Le gelatinasi

Le gelatinasi (chiamate anche collagenasi di tipo IV), sono molecole caratterizzate da un’elevata efficienza proteolitica nei confronti della gelatina (collageni denaturati) e sono ritenute implicate in una varietà di processi patologici quali la proliferazione tumorale e la formazione di metastasi (Stetler- Stevenson et al., 1993).

Attualmente sono conosciute due gelatinasi, la MMP-2 (gelatinasi-A) e la MMP-9 (gelatinasi-B) che, rispetto alle altre MMPs, hanno una sequenza aggiuntiva inserita in un loop del dominio catalitico; questa sequenza assume la conformazione di tipo II trovato nella fibronectina che permette lo svolgimento e la completa degradazione della tripla elica di collagene (Figura 6.5 e 6.6).

L

Figura 6.6: Struttura della MMP-9

Figura 6.5 : Struttura cristallografica della pro-MMP-2; in rosa dominio fibronectin-like, in viola dominio haemopexin-like, in giallo dominio catalitico, in verde propeptide

110 La MMP-2 è una proteina di 72 kDa non glicosilata che nel siero circola come monomero, mentre la MMP-9 ha un peso molecolare di 92 kDa e contiene 2 siti N-glicosilati nel pro-peptide e nel dominio catalitico oltre ad alcuni glicani O- linked; nel plasma circola come monomero o complessata con la lipocalina 2 formando dimeri e/o multidimeri che prendono il nome di neutrophil gelatinase- associated lipocalin (NGAL).

Le due gelatinasi differiscono per il peso molecolare e possono essere distinte anche per la differente efficienza nel degradare la gelatina (maggiore per la MMP-2). In generale l’efficienza proteolitica delle gelatinasi è influenzata dalla variazione del pH: l’optimum per l’attività catalitica si ha a pH 8.5, mentre a pH inferiore a 6.5 l’enzima risulta estremamente instabile. La specificità dei substrati delle MMP-2 e -9 è simile ma non identica: alcuni substrati mostrano una selettività verso MMP-2 di circa 200 volte maggiore rispetto alla MMP-9. La differenza nella specificità dei substrati è stata attribuita al subsito S2 del sito catalitico, dove la MMP-9 contiene acido aspartico e la MMP-2 contiene acido glutammico (Chen et al., 2003).

La MMP-2, ma non la MMP-9, digerisce il collagene tipo I, II e III allo stesso modo delle collagenasi. L’attività della MMP-2 in soluzione è molto più debole di quella della MMP-1 (collagenasi 1), tuttavia, siccome la pro-MMP-2 è reclutata alla superficie cellulare ed è attivata dalle metalloproteinasi di membrana, è probabile che la MMP-2 possa esprimere una ragionevole attività litica sulla/o vicino alla superficie cellulare. La MMP-2 intracellulare dei cardiomiociti digerisce la troponina I, la catena leggera della miosina e la poly(ADPribose) polimerasi (PARP).

111 La presenza del dominio fibronectin-like conferisce alle gelatinasi la capacità di interagire con diverse macromolecole della matrice; oltre alla gelatina, prodotto di degradazione delle molecole di collagene, le gelatinasi processano infatti altre molecole presenti nella matrice extracellulare, tra queste vanno ricordate l’elastina, la laminina, la fibronectina e gli aggrecani.

I substrati delle gelatinasi, inoltre, comprendono anche proteinasi, proteinasi inibitori, fattori della coagulazione, molecole chemotattiche, fattori di crescita latenti, proteine leganti i fattori di crescita, recettori di membrana, molecole di adesione ed anche substrati intra-cellulari. Le gelatinasi, ed in particolar modo la MMP-2, possono inoltre degradare diversi tipi di collagene nativo sia di tipo fibrillare che di tipo non fibrillare: collagene I, V e VII. E’ utile sottolineare che a 25°C, come la collagenasi MMP-1, la MMP-2 è in grado di tagliare la molecola nativa di collagene in due frammenti rispettivamente ¼ e ¾ della lunghezza della molecola nativa (Aimes & Quigley, 1995). Le gelatinasi A e B tagliano preferenzialmente l’elastina ed un numero di legami peptidici nel

112 collagene denaturato di vari tipi (IV, V, VII e X) producendo piccoli peptidi di degradazione (Kähäri & Saarialho-Kere, 1997).

