Il gruppo di farmacologia del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, per primo ha descritto e caratterizzato la funzione chimica “ISOTIOCIANATO” quale funzione in grado di rilasciare H2S in
maniera lenta e graduale. Nello studio che ha portato a tale scoperta, sono stati analizzati alcuni derivati aril isotiocianati (PhNCS, PhNCS-COOH, PhNCS-CH3, PhNCS-CF3, PhNCS-iPr) ed è stato effettuato il confronto con le proprietà esibite dalle molecole di riferimento già riportate in letteratura (NaHS, DADS e GYY4137) (Figura 25). Inoltre, i derivati di isotiocianato selezionati sono stati sottoposti a ulteriori protocolli sperimentali, volti a valutare gli effetti vaso-rilascianti sull'aorta del ratto e le arterie coronarie e l'attività di iperpolarizzazione della membrana sulle cellule muscolari lisce vascolari umane
.
Figura 24: struttura del cicloottazolo, specie chimica prevalente in SG1002.
42 Figura 25: Da sinistra verso destra sono illustrate le strutture chimiche
dei composti di riferimento GYY4137 e DADS e degli isotiocianati testati PhNCS, p-COOHPhNCS, PhNCS-CH3 (R=CH3), PhNCS-CF3 (R=CF3) e PhNCS-iPr (R=iPr).
L’analisi amperometrica ha confermato, in particolare, che NaHS 1 mM in soluzione acquosa è in grado di liberare grandi quantità di H2S (circa 200 µM) nei primi due minuti dall’inizio della
misurazione, indipendentemente dalla presenza di L-Cisteina; come precedentemente discusso, però, il rilascio massiccio di solfuro di idrogeno da parte del sale non consente di riprodurre gli effetti biologici del gas endogeno poiché la quantità di H2S prodotta non è costante e tende ad
esaurirsi in breve tempo (Martelli et al., 2014). Gli isotiocianati studiati, invece, rilasciano solfuro di idrogeno con un meccanismo cisteina-dipendente che ricalca quello dei composti di riferimento DADS e GYY4137 e che mima la produzione endogena del gas, permettendo così di ridurre il rischio di effetti collaterali tipici dei donatori rapidi di H2S (Baskar et al., 2007; Li et al., 2008; Martelli et al.,
2014). In assenza di L-Cisteina, infatti, le quantità di gas liberate sono decisamente trascurabili mentre, al contrario, la presenza di concentrazioni crescenti di questo amminoacido porta ad un aumento correlato del rilascio di H2S da parte di fenilisotiocianto, come chiaramente indicato dalle
registrazioni amperometriche. In presenza della massima concentrazione dello stesso amminoacido solforato (4mM), la liberazione del gas risulta lenta e costante nel tempo con un valore di Cmax pari a circa 20 µM (Figura 26).
43 Figura 26: Rilascio di H2S da parte di NaHS (a sinistra) e PhNCS (a destra). Le curve descrivono la variazione della concentrazione di H2S in soluzione acquosa nel tempo, rispettivamente dopo aggiunta di NaHS 1 mM o di PhNCS in assenza di L- Cisteina (quadrati bianchi) o in presenza di L-Cisteina 0,33 mM (triangoli bianchi capovolti), 1 mM (triangoli bianchi), 2 mM (diamanti bianchi) o 4 mM (quadrati neri). La necessaria presenza di L-Cisteina consente un rilascio “intelligente” ed esclusivo del gastrasmettitore a livello tissutale. Le misurazioni sono state effettuate in entrambi i casi con metodo amperometrico (Martelli et al., 2014).
La presenza del gruppo carbossilico sull’anello aromatico in posizione para (PhNCS-COOH) inoltre, sembra migliorare il rilascio del gas in modo Cisteina-dipendente (Cmax 35 µM) senza modificare la velocità del processo.
Al contrario, l’inserimento di un qualsiasi
sostituente in posizione orto comporta la perdita delle proprietà di H2S donor dell’arilisotiocianato,
motivo per cui PhNCS-CH3, PhNCS-CF3 e PhNCS-iPr si sono dimostrati incapaci di liberare H2S anche
in presenza di L-Cisteina. Infine PhNCS-COOH è stato selezionato per un’ulteriore e inequivocabile prova della liberazione di H2S attraverso analisi gascromatografica e i dati ottenuti dall’esperimento
hanno permesso non solo di confermare quanto già ipotizzato, ma anche di considerare ragionevolmente il composto come un promettente agente terapeutico (Martelli et al., 2014).
