CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI
3.2 I METODI
3.2.7 LA SPETTROMETRIA DI MASSA
La spettrometria di massa consiste in un insieme di tecniche analitiche che consentono di determinare il peso molecolare di un composto sconosciuto ed ottenere informazioni sulla sua struttura chimica. La ionizzazione del campione allo stato di vapore può essere effettuata ricorrendo alla tecnica “Impatto Elettronico”: la sostanza, allo stato di vapore e a pressione sufficientemente bassa, è bombardata con un fascio di elettroni di elevata energia emessi da un filamento di tungsteno. La frazione di elettroni che non urta le molecole, è raccolta da una trappola di elettroni, mentre le
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molecole che non sono ionizzate sono allontanate dalla pompa ad alto vuoto. Solo le molecole ionizzate sono accelerate e convogliate verso l’analizzatore (Fig.11).
Tutti gli spettrometri di massa sono costituiti essenzialmente da tre parti:
Una camera di ionizzazione o sorgente: si usa la tecnica MALDI (Matrix Assisted Lased Desorption Ionization) in cui un breve e intenso raggio di luce ultravioletta (irradiazione con laser) induce la formazione di ioni molecolare protonati degli analiti.
Un analizzatore: alla tecnica MALDI viene associato un analizzatore a tempo di volo (TOF- Time of Flight). In pratica, gli ioni provenienti dalla sorgente, vengono accelerati da un forte campo elettrico, e percorrono l’analizzatore, che ha la forma di un tubo in cui è fatto un alto vuoto, in base alla velocità dovuta alla loro energia cinetica. Così gli ioni che hanno il rapporto m/z minore arriveranno al rivelatore prima di quelli più pesanti.
Un rivelatore: è formato da una serie di elettrodi che amplificano il segnale che è proporzionale al numero di ioni presenti; questi segnali elettrici sono registrati in funzione del rapporto m/z da parte di un sistema di elaborazione dati e li converte in uno spettro di massa costituito da picchi, a ciascuno dei quali un programma assegnerà un dato peso molecolare cui possono corrispondere più di una sequenza amminoacidica. Il peso molecolare viene poi confrontato con standard in laboratorio, per poter essere identificato.
57
CAPITOLO 4
RISULTATI E DISCUSSIONE
Le sindromi da deficienza di creatina sono un gruppo di patologie rare che includono disordini legati alla biosintesi della creatina (deficienza dell’enzima AGAT e/o GAMT) ed al suo trasporto, deficienza del trasportatore della creatina (CRTR-D). In particolare nel cervello il trasportatore della creatina è molto espresso e la sua deficienza porta ad effetti particolarmente gravi nello sviluppo con alterazioni nell’apprendimento e nella memoria, oltre che a comportamenti autistico simili.
L’esistenza di modelli animali preclinici sono mezzi cruciali per analizzare i meccanismi patogenetici e sviluppare nuove strategie terapeutiche. Anche per lo studio delle sindromi da deficit di creatina sono stati creati dei modelli murini in cui la delezione del gene del trasportatore ha portato a topi in cui manca il trasportatore della creatina sia a livello centrale che periferico e che mostrano il fenotipo cognitivo, valutato da test comportamentali, simile all’uomo.
Utilizzando topi KO per il trasportatore della creatina siamo andati, per la prima volta, a studiare la mappa proteomica dei mitocondri ottenuti dal cervello comparandola con quella ottenuta dai topi WT. Questo studio è nato in collaborazione con l’istituto di Neuroscienze del CNR di Pisa (Dott. Pizzorusso) che ha messo a punto i modelli murini con deficit del trasportatore di creatina.
Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di analizzare, utilizzando un approccio proteomico, i patterns proteici di mitocondri ottenuti da cervello di topi Wild Type e Knock out per il trasportatore della creatina. Utilizzando quindi l’analisi bidimensionale accoppiata alla spettrometria di massa è stato possibile identificare proteine mitocondriali che risultavano differenzialmente espresse dopo confronto dei pattern proteici nelle due condizioni prese in esame. Le proteine così identificate sono state analizzate tramite il programma Ingenuity Pathway al fine di ricercare le vie metaboliche e i fattori di trascrizione potenzialmente coinvolti in queste alterazioni.
Comprendere l’aspetto di una potenziale disfunzione mitocondriale è di particolare interesse e può offrire spunti nell’individuare potenziali bersagli terapeutici per questa patologia.
