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L’olio di oliva rappresenta uno degli alimenti più antichi il cui ottenimento deriva dalla spremitura del frutto della pianta Olea europaea L. originaria del medio Oriente. A partire dal 5000 a. C. fino al 1400 a. C. la coltivazione di questa specie si è diffusa fino a Creta, alla Siria, per arrivare infine in tutti i paesi del Mediterraneo.
Attualmente esiste un’ampia letteratura scientifica sulle proprietà salutistiche dell’olio d’oliva, tant’è che è opinione comune che gli effetti benefici della Dieta Mediterranea siano attribuibili in larga misura al consumo di questo olio. È stato infatti dimostrato che l’olio d’oliva nella sua totalità contrasta l’invecchiamento cellulare, possiede una lieve azione preventiva sulla trombosi, inibisce la secrezione acida dello stomaco e favorisce la secrezione pancreatica e il drenaggio della bile.
La frazione lipidica dell’olio d’oliva, a differenza di altri oli vegetali, è ricca in acidi grassi monoinsaturi, dei quali il più abbondante è l’acido oleico (C18) che ha dimostrato di contrastare l’ischemia cardiovascolare. Sono presenti inoltre, in quantità minori, l’acido linoleico e l’acido linolenico, che fanno parte rispettivamente degli acidi di categoria omega-6 e omega-3, composti coinvolti nella produzione di energia, formazione di membrane cellulari e sintesi dell’emoglobina.
Le proprietà salutistiche dell’olio d’oliva vengono attribuite principalmente al complesso di fenoli e polifenoli antiossidanti presenti. Recentemente anche l’EFSA, secondo il Regolamento CE 1924/2006, ha approvato un “health claim” con il quale si riconoscono specifici effetti salutistici dell’olio d’oliva riferiti a composti fenolici e polifenolici quali tirosolo, idrossitirosolo e oleuropeina: “i polifenoli dell’olio d’oliva contribuiscono alla protezione dei liquidi ematici dallo stress ossidativo; questa indicazione può essere impiegata solo per l’olio d’oliva che contiene almeno 5 mg di idrossitirosolo e suoi derivati (ad esempio complesso oleuropeina e tirosolo ) per 20 g di olio d’oliva” (dose giornaliera raccomandata). Queste proprietà sono state dimostrate da diversi studi che
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hanno evidenziato come i polifenoli dell’olio d’oliva e in particolare l’oleuropeina e l’idrossitirosolo, siano in grado di “ripulire” l’organismo dai radicali perossidici, dal radicale superossido, dall’acido ipocloroso e dallo ione perossinitrato.23
Ulteriori studi hanno dimostrato gli effetti positivi dei fenoli e polifenoli dell’olio d’oliva su certi parametri fisiologici, riducendo anche lo sviluppo di malattie croniche e degenerative come le malattie cardiovascolari, la malattia di Alzheimer e il diabete.24 Inoltre possono svolgere un’importante azione di prevenzione tumorale, ostacolando il processo di cancerogenesi attraverso un’attività antiossidante e antiinfiammatoria (mediata dalle COX 1 e COX 2) ma anche per interferenza su specifici meccanismi cellulari.25
La famiglia dei composti fenolici e polifenolici caratteristici dell’olio d’oliva comprende composti semplici come il tirosolo e l’idrossitirosolo e composti più complessi tra i quali i derivati secoiridoidi. In particolare per questa classe di composti, l’oleaceina e l’oleuropeina aglicone sono derivati dell’idrossitirosolo mentre l’oleocantale e ligstroside aglicone sono derivati del tirosolo26 (Figura 1). Le loro concentrazioni nell’olio dipendono sia dal cultivar, dal livello di maturazione del frutto, dall’irrigazione, dalle tecnologie di trasformazione delle olive in olio e dalle modalità di conservazione dello stesso.
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Figura 1. Principali composti fenolici dell’olio vergine d’oliva ad elevato valore nutraceutico.
