LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Gediminas Pridotkas
PASIUTLIGĖS
ORALINĖS VAKCINACIJOS EFEKTYVUMAS
IR EPIDEMIOLOGINĖ RIZIKA
LIETUVOS USŪRINIŲ ŠUNŲ
IR RUDŲJŲ LAPIŲ POPULIACIJOSE
Daktaro disertacija
Žemės ūkio mokslai, veterinarinė medicina (02 A)
Disertacija rengta 2008–2012 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje.
Mokslinis vadovas –
Dr. Dainius Zienius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarinė medicina– 02 A).
TURINYS
SANTRUMPOS ...6
1. ĮVADAS...9
2. LITERATŪROS APŽVALGA ...14
2.1. Pasiutligės epidemiologija...14
2.2. Pasiutligės virusų klasifikacija ir pasiutligės viruso struktūra ...20
2.3. Pasiutligės laboratorinė diagnostika...24
2.3.1. Mėginių paėmimas, saugojimas ir transportavimas ...24
2.3.2. Histologiniai metodai ...24
2.3.2.1. Formaline fiksuotų smegenų audinių dažymas ir mikroskopinis tyrimas Negri kūnelių nustatymui ...24
2.3.2.2. Negri kūnelių nustatymas šviežiuose smegenų audiniuose (Selerio metodas)...25
2.3.3. Imunologiniai metodai ...25
2.3.3.1. Fluorescuojančių antikūnų tyrimo metodas (FAT) ...25
2.3.3.2. Imunocheminis tyrimo metodas ...28
2.3.3.3. Imunohistocheminis tyrimo metodas (IHC)...29
2.3.3.4. Imunofermentinės analizės metodas (IFA Ag) ...30
2.3.3.5. Greitasis imunodiagnostinis testas (RIDT) ...31
2.3.4. Pasiutligės viruso izoliacijos metodai ...31
2.3.4.1. Pelių užkrėtimo metodas (MIT) ...31
2.3.4.2. Ląstelių kultūrų užkrėtimo metodas (RTCIT)...31
2.3.5. Serologiniai tyrimo metodai...32
2.3.6. Molekuliniai tyrimo metodai...32
2.4. Pasiutligės oralinės vakcinos...33
2.5. Laukinių gyvūnų pasiutligės oralinė vakcinacija ir jos efektyvumo kontrolė...35
2.6. Pasiutligės oralinės vakcinacijos epidemiologinė rizika (gyvų atenuotų pasiutligės oralinių vakcinų persistencija)...38
3. TYRIMŲ METODIKA...40
3.1. Tyrimų objektas...40
3.1.1. Vakcinacijos arealas, struktūra, logistika ...40
3.1.2. Vakcina...41
3.1.3. Tiriamųjų mėginių surinkimas ir saugojimas...42
3.1.4. POV efektyvumo tyrimas...43
3.2. Imunologiniai, virusologiniai ir molekulinės biologijos tyrimų metodai ...44
3.2.1. Tetraciklino žymenų (TTC) nustatymas usūrinių šunų ir
rudujų lapių žandikaulio kauliniame audinyje/dantyje ...44
3.2.2. Imunofermentinės analizės metodas (IFA) pasiutligės vakcininiams antikūnams nustatyti lapių ir usūrinių šunų kraujo serume ...46
3.2.3. Statistinis TTC žymenų ir specifinių pasiutligės antikūnų (Ak) tyrimų rezultatų vertinimas...47
3.2.4. Fluorescuojančių antikūnų tyrimo (FAT) metodas ...48
3.2.5. Viruso išskyrimo (VI) metodas ...48
3.2.6. Virusinės RNR išskyrimas ...49
3.2.7. Pradmenų dizainas...50
3.2.8. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR)...50
3.2.9. Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR) ...55
3.2.10. Vieno mėgintuvėlio atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR) ...52
3.2.11. AT-PGR produktų elektroforezė agarozės gelyje ...53
3.2.12. PGR produkto valymas ...53
3.2.13. DNR sekvenavimas ...53
3.2.14. Sekų statistinė analizė ...54
4. TYRIMŲ REZULTATAI...58
4.1. Usūrinių šunų ir rudųjų lapių pasiutligės atvejų dinamikos tyrimai Lietuvoje 2006-2011 metais ...58
4.2. Pasiutligės oralinės vakcinacijos efektyvumo kompleksiniai tyrimai usūrinių šunų populiacijoje Lietuvoje 2006-2011 metais...60
4.3. Pasiutligės oralinės vakcinacijos efektyvumo kompleksiniai tyrimai rudųjų lapių populiacijoje Lietuvoje 2006-2011 metais ...63
4.4. Pasiutligės viruso tyrimai atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR)...65
4.5. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV lauko izoliatų nukleokapsidę (N) koduojančio 603 bp regiono filogenetinė analizė...69
4.6. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV vakcininių padermių ir laboratorinių derivatų nukleokapsidę (N) koduojančio 603 bp regiono filogenetinė analizė...72
4.7. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV lauko izoliatų glikoproteiną (G) koduojančio 358 bp regiono filogenetinė analizė...74
4.8. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV ir ekspertinių PV vakcininių padermių ir laboratorinių derivatų glikoproteiną (G)
koduojančio 358 bp regiono filogenetinė analizė...76
4.9. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV nukleoproteino 603 bp produkto kintamųjų nukleotidų sekų lyginamoji analizė ...78
4.10. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių PV glikoproteino 358 bp produkto kintamųjų nukleotidų sekų lyginamoji analizė ...80
4.11. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių populiacijoje paplitusių PV nukleoproteino geno 400 bp regiono numatomų aminorūgščių antigeniškumo profilių lyginamoji analizė...82
4.12. Lietuvos usūrinių šunų/rudųjų lapių populiacijoje paplitusių PV glikoproteino geno 360 bp regiono numatomų aminorūgščių antigeniškumo profilių lyginamoji analizė...83
5. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS...86
6. IŠVADOS ...95
7. REKOMENDACIJOS ...97
8. DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS...98
9. KONFERENCIJOS IR SEMINARAI...99
10. LITERATŪROS SĄRAŠAS...100
SANTRUMPOS
Ag – antigenai;
Ak – antikūnai; a.r. – amino rūgštys;
AT-PGR – atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija;
BHK-21 – žiurkėno jauniklio inksto ląstelių kultūra (angl. Baby
Hamster Kidney Cell Culture);
bp – bazių poros;
CDC – infekcinių ligų centras (angl. Contaqious Diseases
Centre);
CNI – artimiausio grupavimo kaitos statistinis algoritmas (angl.