44 Tabella 2: La tabella riassume i parametri di Cmax, relativi agli effetti di rilascio
di H2S esibiti dai composti sintetizzati e dai farmaci di riferimento, dopo la loro incubazione in buffer a pH e temperatura fisiologici in assenza (AB) o in presenza (AB + L-Cys) di L-Cisteina 4 mM.
Come si può notare dalla tabella, il PhNCS-COOH presenta tassi di rilascio di H2S significativamente
più alti di quelli di GYY4137. Di conseguenza il p-carbossifenil isotiocianato ha evocato effetti vaso- rilascianti in arterie di conduttanza isolate di ratto. In particolare NaHS ha promosso effetti vaso- rilascianti dipendenti dalla concentrazione su anelli di aorta di ratto, privati di endotelio, precontratti con KCl 25 mM, con un valore di pEC50 di 3,84 ± 0,02 ed efficacia vaso-rilasciante massima di 98 ± 1. È stato inoltre osservato che, un bloccante del canale Kv7, XE991, ha significativamente antagonizzato gli effetti vasodilatatori di NaHS. Il PhNCS ha prodotto deboli effetti vaso-rilascianti, con bassi livelli di efficacia (Emax = 18 ± 2). Il derivato carbossilico PhNCS- COOH ha mostrato invece un'efficacia vaso-rilasciante quasi completa (Emax = 90 ± 2), con un livello di potenza (pEC50 = 4,17 ± 0,06) superiore a quello esibito da NaHS. Inoltre, XE991, ha quasi completamente abolito gli effetti vaso-rilascianti di PhNCS e PhNCS-COOH. Infine, il p-carbossifenil isotiocianato è stato selezionato per ulteriori indagini su anelli di aorta in presenza di endotelio, cioè in un modello sperimentale più simile alla fisiologia dei vasi sanguigni e in questi vasi il PhNCS- COOH ha mostrato un'efficacia vaso-rilasciante quasi completa (Emax = 91 ± 3), con un livello di potenza (pEC50 = 4,68 ± 0,07) più alto di quello mostrato negli anelli aortici privi di endotelio. La somministrazione di L-NAME, inibitore della biosintesi endoteliale di NO, non ha influenzato l'efficacia vaso-rilasciante di PhNCS-COOH, ma ha causato una significativa riduzione della potenza (pEC50 = 4,26 ± 0,07). Dunque gli effetti di PhNCS-COOH nei vasi, in presenza di endotelio, trattati con L-NAME erano quasi completamente equivalenti a quelli osservati nei vasi privi di endotelio. Pertanto, il PhNCS-COOH, donatore di H2S è in grado di produrre un vaso-rilasciamento in maniera
AB
AB + L-Cisteina
Composto
Cmax (µM)
Cmax (µM)
DADS < 3 19.4 ± 5.5 GYY4137 < 3 10.3 ± 2.6 PhNCS < 3 21.9 ± 2.9 PhNCS-COOH < 3 35.0 ± 3.2 PhNCS-CH3 < 3 < 3 PhNCS-CF3 < 3 < 3 PhNCS-iPr < 3 < 3