58
4.1 SEPARAZIONE DELLE PROTEINE MITOCONDRIALI
CON ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE E CONFRONTO
DEI PROFILI WILD-TYPE E KNOCK-OUT
I cervelli sono stati prelevati subito dopo il sacrificio degli animali di 30 giorni di età e processati per l’ottenimento delle preparazioni mitocondriali. Le proteine estratte dalla frazione mitocondriale, secondo quanto descritto in metodi, sono state sottoposte ad elettroforesi bidimensionale. In figura 1 A e B sono riportate delle immagini rappresentative del pattern proteico mitocondriale ottenuto da topi WT e KO.
Come prevedibile, c’è un’elevata omologia tra i profili proteici, ottenuti dalle due tipologie di topi. L’analisi dei gels condotta utilizzando il programma Same spot, ha portato all’individuazione di circa 2000 spots proteici. Dall’analisi comparativa condotta tra i gruppi KO e WT 55 spots risultano differenzialmente espressi in modo significativo e di questi 14 presentano entità di variazione > di 2. In tabella 1 è riportato il numero degli spots trovati differenzialmente espressi in modo significativo, l’entità della variazione, il p value ottenuto dall’analisi ANOVA e i volumi normalizzati degli spots
59
nelle due condizioni. Il volume riportato per ogni condizione è il valore medio ottenuto per tre animali ciascuno effettuato in doppio.
#
Anova (p)
Fold
KO
WT
2110
0,008
6,8
4284000
627800
2048
0,022
6,3
641200
101100
1823
0,017
5,3
1804000
338800
1994
0,025
4,2
878700
209900
2062
0,051
3,4
5103000
1490000
1285
0,029
2,9
47100
16070
2264
0,032
2,9
936400
321400
2306
0,004
2,9
621900
213200
2000
0,045
2,8
83400
29430
861
0,021
2,6
1474000
575300
543
0,023
2,2
445700
204100
1627
0,048
2,1
529300
255900
788
0,038
2
342000
175000
1150
0,041
2
96930
49490
1103
5,00E-03
1,90E+00
9,30E+04
4,95E+04
1434
3,70E-02
1,90E+00
2,26E+05
1,20E+05
1054
3,50E-02
1,80E+00
7,66E+05
4,27E+05
1115
4,50E-02
1,80E+00
6,41E+04
3,49E+04
1945
1,30E-02
1,80E+00
2,50E+05
1,39E+05
2309
5,10E-02
1,80E+00
2,44E+06
1,33E+06
1616
2,40E-02
1,70E+00
3,15E+05
1,81E+05
1784
1,00E-02
1,70E+00
2,27E+05
1,35E+05
2033
3,80E-02
1,70E+00
4,61E+05
2,71E+05
1181
7,74E-04
1,60E+00
6,47E+04
4,01E+04
1272
5,00E-03
1,60E+00
8,12E+04
4,95E+04
60
Tabella n°1: Spots differenzialmente espressi risultanti dal confronto tra KO e WT.
1562
4,80E-02
1,60E+00
1,87E+05
1,14E+05
1645
1,20E-02
1,60E+00
2,51E+05
1,60E+05
1692
4,70E-02
1,60E+00
1,01E+06
6,20E+05
1706
3,80E-02
1,60E+00
1,48E+05
9,47E+04
1711
4,70E-02
1,60E+00
1,65E+05
1,02E+05
1926
3,00E-02
1,60E+00
1,14E+06
6,94E+05
2016
2,50E-02
1,60E+00
6,90E+05
4,21E+05
2333
2,70E-02
1,60E+00
4,53E+05
2,90E+05
2356
2,30E-02
1,60E+00
3,77E+05
2,41E+05
1189
0,055
1,5
4,17E+05
2,86E+05
1307
4,50E-02
1,50E+00
3,68E+05
2,38E+05
1329
2,00E-02
1,50E+00
3,99E+05
2,75E+05
1389
1,60E-02
1,50E+00
1,68E+05
1,11E+05
1610
9,00E-03
1,50E+00
1,05E+06
7,08E+05
1675
4,80E-02
1,50E+00
2,53E+05
1,73E+05
1728
1,90E-02
1,50E+00
1,14E+05
7,40E+04
2007
4,00E-02
1,50E+00
5,85E+05
3,89E+05
634
3,70E-02
1,40E+00
6,92E+05
5,04E+05
799
2,40E-02
1,40E+00
1,07E+06
7,42E+05
962
2,20E-02
1,40E+00
5,21E+05
3,76E+05
1288
3,30E-02
1,40E+00
1,00E+05
6,99E+04
1653
2,30E-02
1,40E+00
4,46E+05
3,25E+05
1789
4,00E-03
1,40E+00
5,41E+04
3,97E+04
706
8,00E-03
1,30E+00
1,42E+06
1,06E+06
1153
4,20E-02
1,30E+00
3,13E+05
2,47E+05
1225
1,80E-02
1,30E+00
6,80E+05
5,15E+05
660
3,20E-02
1,20E+00
1,25E+06
1,02E+06
772
3,90E-02
1,20E+00
5,28E+05
4,37E+05
61
In figura 2 è riportato l’istogramma degli spots che presentano fold di variazione > di 2. Da notare che per tutti questi spots si riscontra un aumento nel caso del KO rispetto al WT.
