Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV

4. TYRIMŲ REZULTATAI

4.5. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV

analizė

Siekiant identifikuoti filogenetinius skirtumus tarp Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV izoliatų ir kitų gyvūnų PV lauko izoliatų specifinių nukleoproteino sekvenavimo produktų buvo suformuotas bendras filogenetinis medis (17 pav.), kuriame pateikiama 67 replikatų evoliucinė analizė. Filogenetinių tyrimų duomenys rodė, kad usūrinių šunų/rudųjų lapių pasiutligės virusų plėtra glaudžiai asocijuota tarpusavyje (statistiškai patikimas plėtros dydis 79 proc.), tačiau bendrame filogenetiniame medyje išryškėjo dvi filogenetinės grupės – I ir II (statistiškai patikimas plėtros dydis 82 proc. ir 97 proc). Pirmoje PV nukleoproteino filogrupėje grupavosi glaudžiai susiję (statistiškai patikimas plėtros dydis 97 proc.) 12 Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV izoliatų (grupė 1) ir grupė 2, kurioje klasterizavosi 8 usūrinių šunų/rudųjų lapių PV nukleoproteino sekos su grupiniu 100 proc. statistiniu patikimumu. Tuo tarpu II filogrupė buvo žymiai heterogeniškesnė: čia formavosi atskira šaka (9683LTRF, Kretinga 2009) bei 10 glaudžiai susijusių usūrinių šunų PV izoliatų (plėtros dydis 82-97 proc.). Šioje grupėje kartu su Lietuvos PV izoliatais grupavosi PV nukleoproteino sekos iš Balkanų (RVU42706 86111YOU Hercegovina), Latvijos (AY277572 04LAT), Rusijos (AY352504RV309RU) ir Estijos (U434329342EST), filogenetinės grupės viduje susiformavo subgrupė (3), kurioje 100 proc. statistiniu patikimumu grupavosi lapių iš Latvijos (AY277574,12LAT), Suomijos (AY751534,RV118FIN) ir Rumunijos (GU086623 RORV6107SV ir GU086652 RORV4008BC) PV N sekos. Usūrinio šuns iš Lenkijos PV izoliato (U43004 9424POL) N dalinė seka grupavosi atskira filogenetinio medžio šaka ir turėjo didelį plėtros dydį (97 proc.) su abiem Lietuvos PV izoliatų N sekų filogenetinėmis grupėmis. Antroje filogrupėje Lietuvos usūrinių šunų PV izolatų N sekos iš Švenčionių rajono (3968PV1LTRD, 5382PV1LTRD ir 12093PV1LTRD; 2010) ir rudosios lapės PV izoliatas iš Ignalinos rajono (12143PV1LTRF; 2011) filogenetiniame medyje grupavosi kartu su aukščiau minėtomis ekspertinėmis sekomis, formuodamos linijines šakas ir aukštą plėtros dydį (iki 95 proc.). Keturių Lietuvos usūrinių šunų PV izoliatų N sekos (26388PV1LTRD, 4063PV1LTRD, 17143PV1LTRD, 13687PV1LTRD) buvo glaudžiai asocijuotos (plėtros dydis 97 proc.) ir filogenetiškai artimos Latvijos (AY277572 04LAT), Rusijos (AY352504RV309RU) ir Estijos (U34329342EST) usūrinių šunų PV N sekoms (plėtros dydis 92 proc.). Trijų Lietuvos usūrinių šunų PV izoliatų N sekos kartu su rudosios lapės (5437LTRF) ir miškinės kiaunės (10425LTPM) PV N sekomis grupavosi trečioje filogenetinėje grupėje (III subgrupė 4), kur buvo glaudžiai

asocijuotos tarpusavyje (plėtros dydis 92-97 proc.) ir su lapių iš Serbijos (U42704 8653YOU) ir Bulgarijos (U42999 9384HON) PV izoliatų N sekomis, plėtros dydis 100 proc. Lietuvos usūrinio šuns PV izoliatas iš Ignalinos (24771PV1LTRD, 2011) formavo atskirą šaką, kuri ryškiai disonavo bendrame filogenetiniame medyje – netiesiogiai buvo asocijuota (plėtros dydis 92 proc.) su IV filogenetinės grupės 5 subgrupės usūrinių šunų PV izoliatų N sekomis iš Rytų Europos (Rusijos AY352488 743a, AY352458 857r) ir Azijos regionų (Mongolijos EU652444 NeiMeng 927B ir P. Korėjos DQ076121 SKRRD9902PJ, DQ076126 SKRRD406CC).