45 Figura 27: Struttura chimica dei composti testati.
endotelio indipendente, tuttavia in presenza dell'endotelio questi effetti risultano essere rafforzati da un contributo NO-mediato. Gli effetti vaso-rilascianti di NaHS e dei due isotiocianati sono stati osservati anche nel letto vascolare coronarico. Infatti, tutti questi composti hanno causato un aumento del flusso coronarico basale; inoltre, hanno efficacemente neutralizzato la vasocostrizione coronarica indotta da Angiotensina II. Ulteriori studi sul PhNCS-COOH hanno dimostrato anche un’azione iperpolarizzante sulla membrana delle cellule muscolari lisce di aorta umana. Considerando poi che questi effetti risultano antagonizzati da XE991, bloccante dei canali Kv7, è possibile ipotizzare che il meccanismo di azione degli isotiocianati sia attribuibile al significativo rilascio del gas in presenza di L-Cisteina ed è grazie a questi risultati che il gruppo funzionale N=C=S può oggi essere considerato un potenziale H2S donor a tutti gli effetti (Martelli et al., 2014). In
conclusione quindi come la tioamide, anche l'isotiocianato può essere visto come una frazione semplice e molto versatile, che può essere utilmente impiegata per proiettare serie di nuovi ed originali donatori di H2S. Lo stesso gruppo di ricerca, partendo dall’osservazione che la funzione
isotiocianato è presente come metabolita secondario nelle piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae o Crucifere, ha condotto uno studio sperimentale nel quale per la prima volta, attraverso metodi amperometrici e spettrofotometrici, è stata misurata l’effettiva quantità di H2S
liberata nel tempo da diversi arilisotiocianati di origine naturale (Citi et al., 2014). La famiglia delle Brassicaceae è una grande famiglia botanica comprendente molte specie commestibili, come la Brassica oleracea L., la Brassica nigra L., la Sinapis alba L. e così via. Gli isocianati isolati da queste piante derivano da una idrolisi, mediata dalla mirosinasi, dei glucosinolati che sono noti metaboliti secondari di questa famiglia. Sono stati quindi selezionati l’allil isotiocianato (AITC, presente nella senape nera, Brassica nigra L.), il 4-idrossibenzil isotiocianato (HBITC, presente nella senape bianca, Sinapis alba L.), il benzil-isotiocianato (BITC, altamente presente nel crescione inglese, Lepidium sativum L.) ed erucina (ERU, presente in diverse specie come broccoli, Brassica oleracea L., e rucola, Eruca vesicaria L. ed Eruca sativa Mill.). Inoltre, è stata scelta anche la sinigrina (SIN, glucosinolato precursore di AITC) come composto di riferimento (Figura 27).
46 Figura 28: Rilascio di H2S da parte di allil isotiocianato (AITC), erucina (ERU), benzil isotiocianato (BITC) e sinigrina (SIN) in assenza (A) o in presenza di L-Cisteina (B). Le due curve descrivono l’aumento della concentrazione di H2S in funzione del tempo, a seguito dell’incubazione dei composti selezionati. La misurazione è stata effettuata in entrambi i casi con metodo amperometrico (Citi et al., 2014).
La capacità di rilascio dell'H2S è una caratteristica farmacologicamente rilevante, già attribuita a
composti naturali, come i polisolfuri dell'aglio, ma mai segnalata per isotiocianati naturali. In particolare, tra gli isotiocianati testati, ERU e BITC si sono dimostrati deboli, ma comunque rilevanti, donatori di solfuro di idrogeno sia in assenza che in presenza dell’amminoacido solforato L-Cisteina mentre AITC, nelle stesse condizioni sperimentali, ha liberato quantità apprezzabili di H2S in modo
cisteina-dipendente. Le proprietà di rilascio di H2S da parte di HBITC, registrate in presenza di L-
cisteina, erano equivalenti a quelle mostrate dal DADS in studi precedenti (Martelli et al., 2013), ma a differenza del DADS (che ha mostrato un rilascio più debole di H2S in assenza di L-cisteina), HBITC
si è mostrato come donatore di H2S significativo anche in assenza di questo amminoacido. Il
glucosinolato sinigrina, invece, ha mostrato più blande proprietà di donatore di solfuro di idrogeno, a dimostrazione del fatto che il gruppo isotiocianato risulta essere un requisito favorevole per la liberazione del gas.