La regolazione della espressione delle due gelatinasi è diversa (Huhtala et al., 1991). La MMP-2 è costituzionalmente espressa con pochi e modesti meccanismi di down e -up regulation nelle varie condizioni. La MMP-9 è altamente inducibile ed è sotto il controllo dei fattori crescita, chemiochine ed altri segnali stimolatori.

Le MMPs 2 e 9 sono presenti in differenti cellule e tessuti. La MMP-2 è stata identificata in fibroblasti cutanei, cheratinociti, condrociti, cellule endoteliali, monociti, osteoblasti (Birkedal-Hansen et al., 1993). Esperimenti in vivo su topi knockout per i geni delle gelatinasi hanno prodotto animali caratterizzati da ridotta capacità angio-genetica e ridotta crescita tumorale primaria e con un modesto ritardo nell’accrescimento (Itoh et al., 1998). La MMP-9 è prodotta dai cheratinociti, fibroblasti, osteoclasti, condrociti, cellule satelliti muscolari scheletriche, cellule endoteliali, monociti, macrofagi, linfociti, neutrofili, mastociti e da numerose cellule tumorali (Birkedal-Hansen et al., 1993); svolge un ruolo fondamentale nella crescita delle ossa, infatti la condizione knockout per il gene della MMP-9 nel topo induce ritardo nella vascolarizzazione ed ossificazione ed un anomala crescita delle ossa piatte dello scheletro (Vu et al., 1998).

Una serie di studi hanno mostrato come alcune molecole, presenti in estratti vegetali, sono in grado di ridurre l'attività di alcune metalloproteasi ed in

113 particolare della gelatinasi (Ahmed et al., 2006; Kim et al., 2008). Queste molecole, polifenoli presenti nel tè verde, interagiscono selettivamente con la matrice extracellulare influenzando positivamente le caratteristiche funzionali della stessa. Tutti gli studi effettuati utilizzando sia i polifenoli che i loro precursori, come l' epigallocatechingallato (EGCG), hanno confermato sia lo spiccato tropismo degli stessi nei confronti della matrice extracellulare e delle molecole presenti nella matrice, sia l'attività inibitoria nei confronti delle gelatinasi, tra cui la MMP-2. Inoltre dati preliminari indicano che l'EGCG blocchi l’attività gelatinolitica dei fibroblasti sinoviali colpiti da artrite reumatoide inibendo l’attivazione della protein chinasi C e di NF-kB (Ahmed et al., 2006).

Entrambe le gelatinasi sono coinvolte in molti processi fisiologici e patologici. Sono richieste nei processi invasivi durante la riproduzione, crescita, sviluppo, mobilitazione dei leucociti, infiammazione, rimarginazione delle ferite e angiogenesi. L’aumento dell’attività delle gelatinasi è stata osservata nelle infiammazioni, nelle malattie infettive, nei processi degenerativi del cervello, nelle malattie vascolari. Recenti studi hanno dimostrato che: a) la MMP-2 è coinvolta nelle disfunzioni cardiache e b) la MMP-9 ha un ruolo protettivo nei processi di aterosclerosi, limitando la crescita delle placche ed aumentandone così l’instabilità (Nagase et al., 2006). La MMP-2 e la MMP-9 sono coinvolte in molte tappe dello sviluppo e della progressione tumorale: crescita del tumore primario, angiogenesi, fuoriuscita ed attraversamento dei vasi delle cellule neoplastiche, migrazione, invasione delle cellule metastatiche nell’organo secondario, inizio e mantenimento della crescita tumorale nel sito metastatico (Egeblad & Werb, 2002; Turpeenniemi-Hujanen, 2005). Le gelatinasi possono anche sopprimere la

114 progressione tumorale agendo, con taglio proteolitico, su molti substrati bioattivi: l’effetto finale, quindi, dipende in larga misura dal contesto generale del microambiente che promuove la trasformazione maligna.

In generale la MMP-2 e la MMP-9 sono sintetizzate da cellule tumorali ed anche dallo stroma. Si ritiene che le cellule tumorali possano stimolare le cellule stromali della neoplasia a sintetizzare le gelatinasi in modo paracrino attraverso la secrezione di interleuchine, interferone e fattori di crescita. Dopo la secrezione locale le gelatinasi possono raggiungere il torrente circolatorio e ritrovarsi nei vari liquidi biologici.