Close-Neighbour- Interchange);
CNS – centrinė nervų sistema;
CVS-11 – laboratorinė pasiutligės viruso padermė (angl.
Challenge/Control Virus Strain);
DMEM – ląstelių mitybinė terpė (angl. Dulbecco‘s Modified
Eagles Medium);
DNR – deoksiribonukleorūgštis;
dNTP – deoksiribonukleotido trifosfatas;
DEPC – dietilo oksidietildikarbonatas; EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis;
ERA – pasiutligės viruso padermė (angl. Evelyn Rokitnicki
Abelseth Strain);
FAT – fluorescuojančių antikūnų tyrimas (angl. Fluorescent
Antibody Test);
FAVN – viruso neutralizacijos fluorescuojančiais antikūnais testas (angl. Fluorescent Antibody Virus Neutralisation Test); FFV – židinius formuojantys vienetai;
FITC – fluoresceino izotiocianato konjugatas; FVS – fetalinis veršelio serumas;
IFA – imunofermentinė analizė;
IHC – imunohistocheminis tyrimo metodas; JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos;
KCl – kalio chloridas;
km2 – kvadratinis kilometras;
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas; MAk – monokloniniai antikūnai;
mAk – motininiai (kolostriniai) antikūnai;
MIT – pelių užkrėtimo pasiutligės virusais testas (angl. Mouse
Inoculation Test);
MP – filogenetinės analizės sekų maksimalios kaitos statistinis metodas (angl. Maximum Parsimony);
N2a – pelių neuroblastomos ląstelių kultūra (angl. Murine
Neuroblastoma Cell Culture);
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas;
NR – neutralizacijos reakcija;
nt – nukleotidai;
OT – optinis tankis;
p – patikimumas (statistinis);
PBS – fosfatinis buferinis tirpalas (angl. Phosphate Buffered
Saline);
PGR – polimerazės grandininė reakcija;
PGSO – Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacija;
PI – pasikliautinasis intervalas (angl. CI – Confidence
Interval);
POV – pasiutligės oralinė vakcinacija; PSO – Pasaulio sveikatos organizacija; PV – pasiutligės virusas;
RFFIT – greitasis fluorescuojančio židinio inhibicijos testas (angl.
Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test);
RNR – ribonukleorūgštis;
RTCIT – ląstelių kultūrų užkrėtimo metodas (angl. Rabies Tissue
Culture Infection Test);
SAD – pasiutligės viruso vakcininė padermė (angl. Street
Alabama Dufferin);
SAG – pasiutligės viruso vakcininė padermė (angl. Street
Alabama Gif);
SD – standartinė paklaida (statistinė);
Spv – standartinės paklaidos vidurkis(statistinis);
TCID – audinių kultūros infekcinė dozė (angl. Tissue Culture
Infectious Dose);
TTC – tetraciklino hidrochlorido biologinis žymuo; TV – tarptautiniai vienetai (antikūnų titro);
VI – viruso išskyrimas;
VMVT – Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba;
V-RG – gyvų virusų rekombinuota vakcina. Veiklioji medžiaga yra virusai (Kopenhagos padermė) su pasiutligės virusų glikoproteinu (angl. Vaccinia-Rabies Glycoprotein).