17 pav. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV lauko

izoliatų nukleokapsidę (N) koduojančio 603 bp regiono filogenetinis medis Pastaba: Filogenetiniam medžiui sudaryti panaudotas MP (Maximum Parsimony) metodas, CNI (Close-Neighbour-Interchange) algoritmas. Tiriamųjų sekų grupių palyginimui naudota išorinė grupė (Outgroup) Duvenhage DUVVSA81 (U22848). Filogenetinė analizė atliekama MEGA-4 programa (Tamura ir kt., 2007). Statistinio patikimumo plėtros dydis (didesnis kaip 70 proc.) buvo skaičiuojamas vertinat 500 (MP) replikatų nt sekas (Hillis, Bull, 1993).

4.6. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV vakcininių padermių ir laboratorinių derivatų nukleokapsidę (N) koduojančio 603 bp regiono filogenetinė analizė

Tiriant usūrinių šunų ir rudųjų lapių PV N dalinio sekvenavimo filogenetinius duomenis ir lyginant su vakcininių padermių PV nukleoproteino 603 bp regiono sekų panašumais (18 pav.), nustatyta, kad 39 iš 40 Lietuvos PV N sekų grupavosi kartu (plėtros dydis 97 proc.), sudarydamos dvi subgrupes (1 ir 2). Subgrupėse skirtingų usūrinių šunų/rudųjų lapių PV izoliatų N sekų vidinis plėtros dydis buvo mažesnis ir sudarė 62-88 proc. Trys Lietuvos usūrinių šunų PV izoliatų N sekos kartu su kontrolinėmis rudosios lapės (5437LTRF) ir miškinės kiaunės (10425LTPM) PV N sekomis grupavosi antroje (II) filogenetinėje grupėje (subgrupė 3), kur buvo glaudžiai asocijuotos tarpusavyje (plėtros dydis 99 proc.). Tyrimas parodė, kad Rusijos vakcininė padermė (EF542830 RV-97) grupavosi kartu su Japonijos vakcinine paderme (AB044824 Nashigahara) (plėtros dydis 97 proc.), be to, abiejų šių padermių PV N sekos buvo silpnai ir netiesiogiai filogenetiškai asocijuotos su abiem Lietuvos subgrupėmis (plėtros dydis 58 proc.). Tuo tarpu visos SAD vakcininės padermės, jų derivatai bei SAD persistentiniai rudųjų lapių PV izoliatai N dalinio sekvenavimo 603 bp regione demonstravo glaudų filogenetinį ryšį ir klasterizavosi į vieną homogeninę filogenetinę grupę (filogrupė III), plėtros dydis 99 proc., sudarydami dvi – 4 ir 5 sekų subgrupes (plėtros dydis 83 proc. ir 86 proc). Kartu su minėtų padermių PV N sekomis grupavosi ir vieno Lietuvos usūrinio šuns PV izoliato iš Ignalinos (24771PV1LTRD, 2011) N seka, suformuodama vidinę asocijuotą šaką kartu su SAD vakcininės padermės virusų, izoliuotų iš pirmo laboratorinio pasažo lapių galvos smegenų audinių kultūroje (EU877068 SAD B19-1st pass), seka (plėtros dydis 82 proc.). Laboratorinių PV izoliatų N sekos iš JAV (HM535790 CVS-N2C) ir Kinijos (HQ317918 CTN-1-31 HM vacc.) formavo nepriklausomas filogenetinio medžio šakas, neasocijuotas su II-III filogenetine grupe (plėtros dydis 46 proc.) ir glaudžiai filogenetiškai susijusias tarpusavyje (plėtros dydis 96 proc.).