Fig.2: Istogramma degli spots che presentano fold di variazione >2
4.2 ANALISI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA
Gli spots di interesse sono stati quindi processati per ottenere l’identificazione proteica tramite spettrometria di massa.
Quest’analisi è stata condotta presso l’Università G. D’Annunzio di Chieti-Pescara (Dott. Maurizio Ronci). In tabella 2 sono riportate le identificazioni ottenute per gli spots di interesse, il peso molecolare, il punto isoelettrico e i parametri di massa quali score e numero di peptidi che danno una misura della bontà dell’identificazione ottenuta.
Le proteine mitocondriali che risultano up-regulated appartengono alla catena respiratoria (proteina ferro-zolfo 4 della NADH deidrogenasi, subunità 8 del sottocomplesso alfa della NADH deidrogenasi 1, sub unità 5B della citocromo C ossidasi, sub unità 7A2 della citocromo C ossidasi, sub unità e dell’ATP sintasi, la subunità flavoproteica della succinato deidrogenasi, la sub unità MIC13 del complesso MICOS)
62
Cytochrome c oxidase subunit 5B mitochondriale, Cytochrome c oxidase subunit 7A2 mitochondriale, ATP synthase subunit e mitochondriale, Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit mitochondriale, MICOS complex subunit MIC13) ed allo stress ossidativo come la peroxiredoxina 5 e la glutatione S-transerasi A4.Il notevole incremento evidenziato nei topi KO delle proteine coinvolte nella produzione dell’energia sembrano essere collegate all’alterata disponibilità del sistema di riserva della creatina fosfato in quanto la creatina non viene trasportata nelle cellule neuronali a causa del deficit del trasportatore e si richiede quindi una maggiore disponibilità di ATP. L’elevata attività ossidativa a sua volta spiega l’aumento dei sistemi coinvolti nel controllo dello stress ossidativo e quindi l’aumento di proteine quali la perossiredossina 5. I nostri risultati sono in accordo con quelli evidenziati da Perna e collaboratori che ipotizzano insieme ad un aumento dell’attività degli enzimi anche un aumento nel numero dei mitocondri [52].
Tabella n°2: Identificazioni degli spots di interesse.