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1.7.1. “Rocket salad” e valore traslazionale-nutraceutico
Tra le verdure crucifere, le “rocket salad” sono ampiamente utilizzate nella dieta mediterranea in quanto ormai riconosciute come fonte di buone proprietà fitochimiche (Bogani e Visioli, 2007; Schaffer et al., 2005). Il nome "rocket" è comunemente usato per indicare diverse specie appartenenti alla grande famiglia delle Brassicaceae che sono rappresentate principalmente da Eruca sativa Mill. (nota anche come rucola) e Diplotaxis tenuifolia L. (rucola selvatica), spesso utilizzate, nella cucina, per il loro caratteristico sapore pungente. Nell'ultimo decennio, il consumo delle varie specie di insalate, è esponenzialmente aumentato in tutto il mondo, in virtù della correlazione emersa tra il consumo di materie prime fresche e l'assorbimento di sostanze fitochimiche che promuovono la salute. È stato dimostrato infatti, che la biodisponibilità media complessiva di isotiocianati (ITCs) è del 61% e del 10% rispettivamente per le verdure crucifere crude e cotte (Vermeulen et al., 2006). Inoltre è importante sottolineare anche, che le varie specie di rucola sono una buona fonte di vitamine, come vitamina C, carotenoidi e polifenoli, che svolgono un ruolo molto importante in termini di azione antiossidante (Martinez-Sanchez et al., 2008). Le “rocket salad” sono caratterizzate da un alto contenuto di glucosinolati (GLS), cosi come altre verdure appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae, e i loro prodotti di degradazione enzimatica, gli isotiocianati, sono i composti responsabili di effetti potenzialmente benefici sulla salute umana (D'Antuono et al., 2008). I glucosinolati sono relativamente stabili nelle cellule vegetali, tuttavia quando il tessuto vegetale contenente glucosinolati è danneggiato, come nel caso della preparazione (taglio, sminuzzamento, miscelazione) o della masticazione del cibo, viene rilasciata una β-tioglucosidasi chiamata mirosinasi. L'enzima è normalmente conservato, separatamente dai glucosinolati, in diverse cellule o in diversi compartimenti intracellulari, a seconda delle specie vegetali (Halkier e Gershenzon, 2006). L'idrolisi del glucosinolato da parte della mirosinasi produce una molecola di β-glucosio e un aglicone (parte non zuccherina) instabile. Lo spontaneo riarrangiamento di quest’ultimo intermedio comporta il rilascio di ione solfato e la formazione dei metaboliti, le cui strutture dipendono dalla natura della catena laterale (R) del glucosinolato, e dalle condizioni fisico-chimiche del mezzo, in particolare la presenza di un pH neutro favorisce la formazione di isotiocianati (ITC) (Lee et al., 2014). È importante sottolineare quindi che, non sono i glucosinolati i composti bioattivi nelle verdure crucifere, ma lo sono gli isotiocianati, i prodotti dell’idrolisi dei glucosinolati. In virtù delle proprietà biologiche associate ai glucosinolati e ai loro prodotti di degradazione, la comprensione delle vie di assorbimento di queste molecole e del loro metabolismo è di grande importanza.
Numerosi studi si sono focalizzati sulla comprensione dell'assorbimento e del metabolismo dei glucosinolati e dei loro prodotti di degradazione. Generalmente, ogni glucosinolato può
48 Figura 29: Riassunto del destino dei glucosinolati e dei loro prodotti di degradazione
nell'intestino umano.
contemporaneamente fornire diverse strutture di aglicone, tuttavia, come già detto precedentemente, la struttura del metabolita che si forma in misura maggiore dipende dalla catena laterale del glucosinolato di origine e dalle condizioni ambientali. È importante osservare che la cottura del materiale vegetale tende a denaturare la mirosinasi, l'intensità della denaturazione è particolarmente importante quando la temperatura applicata è alta e il tempo di cottura è lungo, sia cuocendo con acqua, che al vapore, o con il microonde (Getahun e Chung, 1999; Conaway et al., 2000; Rungapamestry et al., 2006; Rouzaud et al., 2004). Quando la mirosinasi è inattivata, i glucosinolati, a causa della loro natura idrofila, passano direttamente nel colon e qui vengono metabolizzati da parte del microbiota intestinale.
La Figura 29 mostra le porzioni del sistema gastrointestinale in cui i glucosinolati, e gli ITC sono assorbiti o metabolizzati. Per esempio, i glucosinolati intatti potrebbero essere già parzialmente assorbiti nello stomaco, i restanti transitano attraverso il tratto gastrointestinale per raggiungere l'intestino tenue dove possono essere idrolizzati da parte della mirosinasi e gli ITC possono essere così assorbiti. I restanti glucosinolati non idrolizzati transiteranno ulteriormente per raggiungere il colon dove potrebbero essere idrolizzati dalla mirosinasi batterica e i metaboliti ottenuti (ITC) vengono assorbiti e/o escreti.