115 Il potenziale immunologico della molecola HP-NAP, accertato da studi in vitro, merita una ricerca sperimentale preclinica in modelli animali, allo scopo di iniziare la valutazione dell’efficacia, della sicurezza e dell’utilità di questa molecola di origine batterica anche in vivo. L’uso di un modello animale di risposta Th2 rappresenta un opportuno mezzo in cui cimentare l’azione immunomodulante di HP-NAP. A seguito di queste premesse, la tesi, oggetto del Dottorato di ricerca in Microbiologia e Genetica che ho frequentato, si prefigge lo scopo di indagare l’efficacia immunomodulante della molecola HP-NAP, prodotta dal batterio Helicobacter pylori, in un modello elmintico di risposta Th2, indotto dall’infezione del parassita Trichinella spiralis. La scelta di un modello sperimentale Th2 alternativo al classico modello murino di asma indotto dall’ovalbumina aggiunge al disegno sperimentale un interesse parassitologico. Infatti, tale approccio consente di ottenere una doppia valenza di analisi perchè oltre a valutare l’azione di HP-NAP all’interno di un organismo vivente e verificarne l’eventuale immunomodulazione riscontrata dagli studi in vitro, anche in vivo, fornisce allo stesso tempo una nuova prospettiva d’indagine del rapporto ospite-parassita sperimentalmente modulato.

I mezzi di indagine che hanno permesso di approfondire lo studio di HP- NAP in vivo si basano principalmente su test immunologici come i dosaggi delle citochine di risposta Th1 e Th2, ma anche conte leucocitarie per seguire le variazioni dei polimorfonucleati e il time course d’azione della molecola. Inoltre il dosaggio della metalloproteasi 9 plasmatica fornisce un indice di migrazione

116 leucocitaria transendoteliale utile a valutare l’azione chemiotattica di HP-NAP nel sistema animale. In aggiunta, i sistemi cellulari ex-vivo sono risultati cruciali nello stabilire i target cellulari d’azione della molecola e il recettore coinvolto nella via di trasmissione del segnale, oltre ad essere stati impiegati per confermare lo shifting immunologico indotto da HP-NAP. Dal fronte parassitologico, le colorazioni istologiche e gli esperimenti di immunoistochimica hanno caratterizzato l’infiltrato infiammatorio a livello muscolare mentre le valutazioni del carico parassitario hanno aiutato a capire l’influenza dell’adiuvante Th1 nel ciclo vitale del parassita.

Questo disegno sperimentale, svolto secondo tale ottica d’indagine, servirà ad accreditare la molecola HP-NAP nella realizzazione di un futuro e possibile uso terapeutico nelle malattie Th2 mediate e nella formulazione dei vaccini, oltre a mettere in luce nuovi aspetti immunologici nella relazione ospite-parassita nella trichinellosi sperimentale.

117

Animali

Topi femmine BALB/c di sei settimane di vita, provenienti dai laboratori HARLAN (Italia), sono stati acclimatati per circa una settimana presso lo stabulario della Scuola Medica dell’Università di Pisa prima dell’inizio degli esperimenti. Gli animali hanno iniziato la sperimentazione in accordo alle vigenti regole locali e nazionali. Un esperimento pilota, infettando 10 animali con T. spiralis, ha permesso di stabilire l’andamento dei parametri Th2 (eosinofili ed IgE) in corso di trichinellosi nel nostro modello sperimentale in base ai quali decidere i tempi di somministrazione dell’adiuvante batterico. I topi infetti sono stati divisi in due gruppi: uno di controllo, i cui animali hanno ricevuto 0.5 ml di tampone fosfato salino (PBS) per via intraperitoneale in corrispondenza del 10° e 28° giorno dall’infezione sperimentale, ed un secondo gruppo dove gli animali sono stati trattati nei medesimi giorni con una dose intraperitoneale di HP-NAP di 10 µg in 0.5 ml. Tale protocollo sperimentale è stato ripetuto tre volte interessando un totale di 45 animali per gruppo sperimentale. Altri esperimenti sono stati improntati sui meccanismi molecolari coinvolti negli effetti di HP-NAP utilizzando 10 animali per gruppo così divisi in base al trattamento somministrato loro al 10° e 28° giorno dall’infezione: (1) proteina di controllo (isotipo IgG2b si ratto, 30 µg); (2) HP-NAP (10 µg) più IgG2b di ratto (30 µg); (3) HP-NAP (10 µg) più anticorpo monoclonale di ratto isotipo IgG2b anti-TLR2 (30 µg); (4) solo anticorpo anti-TLR2 (30 µg). Inoltre due gruppi di 10 animali ciascuno hanno ricevuto nei suddetti giorni 10 µg di lipohexapeptide tripalmitoyl-S-glyceryl-Cys-