L’oleocantale è responsabile della caratteristica sensazione pungente e irritante associata all’ingestione di olio, poiché è in grado di legarsi e stimolare i recettori TRPA1 espressi a livello della mucosa faringea; questa stessa azione è esercitata anche dall’ibuprofene, noto farmaco antiinfiammatorio inibitore non selettivo delle ciclossigenasi (COX). Tale evidenza ha indotto lo studio sulla eventuale attività inibitoria dell’oleocantale nei confronti delle ciclossigenasi COX1 e COX2. Bechaump12 ha in seguito dimostrato che l’oleocantale esercita un effetto inibitorio sulle ciclossigenasi con un meccanismo d’azione analogo a quello dell’ibuprofene, mostrando anche una maggiore potenza inibitoria a parità di concentrazione. Tale attività giustifica anche la sua potenziale attività salutistica
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per diverse malattie croniche come quelle cardiovascolari e per malattie infiammatorie degenerative alle articolazioni grazie ad una ridotta sintesi dei trombossani (agenti pro-aggreganti) e ad una ridotta produzione delle prostaglandine come conseguenza dell’inibizione delle COX, unita ad una ridotta espressione della iNOS.22
Infine l’oleocantale ha mostrato attività preventiva verso alcune forme di cancro gastrico poiché possiede azione antimicrobica contro i microorganismi responsabili dell’ulcera gastrica e quindi della possibile insorgenza del tumore che ne può derivare. È stato anche descritto come potenzialmente utile per contrastare lo sviluppo di malattie neurodegenerative come l’Alzheimer, per la sua capacità di prevenire la A- oligomerizzazione e la tau aggregazione.17 L’oleaceina, altro derivato secoridoide dell’olio d’oliva, ha mostrato proprietà simili a quelle dell’oleocantale e, in particolare, possiede un’ottima attività antiossidante. L’oleuropeina aglicone, è molto attiva nell’inibire l’aggregazione piastrinica e ha mostrato un effetto protettivo verso l’Alzheimer ed alcune forme di cancro.
Comunque i meccanismi d’azione, nonché i profili di biodisponibilità di questa famiglia di composti non sono stati completamente chiariti.
Il lavoro sperimentale di questa tesi si inserisce in un ampio progetto multidisciplinare che si propone di studiare le proprietà nutraceutiche dell’olio d’oliva tal quale e dei suoi componenti fenolici e polifenolici, quali tirosolo, idrossitirosolo, oleuropeina, oleocantale ed oleaceina, questi ultimi due non ancora oggetto di “health claim”. A tal proposito risulta fondamentale la disponibilità di metodiche analitiche per il dosaggio dei suddetti componenti fenolici e polifenolici, nonché di standard puri che possano essere utilizzati per gli studi analitici, per studi biochimico-farmacologici e per studi di tecnologia farmaceutica. Dai risultati di questi studi si potranno anche avere informazioni fondamentali per lo sviluppo di nuovi integratori contenenti i fenoli e polifenoli
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oggetto di studio, che potrebbero essere utilizzati anche come “add-on therapy”. Di notevole rilevanza sarà la possibilità di veicolare tali sostanze mediante opportune forme farmaceutiche, come ad es. le nanoparticelle, al fine di incrementarne il profilo di biodisponibilità.
In particolare, tra i fenoli e polifenoli oggetto delle ricerche, questa tesi è stata focalizzata sullo sviluppo di metodiche analitiche per l’oleocantale, sia mediante HPLC che mediante risonanza magnetica nucleare. Inoltre, non essendo disponibile in commercio l’oleocantale, parte del lavoro sperimentale è stato rivolto verso la sintesi del suddetto composto, ottimizzando vie di sintesi già note.27
La prima fase del lavoro sperimentale svolto, ha riguardato lo sviluppo di una metodica analitica per l’analisi dell’olio d’oliva ed il suo contenuto in oleocantale utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Questo studio si è basato su una metodica riportata in letteratura28 che aveva dimostrato di avere i migliori limiti di quantificazione e determinazione. Tale metodica è stata quindi ripresa ed ottimizzata come descritto di seguito.
La porzione fenolica dell’olio d’oliva è stata estratta trattando un campione di olio con esano e acetonitrile in rapporto di 1:2.5 v/v. La totalità dell’acetonitrile ottenuta da tre estrazioni è stata evaporata e il residuo solubilizzato in una miscela MeOH/H2O 1/1 (v/v). È stata utilizzata una quantità di miscela pari ad ¼ rispetto a quella indicata nella procedura di riferimento,28 in modo da ottenere una soluzione più concentrata del campione, pronta per essere analizzata all’HPLC.