49 Per quel che riguarda il metabolismo e l’escrezione invece, gli ITC assorbiti vengono coniugati con il glutatione nel fegato ed escreti nelle urine come acido mercapturico (Bheemreddy RM, Jeffery, 2007; Bollard et al., 1997; Mennicke et al., 1987; Ioannou et al., 1984). La formazione di acidi mercapturici è la via metabolica predominante nell’uomo, pertanto le quantità di acido mercapturico escrete rappresentano un buon riflesso della quantità di ITC consumati e possono essere usati come biomarcatori di assunzione e/o formazione di ITC nel corpo (Jiao et al., 1994; Shapiro et al., 2001). Il loro dosaggio urinario nell'uomo, ha dimostrato che la biodisponibilità degli ITC dipende dal contributo rispettivamente dell’enzima mirosinasi e del microbiota intestinale nell'idrolisi dei glucosinolati. Infatti, l'escrezione di acidi mercapturici, dopo il consumo di crucifere crude (mirosinasi attiva), rappresenta il 17-88% rispetto alla dose di glucosinolati ingeriti (la percentuale varia a seconda della pianta di origine: senape, cavolo, crescione, broccoli, ecc.) (Getahun e Chung, 1999; Conaway et al., 2000; Rouzaud et al., 2004; Jiao et al., 1994; Shapiro et al., 2001). Quando le verdure sono cotte (idrolisi da parte del microbiota intestinale), questa percentuale non supera il 20% e il picco dell’acido mercapturico nelle urine si verifica solo dopo 12 ore dall'ingestione, mentre invece appare entro 8 ore quando le verdure vengono consumate crude (Getahun e Chung, 1999; Rouzaud et al., 2004; Conaway et al., 1999). Tutti questi dati suggeriscono che il consumo di crocifere crude porta a una migliore biodisponibilità degli ITC.
Uno dei principali isotiocianati derivato dalle foglie di rucola, risulta essere il 4-(metiltio) butil isotiocianato (erucina o ER) (Cerny et al., 1996; Iori et al., 1999). L'isotiocianato ER è ottenuto dall'idrolisi enzimatica della glucoerucina, isolata per la prima volta negli anni '70 dai semi di Eruca sativa Mill., presenti ad alti livelli nelle specie di rucola, ma può essere anche ottenuto attraverso la riduzione in vivo dell'isotiocianato sulforafano (SF), che strutturalmente rappresenta il suo analogo ossidato (Gmelin, R.; Schluter, 1970; Kassahun et al., 1997). Il sulforafano è il principale componente bioattivo dei broccoli, è un ITC instabile immagazzinato dalla pianta come glucorafanina, l’enzima mirosinasi rilascia sulforafano quando la pianta viene schiacciata, tagliata o masticata (Matusheski et al., 2004).
50 Figura 30: Il 4-(metiltio) butil isotiocianato, erucina (ER), è un analogo ridotto del 4-(metilsolfinil) butil isotiocianato, sulforafano (SF) ed è formato sia da idrolisi enzimatica di glucoerucina, un glucosinolato trovato nelle specie di rucola (Eruca sativa Mill., Diplotaxis tenuifolia L.), sia dalla riduzione in vivo di SF, derivato dai broccoli (Brassica oleracea L.).
Figura 31: struttura chimica di erucina (a sinistra) e sulforafano (a destra).
La biodisponibilità di ER non è stata ancora studiata, tuttavia, ER e SF sono strutturalmente correlati: entrambi hanno una catena laterale alifatica che potrebbe supportare un simile destino farmacocinetico.