118 Ser-4(Lys) (PAM3) più IgG2b di ratto (30 µg) o Pam3 (10 µg) più anti-TLR2 antibody (30 µg).

Al giorno 0 e durante il corso dell’infezione ( 7, 14, 28 e 42 poi) gli animali sono stati sottoposti a prelievi di sangue periferico dal plesso venoso retrorbitale, mediante pipetta Pasteur, precedentemente eparinata. Il sangue è stato quindi o strisciato su vetrino portaoggetti per la valutazione della formula leucocitaria o raccolto in provette Eppendorf per la conta dei leucociti totali o per essere centrifugato per la raccolta del plasma che è stato stoccato a -20°C fino al momento dell’impiego.

Gli animali di controllo ed i trattati non hanno presentato differenze ponderali durante il corso degli esperimenti. Al 42° giorno poi i topi sono stati sacrificati in anestesia profonda con etere etilico; un frammento della lingua è stato prelevato e sottoposto alle procedure istologiche mentre la restante carcassa di ciascun animale è stata digerita per la valutazione del carico parassitario. Rene, fegato e polmone di alcuni animali sono stati prelevati per la valutazione istologica di eventuali processi patologici a seguito dei trattamenti.

Parassita

Larve muscolari di T. spiralis (codice ISS003) sono state ottenute dalla digestione artificiale in soluzione cloridro-peptica (1% HCl e pepsina) di topi precedentemente infettati da almeno 40 giorni e risospese in PBS per la conta al microscopio ottico, secondo il metodo consueto nel nostro laboratorio (Bruschi et al., 1992). L’infezione sperimentale dei topi è stata ottenuta somministrando 350 larve muscolari in 0,5 ml di PBS per animale usando una sonda esofagea.

119 L’antigene E/S di T. spiralis è stato ottenuto con la messa in coltura delle larve muscolari subito dopo il loro isolamento: le larve sono state lavate 3 volte in PBS e coltivate in vitro in terreno RPMI 1640 (Sigma- Aldrich, St Louis, Mo), addizionato con L-glutammina (2mM) e antibiotico streptomicina (500 µg/mL), a 37° C in una atmosfera al 5% di CO2. Dopo 18 ore di coltura il surnatante è stato

raccolto e passato in colonna PD-10 (Amersham Biosciences, Europa, Freiburg, Germania) per concentrare le proteine contenute in PBS. La concentrazione degli antigeni E/S di T. spiralis è stata valutata dalla misura dell’assorbanza a 280 nm allo spettrofotometro Varian Cary Bio 50, rapportato ad una curva di calibrazione con albumina.

La biotinilazione dell’E/S è stata effettuata come descritto precedentemente da Takamoto et al. (2001); gli antigeni E/S del parassita (4 mg/ml), risospesi in bicarbonato di sodio a pH 8,5, hanno reagito per due ore a temperatura ambiente con biotin N-hydroxysuccinimide ester (Vector Laboratories, Burlingame, Calif), solubile in acqua. L’aggiunta di 10 mg di glicina ha arrestato la reazione di biotinilazione. Successivamente l’E/S è stato dializzato contro il PBS.

Preparazione della proteina HP-NAP

La sequenza genica di HP-NAP è stata clonata, espressa e purificata in Bacillus subtilis per evitare la contaminazione da LPS (Amedei et al., 2006). La proteina ricombinante è stata giudicata pura come dimostrato dalla corsa elettroforetica del purificato a diverse percentuali di acrilammide. L’analisi di spettrometria di massa con Maldi Reflex (Brucker Analytik, Karlsrhur, Germany)

120 ha inoltre confermato che la proteina in esame è una singola molecola di 16,875 ± 20 Da.

La preparazione di HP-NAP immunodepleta è stata ottenuta mediante immunocromatografia: la proteina purificata è stata fatta passare in colonna cromatografica impaccata con matrice di G-Sepharose con immobilizzati anticorpi policlonali di coniglio anti–HP-NAP, come precedentemente descritto da Amedei et al. (2006).

