P5CR espressa in E. coli
I bassi livelli di proteina presente nelle cellule in coltura ha impedito di ottenere la quantità di materiale purificato necessaria all’ottenimento di anticorpi policlonali. Per conseguire questo obiettivo si è allora optato per un sistema eterologo di espressione. Per facilitare la successiva purificazione si è impiegato un costrutto in cui la P5CR è stata fusa con una coda di 6 istidine (6xHis), gentilmente fornito dal dott. Dietmar Funck (Konstanz, Germany). Dopo la purificazione su colonna di Ni++ agarosio, si è reso però necessario un ulteriore passaggio
cromatografico per gel filtrazione per eliminare completamente le proteine di E. coli (Figura 49).
Figura 49. Purificazione della 6xHis-P5CR
La purificazione della proteina ricombinante da estratti di E.coli è stata evidenziata caricando su un gel di poliacrilamide al 12% aliquote di ogni preparato derivante dai diversi passaggi.
Il preparato cosi ottenuto è stato in parte utilizzato per verificare l’effetto inibitorio del glutamato. I risultati precedentemente ottenuti sono stati confermati anche sull’enzima ricombinante, permettendo così di escludere un artefatto dovuto alla possibile presenza di contaminanti residuali nel preparato da cellule vegetali in coltura.
Una parte della proteina purificata è stata invece utilizzata per l'immunizzazione di due topolini da laboratorio. Dopo 15 giorni dalla terza iniezione le cavie sono state sacrificate, e
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l'antisiero isolato dal sangue. Gli anticorpi prodotti sono stati saggiati per verificarne la sensibilità. Per lo sviluppo dei blot si è utilizzato la reazione colorimetrica catalizzata dalla fosfatasi alcalina coniugata con l’anticorpo secondario. La sensibilità è risultata soddisfacente per entrambi gli antisieri, con una capacità di evidenziare quantità inferiori a 10 ng di proteina pura (Figura 50). Tale sensibilità potrebbe essere ulteriormente aumentata utilizzando per lo sviluppo la chemioluminescenza. Quando la sensibilità è stata valutata su di un estratto grezzo preparato da cellule in coltura cresciute in condizioni normo-osmotiche (Figura 50), si sono però evidenziate numerose bande aspecifiche indicando una forte cross-reattività dell’anticorpo policlonale. L’aggiunta all’estratto grezzo di concentrazioni crescenti di 6xHis-P5CR ha comunque consentito di stimare la concentrazione di proteina nativa in un estratto grezzo intorno ai 5 ng su 100 μg di proteine caricate. Sono ora in corso esperimenti per ottimizzare le condizioni di ibridazione dell'anticorpo, in modo da ridurre il più possibile i legami aspecifici.
Figura 50. Sensibilità degli anticorpi policlonali nei confronti dell’antigene puro in assenza o in presenza di un estratto grezzo da cellule non stressate
Nel pannello superiore quantità da 0 a 100 ng di proteina pura sono state analizzate per Western blot. Lo sviluppo delle membrane ha rivelato una buona sensibilità degli anticorpi prodotti, consentendo nel caso dell'antisiero di Topo 1 di visualizzare una banda già con 1 ng di proteina. Nel pannello inferiore quantità da 0 a 100 ng di proteina ricombinante sono state agiunte a 100 μg di proteine estratte da cellule in coltura di Arabidopsis prima di essere caricate su gel. In queste condizioni si riscontra una forte cross-reattività degli anticorpi verso altre proteine vegetali. Tuttavia è possibile riconoscere con chiarezza la banda corrispondente alla P5C reduttasi di Arabidopsis (freccia nera), che corre nel gel con una velocità leggermente superiore alla proteina ricombinante per la mancanza della coda di istidine.