51 Il sulforafano, come altri ITC, è inizialmente sottoposto alla coniugazione enzimatica in vivo con il glutatione (GSH) che è catalizzata da glutatione transferasi (GST) (Juge et al., 2007). Tuttavia la velocità della reazione enzimatica degli ITC con GST è risultata differente anche tra composti strutturalmente simili, in particolare tra gli ITC presenti in natura che differiscono solo nello stato di ossidazione dell'atomo di zolfo inserito nella catena carboniosa, il SF sembra essere il substrato più povero per tutti e quattro gli isoenzimi della GST; al contrario, ER sembra essere il migliore, quindi la sua coniugazione con GSH si verifica più velocemente rispetto a quella del sulforafano (Kolm et al., 1995). Dopo la coniugazione con GSH, gli ITC vengono principalmente escreti sottoforma di acido mercapturico. È stato riportato che gli acidi mercapturici di ER e SF sono escreti nelle urine quattro ore dopo il consumo di rucola (biodisponibilità media ≈ 94%), ma quello che è interessante notare è che l'escrezione nelle urine di acido mercapturico è stata riportata anche dopo il consumo di altre verdure crucifere, come broccoli e cavoli sia rossi che bianchi che non contengono glucoerucina (Vermeulen et al., 2006). Infatti dopo il consumo di broccoli crudi, non contenenti glucoerucina, entrambi gli acidi mercapturici di ER e SF sono stati trovati nei campioni di urina dopo quattro ore con livelli di escrezione del 29% e 50% rispettivamente, in questo caso il livello di escrezione dell’acido mercapturico di ER era espresso come % della dose di glucorafanina (GLS da cui deriva SF). Questi risultati hanno dimostrato per la prima volta l'interconversione metabolica di SF in ER nell'uomo. In precedenza, questa reazione metabolica è stata dimostrata nei ratti, dove ER sembrava essere un importante prodotto metabolico di SF (Kassahun et al., 1997; Bheemreddy e Jeffery, 2007). Approssimativamente il 12% di una dose singola di SF, a seguito di somministrazione intraperitoneale (ip) nei ratti, veniva eliminato nelle urine (dopo 24 ore) come coniugati di N-acetilcisteina (NAC) di ER e il 67% di una singola dose di ER era eliminato come coniugati di SF. La reversibilità della biotrasformazione di riduzione dell'ossidazione dell'atomo di zolfo in ER e SF, è stata quindi dimostrata ed è stato osservato che l'ossidazione del solfuro in ER è una reazione metabolica più favorita rispetto alla riduzione del solfossido in SF (Kassahun et al., 1997). Dunque nonostante un'insufficiente conoscenza diretta del metabolismo di ER nell'uomo, l'interconversione in vivo di ER in SF e la loro somiglianza strutturale supportano l'ipotesi di un simile destino.
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Capitolo 2
Scopo della ricerca
La scoperta secondo la quale la funzione chimica “ISOTIOCIANATO” è una funzione in grado di rilasciare H2S in maniera lenta e graduale, e la successiva scoperta secondo la quale la funzione
isotiocianato è presente come metabolita secondario nelle piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae ha fatto sì che sempre maggiore interesse fosse rivolto alla caratterizzazione e allo studio di questi composti naturali. In particolare scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare il possibile impiego di isotiocianati H2S donors, nel trattamento di una patologia oggi
largamente diffusa, l’ipertensione.
Nello specifico, in questo lavoro sperimentale, sono stati presi in considerazione un estratto di semi di Eruca sativa Mill. (rucola) e il suo derivato isotiocianato erucina, sostanza quest’ultima in grado di rilasciare H2S in modo lento e costante; proprietà già evidenziata attraverso studi amperometrici
dal gruppo di ricerca presso cui è stato svolto il lavoro di tesi (Citi et al., 2014).
L’estratto di Eruca sativa Mill. in esame è caratterizzato da un alto contenuto di glucosinolati (GLS), in particolare risulta composto da:
95% di glucoerucina 5% di glucorafanina.
Da questi glucosinolati, per effetto dell’enzima mirosinasi, si ottengono gli ITC attivi, rispettivamente erucina e sulforafano, tra i quali è stato dimostrato esserci, nell’uomo, interconversione (Kassahun et al., 1997; Bheemreddy e Jeffery, 2007).
Lo scopo principale di questo studio sperimentale è stato quello di analizzare l’effetto di erucina ed estratto di Eruca sativa Mill. sulla regolazione della pressione arteriosa al fine di valutare il possibile valore nutraceutico-traslazionale di questi composti naturali nel trattamento della patologia ipertensiva. Lo studio di farmaci antiipertensivi impone al ricercatore di disporre di adeguati modelli sperimentali atti a mettere in evidenza le caratteristiche farmacologiche della molecola.
In particolare nel seguente studio sono stati considerati due modelli di ipertensione patologica: ipertensione farmacologica (indotta attraverso somministrazione di fenilefrina)
53 confrontati con ratti normotesi, ai fini di valutare come differenze nella patogenesi dell’ipertensione stessa potessero essere correlate ad una differente risposta ai composti H2S
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