Reagenti iniettati agli animali

Come precedentemente detto, i trattamenti somministrati agli animali hanno previsto l’utilizzo di Pam3 (EMC Microcollection GmbH, Tuebingen, Germany), anticorpo monoclonale anti-mouse TLR2 isotipo IgG2bk di ratto (clone 6C2) e isotipo IgG2b di ratto come controllo, acquistati entrambi alla eBioscience (San Diego, California).

Valutazione della formula leucocitaria

Per distinguere le sottopopolazioni leucocitarie e determinare la loro relativa percentuale sono stati effettuati strisci di sangue prelevato alle varie epoche. I vetrini fissati all’aria sono stati colorati con il colorante May Grunwald- Giemsa ed esaminati quindi in microscopia ottica. Parallelamente é stata effettuata la conta assoluta dei leucociti in camera di Thoma: le singole percentuali, moltiplicate per il numero di leucociti/mmc, danno il numero assoluto di ogni singola classe di leucociti per mmc.

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Misura delle IgE totali e parassita specifiche nel plasma

I livelli di IgE totali nel plasma dei topi sono stati valutati usando uno specifico Kit ELISA (Alpha Diagnostic, San Antonio, Texas) e seguendo le istruzioni della casa produttrice.

La misura dei livelli di IgE parassita specifiche è stata determinata grazie ad una modificazione del sistema di cattura ELISA per le IgE totali. Utilizzando la piastra ELISA del kit per la valutazione delle IgE totali, 100 µl del plasma dei topi diluito 1:2 in PBS è stato aggiunto al pozzetto con adeso l’anticorpo anti- mouse IgE. Dopo un’incubazione di quattro ore a temperatura ambiente, la piastra è stata lavata con PBS–0.05% Tween 20 e sono stati aggiunti gli antigeni E/S biotinilati di T. spiralis (10 µg/ml) per discriminare le IgE parassita specifiche. Le piastre sono state lavate al termine delle quattro ore di incubazione ed è stata aggiunta avidina perossidata (Cappel Research Products, Durham, NC). Lo svilluppo della reazione con orthophenylenediamine (OPD) insieme ad H2O2 è stata stoppata

dopo 30 minuti con H2SO4. Le densità ottiche (OD) di ciascun pozzetto sono state

lette allo spettrofotometro per piastre Victor (Perkin-Elmer) ad una lunghezza d’onda di 490 nm.

Valutazione livelli citochinici nel plasma

Il dosaggio delle citochine IL-4, IL-5, IL-12 e IFN-γ nel plasma dei topi è stato effettuato mediante kit commerciali specifici (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Germany).

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Coltura delle cellule della milza dei topi e valutazione delle citochine secrete dalla stimolazione in vitro

Milze di 5 topi BALB/c infetti da 14 gg con T. spiralis sono state prelevate sterilmente e disgregate meccanicamente. La sospensione cellulare così ottenuta e stata sottoposta a lisi ipotonica dei globuli rossi e delicatamente passata attraverso una garza di nylon per eliminare gli aggregati cellulari. La lisi dei globuli rossi è stata effettuata aggiungendo al pellet di splenociti 4 ml di soluzione lisante ACK (BioWhittaker) per 4 minuti a cui ha fatto seguito un lavaggio con 4 volumi di terreno RPMI 1640 al 3% di FBS al fine di eliminare le cellule morte e tamponare l’ipotonicita del buffer di lisi. Gli splenociti sono stati coltivati in vitro in terreno RPMI 1640 al 5% di siero di vitello fetale (FCS) (HyClone, Logan, Utah) alla concentrazione di 1x 106 cellule /ml a 37° C in atmosfera al 95% di O2

e 5% di CO2. in piastra di Petri. Dopo un’ora di incubazione sono state raccolte le