18 pav. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV vakcininių padermių ir laboratorinių derivatų nukleokapsidę (N) koduojančio 603 bp regiono filogenetinis medis

Pastaba: Filogenetiniam medžiui sudaryti panaudotas MP (Maximum Parsimony) metodas, CNI (Close-Neighbour-Interchange) algoritmas. Tiriamųjų sekų grupių palyginimui naudota išorinė grupė (Outgroup) Duvenhage DUVVSA81 (U22848). Filogenetinė analizė atliekama MEGA-4 programa (Tamura ir kt., 2007). Statistinio patikimumo plėtros dydis (didesnis kaip 70 proc.) buvo skaičiuojamas vertinat 500 (MP) replikatų nt sekas (Hillis, Bull, 1993)

4.7. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV lauko izoliatų glikoproteiną (G) koduojančio 358 bp regiono filogenetinė analizė

Atliekant 26 Lietuvos PV izoliatų glikoproteino filogenetinius tyrimus tarpusavyje lyginti 75 skirtingi PV lauko izoliatai, kurie buvo sugrupuoti pagal PV G dalinio 358 bp sekvenavimo duomenis į filogenetinį medį (19 pav.). Pirminiai duomenys rodė, kad palyginus su PV nukleoproteino sekvenavimo rezultatais, PV G sekos buvo labiau heterogeniškos. Analizuojant Lietuvos PV izoliatų G sekas, filogenetiniame medyje išryškėjo dvi asocijuotos filogenetinės sekų grupės (I-II) su statistiškai patikimu plėtros dydžiu (90 proc. ir 82 proc.). Pirmoje PV glikoproteino filogrupėje grupavosi (subgrupė 1) glaudžiai susiję (statistiškai patikimas plėtros dydis 85 proc.) trys Lietuvos usūrinių šunų, dvi rudųjų lapių ir viena miškinės kiaunės PV G sekos bei viena usūrinio šuns PV G seka iš Rusijos (AY353885 2070F), kuri buvo tiesiogiai asocijuota su Lietuvos usūrinio šuns seka iš Vilniaus r. (18217PV1LTRD, 2011), plėtros dydis 98 proc. 14 usūrinių šunų ir rudųjų lapių PV G sekų grupavosi kartu, sudarydamos konservatyvią antrąją subgrupę (subgrupė 2), kurios plėtros dydis siekė 80 proc. Trečioji subgrupė buvo sudaryta iš dviejų Lietuvos usūrinių šunų PV izoliatų G sekų (15188PV1RD ir 13687PV1RD, Švenčionys, 2010) bei vienos rudosios lapės PV izoliato G sekos iš Slovėnijos (HM852184 1647-07SVN), kuri tiesiogiai asocijuota (plėtros dydis 98 proc.) su Lietuvos rudosios lapės iš Šalčininkų (1689PV1LTRF) seka. Pirmoje filogrupėje formavosi didelė heterogeniška (geografiniu požiuriu) linijinės plėtros PV izoliatų G sekų grupė, kurioje identifikuojamos dviejų Lietuvos usūrinių šunų PV G sekos: 4655V1LTRD (Ignalina, 2010) ir 3968PV1LTRD (Švenčionys, 2010). 4655V1LTRD PV G sekos glaudžiai (plėtros dydis 93 proc.) ir tiesiogiai asocijuotos su rudosios lapės iš Prancūzijos (AF325461 FRA1-FX) PV G sekomis ir netiesiogiai – su rudosios lapės iš Vokietijos (GU936875 RV313) PV G sekomis. Tuo tarpu 3968PV1RD PV G sekos buvo netiesiogiai asocijuotos (plėtros dydis 89 proc.) su M13215PV (klasikinė Pastero PV padermė, Prancūzija) ir AF406694 CVS (laboratorinė adaptuota padermė, Prancūzija) PV G sekomis. Antra PV glikoproteino filogrupė (subgrupė 4) taip pat buvo heterogeniška geografiniu požiūriu, čia klasterizavosi skirtingos PV G sekos, įskaitant ir heterogenišką usūrinio šuns PV izoliato iš Lietuvos (24771PV1LTRD, Ignalina, 2011) G seką. 24771PV1LTRD seka buvo tiesiogiai asocijuota (plėtros dydis 98%) su arktinės lapės iš Rusijos PV izoliato (AY353888 483A RU) G sekomis ir netiesiogiai – su rudosios lapės iš Rusijos PV izoliato (AY062047 RV450RU) G sekomis, plėtros dydis 82 proc. PV izoliatų G sekos iš JAV ir Kanados (subgrupė 5) suformavo nepriklausomą filogenetinio medžio šaką plėtros dydis 98 proc.), kuri nebuvo asocijuota su Lietuvos PV izoliatų G sekomis.

