Introduzione di piccole mutazioni attraverso la creazione di topi “knock-out”

Piccole mutazioni come l’inserimento di un codone di stop oppure le sostituzioni aminoacidiche possono essere realizzate attraverso l’utilizzo di

INTRODUZIONE

Figura 21. Classificazione dei vettori per la ricombinazione. (a) Nel vettore di sostituzione l’esone 2 del gene bersaglio viene sostituito dal gene che codifica per la resistenza alla neomicina (neo) dopo la ricombinazione omologa e la linearizzazione del vettore. Il gene HSV-tk viene perso dopo la ricombinazione omologa. (b) Il vettore d’inserzione viene linearizzato tra l’esone 2 e 3 del gene bersaglio. La ricombinazione omologa porta all’integrazione del vettore ed a una parziale duplicazione genica. Le linee sottili rappresentano la scheletro del vettore.

due principali tecniche: la prima è conosciuta come “Hit and run” mentre la seconda è chiamata “Tag and exchange”

2.6.1 “Hit and run”

Questa tecnica comporta l’introduzione di una mutazione attraverso due passaggi. (Figura 22a). Il primo passaggio richiede la ricombinazione omologa attraverso l’utilizzo di un vettore inserzionale, che determina una parziale duplicazione del locus separata dalla sequenza del plamide e dei due geni marcatori. Il costrutto contiene infatti oltre la mutazione prescelta sia un marker di selezione positiva (la resistenza alla neomicina, neo) che uno di selezione negativa (gene per la timidina chinasi del virus herpes simplex, tk). Dopo una prima selezione positiva dei cloni mediante G418, essi vengono selezionati negativamente mediante l’utilizzo di ganciclovir (un nucleotide analogo atossico metabolizzato come tossico dall’enzima della timidina chinasi) che permette il recupero dei rari cloni revertanti che hanno perso il gene marcatore della timidina chinasi. Questi revertanti infatti ovviano alla parziale duplicazione attraverso un singolo evento di ricombianzione reciproca intracromosomale, determinando l’excisione della sequenza duplicata e della cassetta per la selezione della timidina chinasi, creando così l’allele modificato desiderato. Questa tecnica è stata usata con successo per la creazione di cellule staminali embrionali e linee murine mutate (Valancius e Smithies, 1991; Ramirez-Solis et al., 1993; Wu et al., 1994; Horan et al., 1995;Horie et al., 1995;van Doornick et al., 1995; MacMillan et al., 1996; Toth et al.,1996; Takaesu et al., 1997). Questo metodo presenta comunque dei lati negativi. Innanzitutto la modificazione può risiedere nella regione della sequenza che viene excisa nel secondo passaggio, ricreando quindi un allele wild-type resistente al ganciclovir. Un altro aspetto è legato alla ricombinzione intracromosomale, evento raro tra due loci specifici, che può risultare limitante per un efficiente processo di excisione in alcuni loci. Ciò può spiegare il raro utilizzo di questa tecnica nella creazione di linee knock- out murine.

2.6.2 “Tag and exchange”

La strategia del “tag and exchange” o “double replacement” (Askev et al., 1993;Stacey et al., 1994; Wu et al., 1994) richiede due differenti vettori di

INTRODUZIONE

Figura 22. Strategia “hit and run” e “tag and exchange”. (a) Il gene bersaglio (cassetta in nero) presenta una regione di omologia con il vettore contenente la mutazione puntiforme in uno dei suoi esoni (freccia nera). I due geni per la selezione si trovano sul vettore all’esterno della zona di omologia. La resistenza alla neomicina (neo) consente di individuare i cloni in cui è avvenuta la ricombinazione omologa con il gene bersaglio determinando una parziale duplicazione del locus. Un successivo evento di ricombinazione intracromosomale nell’allele interessato determina l’instaurarsi della mutazione puntiforme ed il rilascio della sequenza esogena. La selezione negativa permette di individuare l’evento. (b) Nella tecnica “tag and exchange” il primo vettore ricombina inizialmente inserendo i due marcatori di selezione (neo e tk). Il marcatore positivo viene utilizzato per la selezione dell’evento. Un secondo vettore che porta la mutazione prescelta, ma non contiene marcatori di selezione, ricombina omologamente ed i cloni selezionati sono quelli tk-_{. FIAU: analogo}

ricombinazione. Nella prima ricombinazione omologa il vettore utilizzato contiene un marcatore di selezione positiva (neo) ed uno di selezione negativa (tk), ma soltanto la selezione positiva è utilizzata in questo passaggio (Figura 22b). In un secondo passaggio, un altro costrutto di sostituzione, che porta una specifica mutazione e non possiede geni marcatori viene introdotto nelle cellule staminali embrionali modificate. La ricombinazione omologa elimina entrambi i marcatori ed i cloni che posseggono la mutazione desiderata (tk-_{) vengono identificati per la loro} resistenza all’analogo di base tossico ganciclovir o FIAU. Questa tecnica è stata applicata per diversi loci (Askev et al., 1993;Gondo et al., 1994; Stacey et al., 1994;Wu et al., 1994;Melton et al., 1994;Whyatt e Rathjen., 1997). Il suo maggior vantaggio consiste nel poter inserire consecutivamente diverse mutazioni nello stesso locus. La linea cellulare inizialmente modificata infatti può essere utilizzata come substrato per l’inserimento di nuove mutazioni nella regione circostante.

2.7 Creazione di topi “knock-in”

Una variazione al normale metodo di produzione di linee murine knock- out, consiste nell’introduzione di un gene esogeno in un locus specifico, ed è chiamato “knock-in” (Figura 23). Mediante questa tecnica si può posizionare un gene specifico, come un oncogene o un gene reporter, sotto il controllo di un elemento regolatorio di un altro gene che agisce in cis. Questo controllo era stato ottenuto mediante la creazione di transgeni. Questa tecnica presenta però considerevoli vantaggi che evitano le limitazioni imposte dalla tecnologia dei transgeni. La ricombinazione omologa permette di posizionare il gene sotto il controllo dell’intero sistema di regolazione del gene endogeno ed inoltre il transgene non è soggetto ad effetti di posizione come risultato di un sito di integrazione casuale. La più comune applicazione di questa tecnica rappresenta l’introduzione del gene LacZ come gene

reporter in diversi loci (Le Mouellic et al., 1990; Colucci-Guyon et al.,

1994). Questa metodologia inoltre si è dimostrata molto utili nello studio di relazioni funzionali tra membri di una famiglia genica e la loro potenziale abilità di compensazione (Cooke et al., 1997).