Per mettere a punto la metodica HPLC, sono state comparate quattro tipi di colonne diverse, sia per quanto riguarda le dimensioni, sia per quanto riguarda il particolato (Tabella 1), usando come fase mobile una miscela costituita da acqua e acetonitrile secondo i gradienti riportati nelle tabelle 2 e 3.
36 Tabella 1
150 x 4.6 mm Luna 5 µm
150 x 4.6 mm Luna 3 µm
250 x 4.6 mm Hypersil 5 µm
150 x 4.6 mm Zorbax 3.5 µm
Tabella 2
Tabella 3
GRADIENTE 2
Durata
(min)
ACN (%)
H2O (%)
0
25
75
35
25
75
35.01
80
20
45.00
80
20
45.01
25
75
55
25
75
GRADIENTE 1
Durata
(min)
ACN (%)
H2O (%)
0
35
65
50
35
65
50.01
60
40
60
60
40
60.02
35
65
70
35
65
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Le condizioni migliori in termini di risoluzione sono state ottenute utilizzando come fase stazionaria la colonna Phenomenex 150 x 4.6 mm Luna 5 µm ed una fase mobile eluita secondo il gradiente di tipo 2 a flusso 1 mL/ min.
I cromatogrammi sono stati acquisiti utilizzando come rivelatore uno spettrofotometro UV impostato ad una lunghezza d’onda di 278 nm.
Figura 2. Cromatogramma HPLC dell’estratto fenolico dell’olio d’oliva.
In figura 2 è riportato un esempio di cromatogramma ottenuto secondo le condizioni sopradette che evidenzia una buona risoluzione e separazione dei vari componenti della matrice. In relazione alla attribuzione del picco corrispondente all’oleocantale, questo è stato definito attraverso la comparazione dei cromatogrammi e del tempo di ritenzione con quelli riportati in letteratura28; inoltre, per poter escludere la sovrapposizione di due o più analiti con lo stesso tempo di ritenzione, sono state effettuate ulteriori analisi, variando opportunamente il gradiente di eluizione. Al fine di poter attribuire il picco relativo al segnale dell’oleocantale in modo inequivocabile, risulta comunque
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indispensabile la possibilità di disporre di uno standard puro di oleocantale, che peraltro è stato l’oggetto della seconda parte di questa tesi di laurea dal momento che, come già evidenziato, questa molecola non è disponibile in commercio.
Il lavoro sperimentale di tesi è stato pertanto rivolto verso la sintesi dell’oleocantale come miscela racemica, ottimizzando una via di sintesi già riportata in letteratura,27 al fine quindi di potere disporre di questo composto come standard puro per i successivi studi analitici, biochimico-farmacologici e di tecnologia farmaceutica.
39 Schema di sintesi
Reagenti e condizioni: (a) PhI(OAc)2 , HBF4, CH3COOH, temperatura ambiente, 2h; (b) KOH 10M,
EtOH, 60˚C, overnight; (c) MnO2, EtOH assoluto, temperatura ambiente, overnight; (d) 5, TMEDA,
DMF anh., TBAI, temperatura ambiente, overnight; (e) t-BuOOH, DBU, CH2Cl2 anh., temperatura
ambiente, overnight; (f) EtPPh3Br, KHMDS, toluene anh., -78˚C, 1h; (g) NaIO4, THF/H2O,
temperatura ambiente, 22h; (h) TBAF, HF, THF, temperatura ambiente, overnight; (i) TBDMSCl, imidazolo, THF, 15˚C per 10 minuti, temperatura ambiente overnight.