KO vs WT score mass matchesaverage massth pI
P40142 TKT_MOUSE Transketolase ↑ 1,2 268 68272 14 67630 7.23
Q8K2B3 SDHA_MOUSE Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial ↑ 1,2 59 73623 2 72585.40 7.06
Q60864 STIP1_MOUSE Stress-induced-phosphoprotein 1 ↑ 1,3 300 63170 13 62582.11 6.4
P63038 CH60_MOUSE 60 kDa heat shock protein, mitochondrial ↑ 1,3 957 61088 39 60955.49 5.91
Q8K183 PDXK_MOUSE Pyridoxal kinase ↑ 1,3 36 35278 1 35015.19 5.88
Q9CY64 BIEA_MOUSE Biliverdin reductase A ↑ 1,5 131 33675 4 33524.52 6.53
P17751 TPIS_MOUSE Triosephosphate isomerase ↑ 1,6 296 32684 7 32191.76 5.56
Q60932 VDAC1_MOUSE Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 ↑ 1,2 309 32502 7 32351.49 8.55
P20108 PRDX3_MOUSE Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial ↑ 1,4 99 28337 4 28127.03 7.15
P24472 GSTA4_MOUSE Glutathione S-transferase A4 ↑ 1,7 55 25547 4 25563.87 6.77
Q60692 PSB6_MOUSE Proteasome subunit beta type-6 ↑ 2,1 87 25591 2 25378.74 4.97
Q9CXZ1 NDUS4_MOUSE NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 4, mitochondrial ↑ 5,3 68 19829 2 19784.69 10
Q9DCJ5 NDUA8_MOUSE NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 8 ↑ 5,3 60 20435 3 19992.07 8.76
P99029 PRDX5_MOUSE Peroxiredoxin-5, mitochondrial ↑ 1,8 127 22226 4 21897.46 9.1
Q05816 FABP5_MOUSE Fatty acid-binding protein, epidermal ↑ 1,5 64 15470 3 15137.40 6.14
P70349 HINT1_MOUSE Histidine triad nucleotide-binding protein 1 ↑ 1,6 89 13882 2 13776.90 6.36
P19536 COX5B_MOUSE Cytochrome c oxidase subunit 5B, mitochondrial ↑ 1,7 24 14089 1 13812.87 8.69
P10639 THIO_MOUSE Thioredoxin ↑ 1,7 64 12010 2 11675.44 4.8
Q9D855 QCR7_MOUSE Cytochrome b-c1 complex subunit 7 ↑ 3,4 170 13519 8 13527.47 9.1
Q06185 ATP5I_MOUSE ATP synthase subunit e, mitochondrial ↑ 6,8 362 8230 11 8235.60 9.34
P48771 CX7A2_MOUSE Cytochrome c oxidase subunit 7A2, mitochondrial ↑ 2,9 60 9285 1 9290.89 10.28
Q8R404 MIC13_MOUSE MICOS complex subunit MIC13 ↑ 2,7 20 13422 1 13373.45 8.69
63
4.3 ANALISI MEDIANTE INGENUITY PATHWAY
Al fine di comprendere come l’alterazione di queste proteine potesse indurre attivazione od inibizione di fattori di regolazione e quindi avere un’idea delle vie di segnale coinvolte in quest’alterazione, abbiamo condotto un’analisi utilizzando il programma Ingenuity Pathway (IPA).
In questo tipo di analisi le proteine trovate differenzialmente espresse con i loro fold di variazione vengono inserite e analizzate per definire potenziali network funzionali. Il network originato dall’analisi con score 31 è risultato “Patologie dello sviluppo, patologia ereditaria, patologia
metabolica”. In figura 3 è riportato il network ottenuto; da notare come il complesso mitocondriale-
64
Fig.3: Subunità della citocromo ossidasiche risultano nodi principali del network.
L’analisi ha evidenziato inoltre che l’incremento delle proteine è la conseguenza dell’attivazione e/o dell’inibizione significativa di fattori di regolazione a monte. Tra questi NFE2L2 (+2.19) e MYC (+2.18) risultavano attivati mentre RICTOR (-2.43) risultava inibito. In tabella 3 sono riportati i fattori
65
di trascrizione, il p value dell’attivazione e dell’inibizione e le proteine che concorrono a determinare questo effetto.
RICTOR INHIBITED -2,433 9,06E-08 Cox5b, COX7A2, FABP5,
NDUFA8,
PSMB6, UQCRB
NFE2L2
TRANSCRIPTION REGULATOR
ACTIVATED 2,195 0,0000232 Gsta4, PSMB6 STIP1, TPI1, TXN MYC TRANSCRIPTION REGULATOR ACTIVATED 2,187 0,000245 FABP5, HSPD1 PRDX3, TKT, TPI1, TXN
Tabella n°3:Fattori di trascrizione coinvolti, il p value dell’attivazione e dell inibizione e le proteine che concorrono a determinare questi effetti.
4.4 CONCLUSIONE
In conclusione questo lavoro di tesi suggerisce come una visione di insieme delle alterazioni delle proteine mitocondriali cerebrali ottenuta tramite analisi proteomica possa dare importanti indicazioni sia sulla validità del modello murino di deficit del trasportatore della creatina sia sull’eventuale possibilità di utilizzare farmaci che controllino l’attività alterata delle proteine mitocondriali.
66
BIBLIOGRAFIA
[1] Guerrini R, Masi G, Toniolo D. Ritardo mentale non sindromico. Malattie genetiche. Piccin 651-662, 2005.
[2] Stevenson RE, Procopio-Allen AM, Schoer RJ, Collins JS. Genetics syndromes among individuals with mental retardation. Am J Med Genet. 123A, 29-32, 2003.