1. ĮVADAS
Pasiutligė (rabies, lyssa, hydrophobia) – virusų sukeliamas specifinis encefalitas ir mielitas, kuriuo užsikrečiama pasiutusiam gyvūnui įkandus arba apseilėjus sužalotą odą, rečiau – gleivinę. Pasiutligės sukėlėjas yra neurotropinis RNR-virusas ir priklauso Rhabdoviridae šeimai, Lyssavirus genčiai. Pasiutligė yra tipiška zoonozinė infekcija, kurios rezervuaras gamtoje dažniausiai yra plėšrūs žvėrys iš šuninių giminės: šunys, vilkai, hienos, lapės, usūriniai šunys ir kt. Žmonių pasiutligė yra reikšminga visuomenės sveikatos problema visame pasaulyje (Rupprecht, 2004). Kasmet pasaulyje nuo šios infekcijos miršta apie 55000 žmonių, didžioji dalis mirčių yra registruojama Afrikoje ir Azijoje (http://www.who-rabies-bulletin.org/Service/WRD.aspx). Pasiutligės viruso padermės, cirkuliuojančios įvairiose pasaulio geografinėse zonose, turi daug bendrų biologinių ir antigeninių charakteristikų. Paraleliai egzistuoja panašaus tipo pasiutligės viruso gamtiniai biovariantai (šunų, šikšnosparnių), kurie skiriasi patogeniškumu, gebėjimu formuoti intarpus (Babešo-Negri kūnelius) ir kitomis biologinėmis charakteristikomis. Pasiutligės virusui būdingos bendrosios antigeninės, imunogeninės ir hemagliutinacinės savybės, tačiau įvairių subvirusinių struktūrų biologinis ir antigeninis aktyvumas gali būti nevienodas (Bourhy ir kt., 1992, Schneider ir kt., 1994).
Svarbiausias pasiutligės viruso šaltinis Lietuvoje – sergantys laukiniai mėsėdžiai, ypač lapės ir usūriniai šunys, bei kai kurie naminiai gyvūnai (galvijai, šunys, katės). Per pastaruosius 15 metų pasiutligės epidemiologija keičiasi – Vakarų Europoje pagrindiniu pasiutligės vektoriumi lieka rudosios lapės (Vulpes vulpes), tačiau Rytų ir Šiaurės Europoje pasiutligės virusų plėtros veiksniai kiti – šiuose regionuose usūriniai šunys (Nyctereutes
procyonides) ir arktinės lapės (Alopex vulpes) pradeda dominuoti infekcijos
grandinėje (Wandeler, 2008). Usūrinių šunų pasiutligės atvejų skaičiaus didėjimas 15–20 proc. per pastaruosius 10 metų (Matouch, 2008) epidemiologams kelia papildomų klausimų, nes šis vektorius (kartu su rudosiomis lapėmis) sudaro 90-94 proc. visų pasiutligės atvejų tarp laukinių žinduolių Šiaurės-Rytų Europoje ir ypač Baltijos jūros regione. Atsižvelgiant į tai, kad abi rūšys tiesiogiai dalinasi gyvenamąja teritorija bei medžiojimo plotais, pasiutligės virusų tarprūšinio perdavimo galimybės yra visiškai realios. Taigi, empiriniai (King ir kt., 2004; Holmala, Kauhala, 2006), teoriniai (Singer ir kt., 2008) ir filogenetiniai (Johnson, Fooks, 2005) tyrimai rodo, kad artimi kontaktai tarp usūrinių šunų ir lapių Šiaurės ir Rytų Europoje palaiko bendrą infekcinį pasiutligės cirkuliacijos ciklą abiejose rūšyse. Spėjimai, kad usūriniai šunys Rytų Europoje gali sudaryti atskirą, nepriklausomą pasiutligės virusų (PV) infekcinį ciklą (Potzsch ir kt., 2006),
turi būti tikrinami, analizuojant usūrinių šunų PV filogenetinių tyrimų duomenis ir juos lyginant su rudųjų lapių PV izoliatų analogiškų tyrimų duomenimis. Pasiutligės virusų (PV) persistencija usūrinių šunų (Nyctereutes procyonoides) ir rudųjų lapių (Vulpes vulpes) tarpe, panaudojant molekulinius tyrimo metodus, Lietuvoje nepakankamai tyrinėta, tačiau mokslinėse publikacijose spėliojama apie pasiutligės virusų galimai nepriklausomą infekcinį ciklą usūrinių šunų populiacijoje (ypač Rytų ir Šiaurės Europoje). PV filogenetikai nagrinėti dažniausiai naudojami konservatyvus N-genas ir variabilus G-genas, kurių tyrimai leidžia patikimai grupuoti PV ir identifikuoti virusų kintamumą bei rūšinės adaptacijos tendencijas.
Pasiutligės epidemiologinę situaciją galima valdyti panaudojant klasikinę kontrolės priemonę – oralinę vakcinaciją, o jos efektyvumo tyrimas lauko sąlygose yra vienas iš pagrindinių sėkmingos vakcinacijos prielaidų (Cliquet ir kt., 2010). Pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumo įvertinimas lauko sąlygomis yra sudėtingas procesas, nes populiacijos imuninį statusą formuoja daugybė veiksnių. Europos Komisija (EC, 2002) rekomenduoja tris pagrindinius vertinimo kriterijus: pasiutligės epidemiologinės situacijos vertinimą bei TTC žymenų ir specifinių Ak vertinimą kontroliniuose mėginiuose. Šie vertinimo kriterijai buvo įtraukti formuojant disertacinio darbo uždavinius. POV programos turi būti sudaromos įvertinant laukinių gyvūnų populiacijų imuninį statusą, atkreipiant ypatingą dėmesį į usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijų ir imuninio statuso formavimosi ypatumus bei realiai apskaičiuojant ir rekomenduojant optimalius pasiutligės prevencijos ir kontrolės metodus.