cellule non aderenti mentre quelle adese sono state più volte lavate con il terreno per rimuovere le eventuali cellule non aderenti alla piastra. Cellule non aderenti ed aderenti sono state coltivate separatamente per 24 ore in RPMI 1640 medium addizionato di 10% FCS, 2 mmol/L L-glutammina, piruvato di sodio, una soluzione di amminoacidi non essenziali ed antibiotici in presenza di : (1) isotipo IgG2b di ratto (3 µg in 1.0 mL); (2) anticorpo anti-TLR2 (3 µg in 1.0 mL); (3) HP-NAP (0.1 e 1.0 µg in 1.0 mL) con IgG2b di ratto (3 µg); (4) HP-NAP (0.1 e 1.0 µg in 1.0 mL) con l’anticorpo monoclonale anti-TLR2 (3 µg); (5) Pam3 (0.1 e 1.0 µg in 1.0 mL) con IgG2b di ratto (3 µg) o (6) Pam3 (0.1 e 1.0 µg in 1.0 mL) con mAb anti-TLR2 (3 µg). Sui supernatanti delle suddette colture è stata valutata la quantità di IL-12 and IL-6 mediante kit commerciali.

123 Al 42° giorno di infezione sono state raccolte le cellule della milza di ogni animale trattato con HP-NAP e degli animali di controllo e piastrate alla concentrazione di 2 x 106 cells/mL in RPMI 1640 al 10% di FCS, 2 mmol/L L- glutammina, piruvato di sodio, una soluzione di amminoacidi non essenziali e antibiotici. In duplicato, le cellule della milza (1 mL per piastra) sono state messe a contatto con terreno, 10 µg /mL degli antigeni E/S del parassita, o 100 ng/mL dell’ enterotossina stafilococcica B (SEB) a 37°C in atmosfera al 5% di CO2.

Dopo 48 ore il sovranatante di coltura è stato raccolto per il dosaggio delle citochine IL-6, IL-12, IL-4, IL-5, IL-13, e IFN-γ mediante specifici kit ELISA (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Germany).

Gelatina Zimografia

L’attività della MMP-9 plasmatica dei topi sottoposti a trattamento con HP-NAP e dei topi infettati di controllo è stata valutata mediante la gelatina zimografia.

I campioni plasmatici, raccolti al 42° giorno dall’infezione sperimentale, sono stati diluiti 1:50 in sample buffer mentre lo standard MMP-9 ricombinante (Sigma-Aldrich) è stato diluito scalarmente nel medesimo buffer a partire da una concentrazione 1:3000 fino a 1:48000 per ottenere una retta di riferimento. Le proteine in esame sono state separate tramite SDS-PAGE all’8%, il cui running gel è stato impregnato con gelatina porcina (1 mg/ml; Merck) in condizioni denaturanti e non riducenti. Al termine della corsa elettroforetica, segnalata dal blu di bromofenolo alla fine del running gel, i gel sono stati lavati due volte in una soluzione contenente il 2,5% del detergente non ionico Triton x100 per 30 minuti

124 ciascuno, in modo da allontanare l’SDS dalle proteine. Successivamente il gel è stato incubato per 18 ore in tampone di refolding contenente Ca2++ a 37°C per

favorire l’attività enzimatica della metallo proteasi ormai rinaturata. Le bande chiare in corrispondenza del peso molecolare di 82-, 92- e 125 kDa, corrispondenti rispettivamente alla banda attiva enzimaticamente, al proenzima e al complesso con la lipocalina 2 della MMP-9, sono state visualizzate su uno sfondo blu dopo colorazione con 0.25% Coomassie blue R250 e decolorazione con 50% metanolo e 10% acido acetico.

Procedure istologiche

Al 42° giorno dall’infezione sperimentale topi sono stati sacrificati e per ogni animale dei gruppi in studio è stato prelevato un frammento della lingua per prepararlo all’analisi istologica. In alcuni animali è stato anche asportato il rene, fegato, polmone e milza per le valutazioni morfo-istologiche a seguito dei trattamenti.

Il tessuto in esame è stato immerso in un volume di formalina tamponata al 4% pari a circa 5 volte il proprio, per circa 3 ore. E’ seguito un lavaggio in acqua corrente per circa 3 ore per togliere l’eccesso del fissativo. Dopo la fissazione, i tessuti sono stati disidratati e chiarificati in Isoparaffin (Panreac General Absorbent, Kieselguhr), sostituto dello Xylene, per permettere la penetrazione della paraffina nel campione. Si è immerso prima il pezzo in soluzioni graduali di alcol etilico (J.T. Baker), dal 70% (1 giorno) al 95% e al 100% in due passaggi di un’ora. Dopo la disidratazione i tessuti molto fibrosi, come la lingua, sono stati