la fase di estrazione del profilo genetico

L’estrazione del DNA rappresenta la seconda fase del processamento del campione biologico.

Per fase di estrazione del DNA si intende quell’insieme di protocolli che vanno ad “isolare “il materiale genetico dagli altri componenti cellulari presenti nel reperto in questione 57

Dopo aver scelto il campione biologico da cui estrarre il materiale genetico, il percorso di estrazione e purificazione prevede quattro fasi:

1. Lisi delle cellule. La dissoluzione della cellula (distruzione della membrana) è una fase delicata in quanto risultato di due eventi contrastanti: l’esigenza di frammentare il materiale di partenza e quella di non alterare gli acidi nucleici da analizzare. I metodi tradizionali di lisi si basano

57 _{SCARCELLA, Alessio(2009),prelievo del DNA e banca dati nazionale ,CEDAM}

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su trattamenti complessi che includono la digestione enzimatica, la solubilizzazione tramite detergente o tecniche meccaniche di spaccatura.

2. Inattivazione delle nucleasi cellulari.

3. Separazione e recupero dell’acido nucleico dalla soluzione contenente il lisato cellulare. Un primo metodo per effettuare tale operazione prevede l’uso di solventi organici (come fenolo o cloroformio), che consentono la separazione degli acidi nucleici dai contaminanti (proteine); successivamente, dopo centrifugazione, gli acidi nucleici vengono recuperati in soluzione acquosa. Sono stati ultimamente sviluppati protocolli chimici per la separazione e l’isolamento di frammenti di DNA realizzati in un singolo passaggio. Una seconda metodologia di separazione prevede l’adsorbimento del DNA sulla superficie di una matrice di gel di silice in presenza di sali caotropici (in commercio si trovano diversi kit di separazione basati su questo principio). 4. Precipitazione: avviene di solito in alcool etilico o isopropanolo e permette il recupero degli acidi nucleici in forma solida. Dopo lavaggio con etanolo, si ha una

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valutazione quali-quantitativa degli acidi nucleici estratti e quindi la loro conservazione.

Negli ultimi anni le metodologie classiche di separazione e purificazione effettuate in un laboratorio biochimico, sono state affiancate da nuove tecniche nel tentativo di rendere le procedure automatiche o realizzabili su dispositivi microfluidici integrati.

La fase di prelievo ed estrazione del DNA risulta essere nel caso dei reperti prelevati sulla scena del crimine estremamente delicata. Vanno infatti considerate, oltre le procedure di prelievo, le molteplici informazioni che le condizioni della scena del crimine presentano

Bisogna infatti tenere conto delle alterazioni che l’ambiente, la dinamica delittuosa o ancora l’intervento delle forze dell’ordine sui campioni di DNA in termini di inquinamento delle prove. Infatti a causa di sostanze inquinanti o inibitrici, di degradazione o di scarsità di materiale genetico, i campioni possono condurre a profili genetici parziali. All'interno della comunità scientifica forense persiste da anni una diatriba sull'attendibilità di tali profili genetici e sulla loro

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ammissibilità come prova scientifica. L'art 11 della legge 85/2009 impone l'adozione di uno standard internazionale nella procedura d'analisi e la certificazione dei laboratori incaricati di tipizzare i profili del DNA. A norma del comma 1 dell'articolo 11 “l'analisi del campione e del reperto biologico ai fini della tipizzazione del profilo del DNA, destinato all'inserimento nella banca dati nazionale del DNA, è eseguita sulla base dei parametri riconosciuti al livello internazionale e indicati dall'European Network of Forensic

Science Institutes (ENFSI),58 _{in modo da assicurare}

l'uniformità degli stessi”.

Anche i mitocondri contengono DNA, costituito però da un singolo cromosoma a struttura circolare a doppio filamento. Il

58 _{L'ENFSI nasce nel 1999, come estensione del Western European governmental}

forensic laboratories group (gruppo dei laboratori forensi dell'Europa occidentale), con la finalità di ideare direttive in grado di garantire pratiche comunemente accettate e riconosciute nel campo delle scienze forensi. L'ENFSI ha realizzato una serie di linee guida che tengono conto delle esperienze dei laboratori iscritti e delle indicazioni di buona pratica riconosciute dalla comunità scientifica internazionale che si occupa delle scienze forensi

58 _{La condizione di eteroplasmia può essere trasmessa da madre a figlia, sebbene non}

sia necessariamente conservata la proporzione tra i diversi genomi mitocondriali ed è conseguenza del fatto che, in fase di duplicazione cellulare (mitosi), i mitocondri si distribuiscono a caso nelle cellule fi glie, alterando la proporzione reciproca dei diversi genomi mitocondriali caratteristica della cellula madre. Ai fi ni forensi, pertanto, quest’aspetto del genoma mitocondriale determina una limitazione al suo utilizzo, dal momento che, ove presente, può determinare difficoltà interpretative. A tale proposito, occorre rilevare come il livello di eteroplasmia possa mostrare, nello stesso individuo, una variabilità tessuto-specifica.

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DNA mitocondriale può essere utile nei casi d’identificazione di cadaveri o di resti umani, la cui comparazione può essere fatta, in assenza del padre, con la presunta madre o fratelli/sorelle della vittima. In alcuni casi, però, le numerose molecole di DNA mitocondriale presenti nelle cellule umane possono non essere tra loro perfettamente identiche. Si tratta del fenomeno di eteroplasmia59_{, in altre parole la presenza in}

una stessa cellula di popolazioni mitocondriali aventi DNA differente anche per la sostituzione di una sola base azotata . In campo forense le applicazioni del DNA mitocondriale sono indicate quando si vogliono studiare individui imparentati in linea materna o l’analisi del DNA nucleare fallisce60_{. Il DNA}

mitcondriale è un punto fermo della sentenza Bossetti, appiglio della difesa come ben noto. I legali di Bossetti, infatti, chiesero di riaprire il procedimento con una perizia sul materiale genetico, istanza che non venne accolta dalla Corte d'Assise di Bergamo. Allo stesso tempo, la difesa chiederà

59 _{L'eteroplasmia è la presenza di più di un tipo di genoma organellare (DNA}

mitocondriale o DNA plastidico) all'interno di una cellula o individuo. È un fattore importante per considerare la gravità delle malattie mitocondriali. Poiché la maggior parte delle cellule eucariotiche contengono molte centinaia di mitocondri con

centinaia di copie del DNA mitocondriale, è comune per le mutazioni interessare solo alcuni mitocondri, lasciando la maggior parte inalterata.

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anche altri nuovi accertamenti, come quelli sulle fibre dei sedili del furgone dell'imputato che vennero ritenute compatibili con quelle trovate sul corpo

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