Daugelis mokslininkų akcentuoja regioninių PV izoliatų genetinės analizės svarbą ruošiant bendras regionines laukinių gyvūnų pasiutligės oralinės vakcinacijos programas. Laukinių gyvūnų oralinė vakcinacija, panaudojant atenuotas gyvas pasiutligės virusų padermes (SAD-Bern arba SAD B19), praktikuojama daugelyje Europos valstybių (Šveicarijoje, Vokietijoje, Italijoje, Belgijoje, Liuksemburge, Prancūzijoje ir kt.). Per 1983-2000 metų periodą 13 Europos valstybių buvo panaudota daugiau kaip 200 mln. SAD B19 vakcinos jaukų. Tai leido ženkliai sumažinti pasiutligės atvejų skaičių laukinių gyvūnų populiacijose. Lietuvoje visą šalies teritoriją apimanti pasiutligės oralinė vakcinacija (POV) buvo pradėta 2006 metais, o per pastaruosius 7 metus vakcinuojant laukinius gyvūnus buvo panaudota daugiau nei 8 mln. vakcinos dozių. Vakcininių pasiutligės virusų padermių kokybiniai tyrimai Lietuvoje buvo atliekami fragmentiškai, tačiau yra perspektyvūs: pirma – tyrimų teritorija ir identifikuojamų mėginių kiekis nėra dideli, antra – Lietuvoje nebuvo atliekami PV vakcininių ir „lauko“ padermių filogenetinio tapatumo tyrimai, o tai ypač aktualu siekiant
moksliškai pagrįsti vakcinos parinkties ir vakcinacijos schemos efektyvumą, ir trečia – Europoje beveik visos POV, panaudojant SAD vakcininių padermių PV, buvo adaptuotos kontroliuoti pasiutligę rudųjų lapių populiacijoje, tuo tarpu Lietuvoje, kurioje usūriniai šunys pastaruosius 5 metus yra pasiutligės dominuojantis vektorius, ypač aktualu tyrinėti PV vakcininių padermių filogenetiką ir efektyvumo kiekybines savybes būtent atviroje usūrinių šunų populiacijoje.
SAD vakcinų efektyvumą ir specifiškumą laboratorinėmis sąlygomis tyrinėjo Vokietijos, Austrijos, Čekijos mokslininkai, tačiau tyrimų lauko sąlygose šioje srityje atliekama labai nedaug, o tarprūšinio pasiutligės perdavimo veiksniai aptarinėjami tik teoriniu lygmeniu. PV vakcininių padermių galimai persistentinės savybės rudųjų lapių populiacijoje tik pradedamos tirti. Tuo tarpu metodiškai pagrįstos mokslinės informacijos apie SAD vakcinų virusų persistenciją usūrinių šunų populiacijoje šiuo metu nėra. Lietuvoje tyrimų metu nustatyti Šiaurės-Rytų Europos geografinei grupei (NEE) priskiriami PV. Tai leidžia teoriškai manyti, kad visos oficialiai registruotos gyvos atenuotos klasikinės pasiutligės vakcinos gali būti sėkmingai panaudotos pasiutligės prevencijai usūrinių šunų ir lapių populiacijoje, kadangi šių vakcinų gamyboje dažniausiai yra naudojamos klasikinės PV arba SAD B19 padermės, kurios yra pakankamai efektyvios visoms Europoje paplitusioms PV geografinėms grupėms, tame tarpe ir NEE PV. Tačiau SAD padermių gyvų atanuotų vakcinų homologiškumo laipsnis PV nukleoproteino ir glikoproteino regione Lietuvos (Baltijos regiono) laukinių mėsėdžių populiacijose dar nėra yrinėtas. Atlikti tyrimai leistų moksliškai pagrįsti Lietuvos nacionalinę pasiutligės oralinės vakcinacijos programą ir pasiūlyti galimai naujas efektyvias vakcinacijos schemas, ypač usūrinių šunų populiacijoje. Lietuvoje POV vykdoma jau 7 metai, todėl SAD vakcininių padermių PV antigeninių ir PV „lauko“ izoliatų filogenetinių savybių tyrimams, siekiant įrodyti retus ir vienetinius vakcininės padermės pasiutligės virusų natūralaus biologinio ciklo atvejus gamtoje, artimiausiais metais bus labai geros sąlygos: vakcininis virusas „įvedamas“ į populiaciją pastoviai, dideliais kiekiais ir turėdamas didelį biologinį aktyvumą.
Darbo tikslas
Įvertinti 2006–2011 metų pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumą ir epidemiologinę riziką, atliekant pasiutligės virusų izoliatų ir SAD vakcininių padermių pasiutligės virusų kompleksinius epidemiologinius, biologinio žymėjimo, antigeniškumo ir filogenetinius lyginamuosius tyrimus Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijose.
Darbo uždaviniai
1. Apžvelgti 2006–2011 metų pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumą Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijose pagal epidemiologinio statuso dinamiką vakcinacijos periodu.
2. Įvertinti 2006–2011 metų pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumą Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijose pagal tetraciklino žymenis (TTC) žandikaulių mėginiuose.
3. Įvertinti 2006–2011 metų pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumą Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijose pagal specifinius pasiutligės antikūnus (Ak) kraujo serumo mėginiuose.
4. Įvertinti Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių, ekspertinių ir SAD vakcininių padermių pasiutligės virusų pirminius nukleoproteino dalinio sekvenavimo filogenetinius lyginamuosius tyrimus.
5. Įvertinti Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių, ekspertinių ir SAD vakcininių padermių pasiutligės virusų pirminius glikoproteino dalinio sekvenavimo filogenetinius lyginamuosius tyrimus.