[3] American Association on Mental Retardation. Mental Retardation: Definition, Classification, and Systems of Supports. 10th edn. Washington, 2002.
[4] Stevenson RE, Schwartz CE, Schroer RJ. X-linked mental retardation. New York: Oxford University Press,2000.
[5] Stevenson RE, Schwartz CE. Clinical and molecular contributions to the understanding of X- linked mental retardation. Cytogenet Genome Res 99, 265-275, 2002.
[6] Penrose L. A clinicaland genetic study of 1280 cases of mental defect, vol 229. London: HMSO, 1938.
[7] Lehrke R. Theory of X-linkage of major intellectuals traits. Am J Mental Defic. 76, 611-619, 1972.
[8] Martin J, Bell J. A pedigree of mental defect showing sex-linkage. J Neurol Psychiatry. 6, 154-157, 1943.
67
[9] Ropers HH, Hoeltzenbein M, Kalscheuer V, Yntema H, Hamel B, Frynes JP, Chelly J, Partington M, Gecz J, Moraine C. Nonsyndromic X-linked mental retardation. Trends Genet 19, 316-320, 2003.
[10] Balsom et al. Creatine in humans with special reference to creatine supplementation. Sports Med. 4, 268-280, 1994.
[11] M. Wyss, O. Braissant, I. Pischel, G.S. Salomons, A. Schulze, S. Stockler, T. Wallimann. Creatine and creatine kinase in health and disease. 2007.
[12] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[13] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[14] Jiddeke M. van de kamp, G. M. Mancini, G. S. Salomons. X-linked creatine transporter deficiency: clinical aspects and pathophyfiolosy. 2014.
[15] Jiddeke M. van de kamp, G. M. Mancini, G. S. Salomons. X-linked creatine transporter deficiency: clinical aspects and pathophyfiolosy. 2014.
[16] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[17] M. Wyss, O. Braissant, I. Pischel, G.S. Salomons, A. Schulze, S. Stockler, T. Wallimann. Creatine and creatine kinase in health and disease. 2007.
68
[18] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[19] Holtzman D, McFarlanc E, Moerland T, Koutcher J, Kushmerick MJ and Neuringer LJ. Brain creatine phosphate and creatine kinase in mice fed an analogue of creatine. Brain Research 483, 68-77, 1989.
[20] Wallimann T, Wyss M, Brdiczka D, Nicolay K. Intracellular compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes in tissues with high and fluctuating energy demands:the ’phosphocreatine circuit’ for cellular energy homeostasis. Biochem J 281, 21- 40, 1992.
[21] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[22] Arias-Dimas A, Vilaseca MA, Artuch R, Ribes A, Campistol J Diagnóstico y tratamiento de los síndromes de deficiencia de creatina cerebral. Rev Neurol 43 (5), 302-308, 2006.
[23] Item BC, Stöckler-Ipsiroglu S, Stromberger C, Mühl A, Alessandrì MG, Bianchi MC, Tosetti M, Fornai F and Cioni G. Arginine: Glycine Amidinotransferase Deficiency: the third inborn error of creatine metabolism in man. Am J Hum Genet, 69, 1127-1233, 2001.
[24] Stöckler S, Holzbach U, Hanefeld F, Marquardt I, Helms G, Requart M, Hanicke W, Frahm J. Creatine deficiency in the brain: a new, treatable inborn error of metabolism. Pediatric Research, 36, 409-413, 1994.
[25] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
69
[26] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[27] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[28] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[29] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[30] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[31] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[32] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[33] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
70
[34] Rosenberg EH, Almeida LS, Kleefstra T, deGrauw RS, Yntema HG, Bahi N, Moraine C, Ropers H, Fryne J, deGrauw TJ, Jakobs C, Salomons GS. High prevalence of SLC6A8 deficiency in X-linked mental retardation. Am J Hum Genet 75, 97-105, 2004.
[35] Jiddeke M. van de kamp, G. M. Mancini, G. S. Salomons. X-linked creatine transporter deficiency: clinical aspects and pathophyfiolosy. 2014.
[36] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[37] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[38] Verhoeven NM, Salomons GJ, Jakobs C Laboratory diagnosis of defects of creatine biosynthesis and transport Clinica Chimica Acta 361, 1-9, 2005.