19 pav. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV

lauko izoliatų glikoproteiną (G) koduojančio 358 bp regiono filogenetinis medis

4.8. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV vakcininių padermių ir laboratorinių derivatų glikoproteiną (G) koduojančio 358 bp regiono filogenetiniai tyrimai

Tiriant usūrinių šunų ir rudųjų lapių pasiutligės virusų G dalinio sekvenavimo filogenetinius duomenis (49 PV izoliatai) ir lyginant su vakcininių padermių pasiutligės virusų glikoproteino 358 bp regiono sekų panašumais (20 pav.), nustatyta, kad filogenetiniame medyje susiformavo dvi filogrupės (I– II). Pirmoje filogenetinėje grupėje išryškėjo dvi subgrupės: antroje (subgrupė 2) konservatyviai linijiniu principu klasterizavosi 7 usūrinių šunų ir 10 rudųjų lapių PV izoliatų G sekos, kurių plėtros dydis buvo statistiškai patikimas 87-95 proc. Panašiai grupavosi PV G sekos ir antroje filogenetinėje grupėje (II), kurioje konservatyviai linijiniu principu klasterizavosi keturios usūrinių šunų, viena rudosios lapės (6155LTRF, Ignalina) ir viena miškinės kiaunės (10425LTPM, Ignalina)PV G seka, plėtros dydis buvo statistiškai patikimas 82-97 proc. Įdomiausia situacija susiformavo pirmoje filogrupėje, subgrupėje 1, kurioje grupavosi didelė heterogeniška (geografiniu požiuriu) linijinės plėtros PV izoliatų G sekų grupė. Šioje grupėje Lietuvos usūrinio šuns 24771PV1LTRD (Ignalina, 2011) PV izoliato G sekos buvo tiesiogiai asocijuotos su SAD-Bern Lysvulpen vakcininės padermės (EF206708 SAD-Bern) PV G sekomis (plėtros dydis 96 proc.) ir netiesiogiai asocijuotos su SAD B19 vakcininės padermės (M31046 SAD B19) PV G sekomis (plėtros dydis 98 proc.). Kitos filogenetinėje analizėje panaudotos SAD vakcininės padermės, jų derivatai bei SAD persistentiniai PV rudųjų lapių izoliatai G dalinio sekvenavimo 358 bp regione demonstravo glaudų filogenetinį ryšį ir linijiniu principu klasterizavosi į vieną homogeninę filogenetinę grupę (plėtros dydis 95-98 proc.). Įdomu, kad Lietuvos usūrinio šuns 3968PV1LTRD (Švenčionys) PV izoliato G dalinio sekvenavimo sekos formavo atskirą asocijuotą filogenetinio medžio šaką ir demonstravo netiesioginį homologiškumą (plėtros dydis 87 proc.) su ekspertinėmis laboratorinių ir vakcininių PV padermių (M13215PV, AF406694 CVS, EF206717SAD1-3670VI ir EF206707 ERA) G sekomis. Tuo tarpu Lietuvos usūrinio šuns PV izoliato 4655VILTRD (Ignalina) G regiono sekos buvo tiesiogiai ir glaudžiai (plėtros dydis 92 proc.) asocijuotos su ekspertinėmis laboratorinių PV derivatų (AF042824 CVS-B2C lab ir HM535790 CVS-N2C USA) G sekomis.Rusijos vakcininė padermė (EF542830 RV-97) grupavosi kartu su Japonijos (AB044824 Nashigahara) vakcinine paderme (plėtros dydis 100 proc.). Lietuvos usūrinio šuns PV izoliato (3968PV1RD, Švenčionys, 2010) G sekos formavo atskirą, nepriklausomą filogenetinio medžio šaką (plėtros dydis 87 proc.), o usūrinio šuns PV izoliato 4655V1RD (Ignalina, 2010) G sekos filogenetiškai buvo artimos (plėtros dydis 92 proc.) dviems laboroatorinėms PV padermėms (AF042824 CVS-B2C, Japonija ir HM535790 CVS-N2C JAV).

20 pav. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV

vakcininių padermių ir laboratorinių derivatų glikoproteiną (G) koduojančio 358 bp regiono filogenetinis medis

4.9. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV nukleoproteino 603 bp

Nel documento PASIUTLIGĖS ORALINĖS VAKCINACIJOS EFEKTYVUMAS IR EPIDEMIOLOGINĖ RIZIKA LIETUVOS USŪRINIŲ ŠUNŲ IR RUDŲJŲ LAPIŲ POPULIACIJOSE (pagine 69-78)