6. Atlikti Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių, ekspertinių ir SAD vakcininių padermių pasiutligės virusų nukleoproteino/glikoproteino dalinio sekvenavimo produktų kintamųjų nukleotidų sekų lyginamąją analizę.
7. Atlikti Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių, ekspertinių ir SAD vakcininių padermių pasiutligės virusų nukleoproteino/glikoproteino dalinio sekvenavimo produktų numatomų aminorūgščių antigeniškumo profilių lyginamąją analizę.
Darbo mokslinė reikšmė ir naujumas
1. Kompleksiškai įvertintas pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumas Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijose pagal epidemiologinio statuso kaitos analizę, tetraciklino žymenis (TTC) ir specifinius pasiutligės antikūnus (Ak) usūrinių šunų ir rudųjų lapių mėginiuose.
2. Atlikta pasiutligės virusų padermių sekų analizė, sudaryti filogenetiniai medžiai ir nustatyti filogenetiniai lietuviškų PV izoliatų panašumai bei skirtumai, lyginant juos su PV epizootinių (lauko) izoliatų, SAD grupės bei Rusijos PV vakcininėmis padermėmis glikoproteino/nukleoproteino geno dalinio sekvenavimo regionuose.
3. Nustatyta, kad PV filogenetikai tyrinėti dažniausiai naudojami konservatyvus N-genas ir variabilus G-genas leidžia filogenetiškai grupuoti
PV, identifikuoti virusų kintamumą ir rūšinės adaptacijos tendencijas Lietuvoje bei įvertinti SAD grupės PV oralinių vakcinų galimą biologinę riziką atviruose gamtiniuose pasiutligės židiniuose.
4. Atliktų tyrimų pagrindu, pateikiama Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių, ekspertinių ir SAD grupės PV padermių nukleoproteino/glikoproteino dalinio sekvenavimo produktų kintamųjų nukleotidų sekų ir numatomų aminorūgščių antigeniškumo profilių lyginamoji statistinė interpretacija.
Darbo praktinė reikšmė
1. Įrodyta, kad nežiūrint pasiutligės virusų adaptacijos ir tarprūšinės plėtros sąlygų, šią infekciją galimą valdyti, panaudojant klasikinę kontrolės priemonę – oralinę vakcinaciją, o jos efektyvumo tyrimas lauko sąlygose yra vienas iš pagrindinių sėkmingos vakcinacijos prielaidų Lietuvoje.
2. Specifinio kompleksinio tyrimo pagrindu įvertinta sėkminga POV vykdymo strategija mažuose regionuose ir esant ribotoms vakcinos platinimo sąlygoms.
3. Pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) efektyvumo ir biologinės rizikos kompleksinio vertinimo pagrindu pateikiamos rekomendacijos tolimesniam POV optimizavimui ir kokybinio valdymo gerinimui Lietuvos usūrinių šunų ir rudųjų lapių populiacijose.
4. Pritaikyta ir patobulinta kokybinė atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR) panaudojant klasikinio ir naujo dizaino tipospecifinius pradmenis PV glikoproteino/nukleoproteino geno regionuose virusų diferenciacijos ir diagnostikos srityse.
Disertacijos struktūra ir apimtis
Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apžvalga, metodika, tyrimų duomenys, tyrimų duomenų apibendrinimas, išvados, paskelbtų publikacijų sąrašas, 260 literatūros šaltinių sąrašas. Darbe pateikiama 22 paveikslai ir 8 lentelės. Disertacijos apimtis – 123 puslapiai.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Pasiutligės epidemiologija
Pasiutligė – infekcinė virusinė liga, kurią sukelia pasiutligės virusas, priklausantis Rhabdoviridae šeimai, Lyssavirus genčiai. Pasiutligės virusas žmonėms ir gyvūnams sukelia specifinį encefalitą (smegenų uždegimą) (Plotkin, 2000, Dietzschold ir kt., 2005). Pasiutligė yra viena iš seniausių žmonijai žinomų ligų. Ligos pavadinimas („rabies“) siekia 3000 m. pr.Kr. ir yra kilęs iš Sanskrito kalbos žodžio "rabhas", kas reiškia „siautėti, elgtis agresyviai“. Ligos pavadinimas Graikų kalboje („lyssa“) kilęs iš šaknies „lud“, kuri reiškia „įsiutęs“. Rašytiniuose šaltiniuose pasiutligė minima jau nuo priešistorinių laikų: V a.pr.Kr. – Demokritas ir Ksenofontas, IV a.pr.Kr. – Aristotelis. Pirmasis raštiškas įrašas apie pasiutligę – 1930 m. pr.Kr. datuojamas Eshunna senovinis rankraštis, kuriame rašoma, kad šuns savininkas, jei tam pasireiškė pasiutligės simptomai, turi imtis prevencinių priemonių nuo įkandimų. Pirmajame mūsų eros amžiuje romėnas Kornelijus Celcijus pasiutligę pavadino hidrofobija. Van Sviton 1770 metais pirmasis aprašė žmogaus