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Il primo passaggio consiste nella formazione del lattone 2 a partire dall’acido 2- ciclopenten-1-acetico (1). La reazione di lattonizzazione fra l’acido insaturo 1 e la specie reattiva ottenuta facendo reagire il diacetossi iodio benzene con l’acido tetrafluoroborico, è stata effettuata seguendo due metodiche diverse. La prima prevede la formazione della specie reattiva, cioè il sale acetossi feniliodonio tetrafluoroborato, per reazione tra PhI(OAc)2 e HBF4 in acido acetico a temperatura ambiente per un’ora e la successiva aggiunta dell’acido 1. La miscela di reazione viene lasciata reagire sotto agitazione un’ora a temperatura ambiente per ottenere il lattone 2 (resa 48%), tramite il meccanismo 29 indicato in figura 3:
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Il secondo metodo prevede l’ottenimento della specie reattiva, lo iodoso benzene tetrafluoro borato di colore giallo, per reazione fra PhI(OAc)2 e HBF4 in CHCl3. Questo sale è stato quindi isolato e fatto reagire con l’acido monoinsaturo
1 in acido acetico per un’ora a temperatura ambiente per ottenere il lattone 2 in
rese dell’80% secondo il meccanismo30 di seguito riportato (Figura 4).
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Lo step successivo consiste nell’idrolisi del lattone con una soluzione acquosa di KOH 10 M in etanolo per ottenere il sale di potassio 3 (Schema di sintesi). Secondo quanto riportato in letteratura,27 per far sì che la reazione di idrolisi vada a completezza è necessario 1 equivalente di KOH, mentre noi abbiamo riscontrato che sono necessari 2 equivalenti di base. Tuttavia utilizzando un solo equivalente di KOH il sale può essere purificato mediante triturazione con etere dietilico che permette il recupero del lattone non reagito.
La reazione successiva consiste nell’ossidazione dell’alcol allilico del composto 3 a dare il corrispondente chetone 4. In un primo momento, abbiamo seguito esattamente la procedura presente in letteratura27 che riporta la reazione con MnO2 in etanolo assoluto per 23 ore a temperatura ambiente, senza però ottenere il prodotto desiderato, ma recuperando sempre il prodotto di partenza. Sono stati dunque utilizzati solventi diversi dall’etanolo, (THF, H2O) conducendo la reazione anche al microonde (CEM) e impiegando altri tipi di ossidanti (bromuro rameico con t-BuOOH come catalizzatore, piridinio clorocromato (PCC)), anche in questi casi senza ottenere il derivato desiderato. Infine la reazione effettuata utilizzando MnO2 attivato in etanolo assoluto ha finalmente portato al chetone atteso 4. Il MnO2 attivato infatti è riportato in letteratura30 come ossidante selettivo di alcol allilici come anche di quelli benzilici. La scelta dell’etanolo si è resa necessaria per la limitata solubilità del sale 3; il fatto che la reazione di ossidazione avvenga anche in etanolo assoluto risulta sorprendente in quanto in letteratura è riportato che i solventi polari hanno un forte effetto inibente nei confronti del MnO2 attivato.
Successivamente il composto 4 è stato fatto reagire con il bromo derivato 5 in DMF e N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TMEDA) (1.1% v/v) in presenza di una quantità catalitica di tetrabutilammonio ioduro (TBAI). Il grezzo ottenuto dalla reazione è stato purificato mediante flash cromatografia utilizzando come miscela eluente etere di petrolio/acetato di etile 8:2, per ottenere l’estere desiderato 6a con una resa del 15%. A differenza di quanto riportato nella
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procedura, durante la purificazione del grezzo di reazione non è stato isolato il corrispondente composto deprotetto 6b.
Il bromo derivato 5 è stato preparato per reazione tra il 4-(2-bromoetil)fenolo e il
t-butil dimetilsilil cloruro in THF e aggiungendo un eccesso di imidazolo a 15 ˚C
durante un periodo di dieci minuti. Successivamente la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 16 ore. Il grezzo di reazione è stato purificato tramite flash-cromatografia usando come eluente etere di petrolio per ottenere il bromo derivato puro con una resa del 62%. La successiva reazione di epossidazione dell’estere 6a con t-BuOOH, in presenza di diazabiclico(5.4.0)undec-5-ene (DBU) come catalizzatore in CH2Cl2 anidro ha fornito l’epossido 7 purificato per flash cromatografia, (etere di petrolio/acetato di etile 8:2) con una resa del 40%.
L’epossido 7 è stato poi sottoposto ad una reazione di Wittig per trattamento con etil trifenilfosfonio bromuro e KHMDS in toluene a -70 ˚C.