[39] Danielsen ER, Ross B. Magnetic resonance spectroscopy diagnosis of neurological diseases. Marcel Dekker AG ed. New York (USA): Marcel Dekker Inc. 1999.
[40] Carducci Cl, Birarelli M, Leuzzi V, Carducci C, Battini R, Cioni G, Antonozzi I. Guanidinoacetate and creatine plus creatinina assessment in physiologic fluids: an effective tool for the biochemical diagnosis of arginine: glycine amidinotransferase and guanidinoacetate methyltransferase deficiencies. Clin Chem 48(10), 1772-1778, 2002.
[41] Salomons GJ, van Dooren SJM, Verhoeven NM, Cecil KM, Ball WS, DeGraw TJ, Jacobs C. X-linked creatine transporter (SLC6A8 gene) defect: a new creatine deficiency syndrome. Am J Hum Genet 68, 1497-1500, 2001.
[42] Sykut-Cegielska J, Gradowska W, Mercimek-Mahmutoglu S, StöcklerIpsiroglu S. Biochemical and clinical characteristics of creatine deficiency syndromes. Acta Biochimica Polonica 51 (4), 875-882, 2004.
71
[43] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[44] Allison L.A. Fondamenti di biologia molecolare. Zanichelli, 2008.
[45] http://www.treccani.it/enciclopedia/gene-wild-type_(Dizionario-di-Medicina)/
[46] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[47] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[48] M. J. Curt, P. Voicu, M. Fontaine, A.Dessein, N. Porchet, K. Mention-Mulliez, D. Dobbelaere, G. Soto-Ares, D. Cheillan, J. Vamecq. Creatine byosynthesis and trasport in health and disease. Biochimie 199, 146-165, (2015).
[49] http://w3.uniroma1.it/biocmed2/elettive/Appunti%20Scienza%20del% 20proteoma.pdf;
[50] Godovac-Zimmermann J, Soskic V, Poznanovic S, Brianza F. “Functional proteomics of signal transduction by membrane receptors”. Electrophoresis 1999; 20 (4-5): 952-96.
[51] Beasley CL, Pennington K, Behan A, Wait R, Dunn MJ, Cotter D: Proteomic analysis of the anterior cingulate cortex in the major psychiatric disorders: evidence for disease-associated changes. Proteomics 2006; 6:3414– 3425.
[52] M.K. Perna, A.N. Kokenge, K.N. Miles, K.C. Udobi, J.F. Clark, G.J. Pyne-Geithman, Z. Khuchua, M.R. Skelton. Creatine transporter deficiency leads to increased whole body and cellular metabolism, 2016.
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RINGRAZIAMENTI
Il primo ringraziamento va a ai miei genitori che mi hanno permesso e dato la possibilità di vivere quest’avventura all’Università di Pisa, che mi sono sempre stati vicini e che mi hanno incoraggiato a non mollare mai.
Ringrazio la prof.ssa Mazzoni (la mia relatrice) che mi ha accettata come tesista e che mi ha trasmesso la passione per questo lavoro; ringrazio il prof. Lucacchini (il mio correlatore) e la dott.ssa Laura Giusti per aver seguito il mio lavoro di tesi. Ringrazio le ragazze del laboratorio che mi hanno insegnato come muovere i primi passi in laboratorio e per avermi aiutato utilizzare i vari strumenti. Desidero ringraziare i miei cugini Chiara e Michele che mi fanno da “fratelli maggiori” per avermi supportato e sopportato in questa mia avventura, per i loro innumerevoli consigli su come “sopravvivere” nel mondo universitario e per avermi incoraggiato a non arrendermi, ma a migliorare sempre.
Ringrazio il mio tutor Paolo e tutti i farmacisti incontrati durante il tirocinio che mi hanno tenuta con loro per sei mesi, insegnandomi i “trucchi del mestiere” e che mi hanno messo alla prova con il mondo del lavoro. Un ringraziamento speciale va a Beatrice per avermi aiutata quando ero in difficoltà. Desidero ringraziare con tutto il cuore e l’affetto possibile le persone che mi hanno sopportato e aiutato in questi anni universitari, dalle mie colleghe e amiche Filomena, Silvia, Valentina, Giulia e Carla per arrivare a Giovanni e Maria Giulia. Un enorme ringraziamento a Matteo per avermi aiutata ogni volta che ero in difficoltà con gli studi e per i suoi preziosi consigli su come affrontare al meglio gli esami.