pasiutligės paralyžiaus formą (Adamson, 1977, Blancou, 2004, Tortora ir kt., 2010). Nuopelnai tiriant pasiutligę ir rengiant jos aktyvios imunizacijos priemones priklauso L. Pasterui. Jis įrodė, kad pasiutligės sukėlėjas yra virusas, randamas pasiutusio gyvulio seilėse, liaukose ir audiniuose, bet dažniausiai – galvos ir stuburo smegenyse. L. Pasteras eksperimentiškai nustatė, kad perskiepijant “gatvės” virusą, galima gauti naują virusą, kurį jis pavadino fiksuotu ir, užkrėtęs juo triušį, iš jo smegenų pagamino skiepus. Pirmasis nuo pasiutligės paskiepytas žmogus - berniukas Joseph Meister, 1885 metų liepos 6 įkąstas pasiutusio šuns. Joseph išgyveno ir L. Pastero gydymas išplito po visą pasaulį. Šiame svarbiame žmonijai darbe L. Pasterui talkino ir kiti mokslininkai: E. Roux, I. Mečnikovas, N. Gamalėja. Viduramžiais būta šunų ir vilkų pasiutligės epizootijų Vokietijoje, Belgijoje, Ispanijoje ir kitose šalyse. Vėliau, augant miestams, Europoje paplito miesto tipo pasiutligės epizootijos. Jų būta Rusijoje – Maskvoje ir Peterburge, daugelyje Vakarų Europos miestų. Intensyvios pasiutligės epizootijos užregistruotos XIX a. viduryje ir XX a. pirmajame ketvirtyje (Sureau ir kt., 1983, King ir kt., 2004). Lietuvoje pasiutligė žinoma nuo senų laikų. 1897 metais gydytojas V. Orlovskis Vilniuje įkūrė Pastero stotį, kurioje buvo gaminamos vakcinos, skiepijama nuo pasiutligės, atliekami moksliniai tyrimai (Svičiulis ir kt., 1989).
Pasiutligės virusas yra dviejų biologinių rūšių – natūralus „lauko“ (pranc. – Virus de rues) ir fiksuotas (pranc. – Virus fixe), pirmą kartą dirbtinai gautas L. Pastero (Sureau ir kt., 1983). Fiksuotas virusas išvestas iš natūralaus „lauko“ viruso 1885 metais, todėl gautas pasiutligės viruso
biotipas yra tinkamas pasiutligės vakcinos gamybai (Sureau ir kt., 1983). Natūralus „lauko“ virusas cirkuliuoja tarp laukinių ir naminių gyvūnų ir pasižymi ilgu, bet nevienodos trukmės inkubaciniu periodu. Po kontakto su sergančiu laukiniu ar naminiu gyvūnu žmonės ir gyvūnai gali užsikrėsti ir susirgti pasiutlige. Nugaišusių nuo pasiutligės gyvūnų pailgosiose smegenyse, Amonio rage ir kitose smegenų dalyse randama Babešo-Negri kūnelių (Sureau ir kt., 1983).
Pasiutligė yra zoonozinė infekcija, t. y. ji gali būti tiesiogiai perduodama nuo gyvūno gyvūnui ar nuo gyvūno žmogui. Viruso plitimą seilėmis palengvina tai, kad virusas paveikia sergančio gyvūno smegenis ir gali sukelti agresyvią elgseną, taigi gyvūnas puola ir kanda neprovokuojamas. Šis virusas sveikam gyvūnui perduodamas per seiles įkandus užsikrėtusiam pasiutligės virusu gyvūnui. Po įkandimo virusas greitai dauginasi, nukeliauja iš raumenų nervų į centrinę nervų sistemą (CNS) ir išplinta po daugelį smegenų dalių, sukeldamas smegenų uždegimą ir paveikdamas daugelį CNS funkcijų (Warrell ir kt. 2004) (1 pav.).
1 pav. Pasiutligės viruso plitimas gyvūno organizme Pastaba: pagal http://www.in.gov/boah/2465.htm
Smegenys Raumuo Nugaros smegenys Viruso replikacija Motorinis nervas Viruso replikacija Infekuotos seilės Seilių liaukos
Pasiutlige serga dauguma šiltakraujų gyvūnų, tiek mėsėdžiai, tiek žolėdžiai gyvuliai, šikšnosparniai. Dažniausiai pasiutlige serga laukiniai mėsėdžiai – lapės, vilkai, usūriniai šunys, laukinės katės, kiaunės, žebenkštys ir kt. Pasiutlige gali sirgti ir naminiai gyvūnai (šunys, katės, galvijai). Pasiutligės virusai labai neatsparūs išorinėje aplinkoje, todėl užsikrečiama tik tuomet, kai pasiutlige sergančio gyvūno seilės patenka į žaizdą per pažeistą odą arba gleivines. Pasiutligės virusas labai jautrus išdžiūvimui, dezinfekcinėms medžiagoms, dėl šios priežasties viruso plitimas per išorinės aplinkos objektus beveik neįmanomas. Šalyse, kuriose naminiai gyvūnai skiepijami nuo pasiutligės ir griežtai kontroliuojama lapių populiacija, dažniausiai užsikrečiama nuo šikšnosparnių. Pasiutligė yra paplitusi Azijoje, Amerikoje ir Afrikoje. Daugelyje Europos šalių taip pat yra nustatomi gyvūnai, užsikrėtę pasiutlige. Tačiau Norvegijoje, Suomijoje, Švedijoje, Britanijos salose, Maltoje, Kipre, Portugalijoje, Ispanijoje, Japonijoje, Australijoje ir Naujojoje Zelandijoje ši liga nėra išplitusi (Krebs, 1995, Plotkin, 2000, Childs, 2002, Jackson, 2002, Hankins ir kt., 2004) (2 pav.).