Inizialmente la reazione è stata eseguita secondo la procedura riportata in letteratura27 che prevede la formazione dell’ilide per deprotonazione dell’etil trifenil fosfonio bromuro con KHMDS. L’avvenuta reazione è resa evidente per l’intensa colorazione rossa della soluzione che viene poi aggiunta al chetone in toluene ad una temperatura di -70 ˚C. Con questa procedura l’ilide risultava particolarmente instabile infatti rapidamente si aveva decolorazione della soluzione. Abbiamo perciò ritenuto opportuno aggiungere direttamente il chetone alla soluzione dell’ilide nel momento in cui essa si veniva a formare (colorazione rossa). La reazione è stata monitorata su TLC aggiungendo più volte alla miscela di reazione nuova ilide preparata di fresco. Il grezzo di reazione è stato purificato mediante flash cromatografia utilizzando etere di petrolio/acetato di etile 9:1 come miscela eluente, con una resa del 18%.
L’idrolisi ossidativa del composto 8 con un eccesso di NaIO4 in THF e H2O ha portato ad un grezzo di reazione che, dopo purificazione tramite cromatografia flash (etere di petrolio/acetato di etile 8:2) ha fornito il derivato dicarbonilico 9 come miscela di isomeri E/Z in rapporto di 77:23, in resa del 46 %.
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Attualmente è in corso la procedura per effettuare la reazione di deprotezione dell’ossidrile fenolico che consiste nel trattamento del derivato 9 con un tampone costituito da una soluzione di tetrabutilammonio fluoruro (TBAF) in THF e una soluzione acquosa di HF al 40%.
Sempre con l’obiettivo di sviluppare metodiche analitiche per la determinazione dell’oleocantale nell’olio d’oliva, l’ultima parte della mia tesi è stata dedicata allo studio ed all’applicazione di una recente metodica26 che prevede l’impiego della risonanza magnetica nucleare (1H NMR).
Infatti l’oleocantale presenta un segnale caratteristico a δ = 9.22 ppm dovuto al gruppo aldeidico in posizione 5. Questo segnale è presente anche in altri derivati secoiridoidi ma cade a campi diversi (figura 5).
Figura 5. Spettro HNMR dei derivati secoiridoidi dell’olio vergine d’oliva.
Siringaldeide, standard interno
oleuropeina aglicone
oleocantale
oleacina ligstroside aglicone
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Per poter ottenere il campione da analizzare all’1H-NMR, l’olio d’oliva è stato sottoposto a un trattamento con cicloesano e acetonitrile in rapporto 4:5 (v/v) in modo da ottenere la fase acetonitrilica in cui si solubilizzano i composti d’interesse. A tale fase è stata aggiunta una soluzione di siringaldeide in acetonitrile (0.50 mg/mL) come standard interno ed in seguito la soluzione risultante è stata evaporata. Il residuo ottenuto è stato ripreso con CDCl3 e trasferito in un tubicino per NMR. Come esempio è riportato in figura 6 uno degli spettri ottenuti, registrato con uno spettrometro Bruker Avance operante a 400 MHz ed in cui i segnali sono stati integrati manualmente (TopSpin 3.2).
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Tale metodica è stata quindi applicata a campioni di olio di oliva al fine di determinare il loro contenuto relativo di oleocantale. Una prima valutazione dei livelli di oleocantale è stata effettuata rapportando l’integrazione del suo caratteristico segnale aldeidico (δ = 9.22 ppm) a quella del segnale aldeidico della siringaldeide (δ = 9.81 ppm), alla quale è stato attribuito un valore pari ad 1. Nella tabella 4 sono riportate le integrazioni del segnale caratteristico dell’oleocantale, ottenute secondo questa metodica, per i campioni di olio d’oliva analizzati. Questi risultati ne evidenziano quantità variabili nei diversi tipi di olio.
La possibilità di poter disporre di uno standard puro sarà utile al fine di ottenere dei valori assoluti di quantità di oleocantale nei vari campioni di olio d’oliva esaminati.
Campione Olio Integrazione Oleocantale 1 0,65 2 0,59 3 0,00 4 0,54 5 0,72 6 0,50
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