2 pav. Pasiutligės paplitimas pasaulio valstybėse
Pastaba: pagal http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S187962571200051X
Pasiutligės inkubacinis laikotarpis trunka nuo 3 savaičių iki 3 mėnesių, tačiau kartais jis gali trukti net kelerius metus. Paprastai pasiutligė pasireiškia neurologiniais požymiais. Priklausomai nuo gyvūnų rūšies šie požymiai gali šiek tiek skirtis. Pasiutligės pasireiškimas gali būti skirstomas į ligos stadijas: 1) ankstyvoji stadija (prodrominė arba ramybės) – šiame etape, kuris paprastai trunka apie 1–3 dienas, gali atsirasti nedideli elgsenos pokyčiai, tokie kaip padidėjęs agresyvumas, naktinių gyvūnų aktyvumas dienos periodu, laukinių gyvūnų meilumas žmonėms, apetito sutrikimai; 2) susijaudinimo arba agresyvumo stadija – po ankstyvosios ramybės stadijos prasideda didelio susijaudinimo ar agresyvumo periodas. Gyvūnai šioje stadijoje būna labai agresyvūs. Gyvūnai dažnai kanda bet kokią medžiagą ar daiktą, puola kitą gyvūną ar žmogų be jokios priežasties, pasireiškia neadekvatus apetitas – gyvūnai ėda neėdamus daiktus. Didelis garsas sukelia agresyvumo proveržius (ypač šunims, katėms). Gyvūnams pasireiškia įvairūs nerviniai traukuliai, mirtis gyvūną gali ištikti net ligai nepasiekus paralyžiaus stadijos; 3) paralyžiaus stadijai yra būdingas rijimo reflekso sutrikimas, todėl tipiškas šio periodo požymis yra putos aplink burną ar iš burnos drimbančios seilės. Po to gyvūnams išsivysto viso kūno paralyžius, kuris prasideda nuo užpakalinių galūnių ir to pasekoje gyvūną ištinka mirtis (Jackson, 2002, Finnegan, Brookes ir kt., 2002; Hankins ir kt., 2004, Dietzschold ir kt., 2005).
Rudosios lapės (Vulpes vulpes) – vienos pagrindinių pasiutligės viruso platintojų Europoje – buvo pagrindinis pasiutligės rezervuaras Europoje nuo Antrojo pasaulinio karo laikų. Daugiau kaip 83 proc. teigiamų pasiutligės atvejų buvo diagnozuojama būtent šioje populiacijoje (Anderson ir kt., 1981; Aubert, 1995). Lapės europinėje Eurazijos žemyno dalyje gyvena nedidelėmis šeimomis (3–6 suaugę, tai yra vyresni kaip 12 mėn. individai), kurios užima 20–50 kv. km teritoriją. Teritorija nėra statiška, dažnai 2–3 šeimoms tenka dalintis vieną teritoriją (didelės koncentracijos populiacijos) (Mulder, 2000). Ankstyvą pavasarį (kovą–balandį) vedami lapiukai (statistinis vidurkis šeimoje 5,5), tuo metu iki 60 proc. populiacijos sudaro prieauglis iki 2 mėn. amžiaus. 8–10 savaičių lapiukai pradeda maitintis, ieškoti maisto, tai yra judėti 2–5 km spinduliu aplink olą. Vasaros pabaigoje ir rudenį 4–12 mėn. amžiaus lapės (statistinis vidurkis šeimoje 3,5) aktyviai juda teritorijoje, bet šeimos nepalieka, visiškai atsiskiria tik kitais metais. Statistinis mirtingumas lapiukų kategorijoje – 12 proc., suaugusiųjų – 6,1 proc., tačiau infekcinės ligos šį rodiklį populiacijos lygmeniu gali padidinti iki 40–60 proc. (Lloyd, 1980, Mac Donald, 1987, Goszcynnski, 2002).
Antrasis pasiutligės rezervuaras Europos valstybėse yra usūriniai šunys (Nyctereutes procyonoides) (Westerling, 1991; Nyberg ir kt., 1992; Ansorge, Stiebling, 2001; Westerling ir kt., 2004, Mačiulskis ir kt., 2006;
Smreczak ir kt., 2006, 2007, 2008; Smreczak, Żmudziński, 2009). Šie gyvūnai naujomis sąlygomis sugeba prisitaikyti geriau nei lapės. Usūriniai šunys į buvusios Tarybų Sąjungos europinę dalį pradėjo plisti 1929–1955 metais (Lavrov, 1971, Lever, 1985) ir labai gerai adaptavosi, išplito Rytų Europoje ir greitai apgyvendino tolimesnius vakarinius ir rytinius regionus (Mitchell-Jones ir kt., 1999; Kauhala, Saeki, 2004). Pirmiausia jie paplito Suomijoje – 1930–1940 metais (Suomalainen, 1950; Helle, Kauhala, 1991), 1945–1946 metais pasiekė Švediją, 1952 m. – Rumuniją, 1955 m. – Lenkiją, 1959 m. – Slovakiją, 1961–1962 m. – Vokietiją ir Vengriją, 1975–1979 m. – Prancūziją, 1983 m. – Norvegiją ( Dehnel, 1956; Nowak, Pielowski, 1964; Nowak, 1984; Kauhala, 1996a; Kauhala, 1996b; Jędrzejewska, Jędrzejewski, 1998, Ansorge, Stiebling, 2001; Drygala ir kt., 2008a, Drygala ir kt., 2008b; Léger, Ruette, 2005). 1950-aisiais usūriniai šunys buvo atvežti į Estiją ir labai greitai paplito Latvijoje, Lietuvoje (Baltrūnaitė, 2002). Dabar usūriniai šunys yra pastebimi Olandijoje, Kroatijoje, Slovėnijoje, Moldovoje, Bosnijoje-Hercogovinoje, Serbijoje ir Makedonijoje (Ćirović, Milenković, 1999; Mitchell-Jones ir kt., 1999; Ćirović, 2006). Taigi, usūrinių šunų (Nyctereutes procyonoides) rūšis, apie 1920 metus iš Azijos atkeliavusi į Centrinę ir Vakarų Rusiją ir taip plisdama tolyn bei apgyvendindama naujus regionus, pasiutligės virusą išplatino Centrinėje Europoje ir Suomijoje (Kauhala, 1996a,b; Weber ir kt., 2004).
Usūrinių šunų pasiutligės epidemiologija yra kitokia nei lapių, nors infekcijos dinamiką apsprendžia panašūs veiksniai. Šių gyvūnų gyvenimo ciklas, palyginti su lapių, yra 1,5–2,5 mėn. vėlesnis, todėl daugiausia pasiutligės atvejų nustatoma paskutinį metų ketvirtį, kai nuo šeimos atsiskiria ir pradeda aktyvų gyvenimo ciklą prieauglis, padidėja visos populiacijos maitinimosi prieš žiemos ramybės periodą aktyvumas (Gordon ir kt., 2004). Usūriniai šunys yra monogamiški, patinėliai dalyvauja jauniklių priežiūroje ir padeda patelei juos išmaitinti, todėl patelė gali ilgesnį laiką ilsėtis ir dėl to jos organizmas gali pagaminti daugiau pieno, o tai užtikrina gerą šuniukų mitybą ir padidina jų gyvybingumą bei išgyvenimą (Ikeda, 1983; Yamamoto, 1987; Kauhala ir kt., 1998; Sidorovich ir kt., 2000, Drygala ir kt., 2008a). Jauniklių mirtingumas per pirmuosius gyvenimo metus sudaro 88–89 proc., 2–4 gyvenimo metais mirtingumo lygis yra apie 43 proc. ir visiškai sumažėja penktais gyvenimo metais – mirtingumas sudaro tik 1 proc. (Helle, Kauhala, 1993; Kauhala, Helle, 1995). Šaltuoju periodu usūriniai šunys užmiega žiemos miegu urvuose, tai juos apsaugo nuo šalčio ir plėšrūnų. Miegas šaltuoju periodu juos daro unikaliais šuninių gyvūnų tarpe ir taip padeda jiems išlikti ir išplisti šiaurinėje Europoje (Nieminen ir kt., 2002; Mustonen ir kt., 2007; Kowalczyk ir kt., 2008; Kowalczyk, Zalewski, 2011). Usūriniai šunys yra
visaėdžiai, tai irgi užtikrina jų gyvybingumą ir plitimą Europoje. Šie gyvūnai gali maitintis tiek augaliniu, tiek gyvūniniu maistu. Jų dienos racioną sudaro ne tik gyvi paukščiai, įvairūs smulkūs žinduoliai, ropliai (driežai) bei amfibijos (varlės), bet ir gyvūnų maitos (Kauhala, Auniola; 2001, Schwan, 2003; Woloch, Rozenko, 2007; Kauhala, 2009; Vulla ir kt., 2009; Sutor ir kt., 2010).
Medžioklės statistika suteikia papildomų duomenų apie lapių ir usūrinių šunų populiacijos kiekybę, todėl šie duomenys gali būti panaudoti kuriant biologinius modelius populiacijos kokybiniams rodikliams tirti. Sumedžiotų gyvūnų skaičius gali būti panaudotas statistiškai apskaičiuojant populiacijos koncentraciją, bet tokie rezultatai patikimi tik mažuose regionuose ir netinka vertinant populiacijos dinamiką visos šalies mastu. Medžioklė gali daryti įtaką populiacijos pasiskirstymui pagal amžių, gyvūnų judėjimui užimamoje teritorijoje, o tai netiesiogiai formuoja skirtingą pasiutligės epidemiologinį procesą skirtingose šalies teritorijose (Breitenmoser ir kt., 2000). Populiacijos gausai nustatyti dažniausiai taikomi patikimesni statistinės analizės metodai: nakties kalkuliacijos indeksas, linijinis skerspjūvio metodas, ir patikimiausias – populiacijos struktūrinis skaičiavimas (EC, 2002). Lietuvoje lapių ir usūrinių šunų populiacijos skaičiavimai neatliekami, nes yra gana brangūs ir reikalauja didelių žmogiškųjų išteklių, todėl ruošiant pasiutligės prevencijos programas didžiausias dėmesys turi būti skiriamas epidemiologiniams žemėlapiams ir populiacijos struktūriniams tyrimams (Zienius, 2007).
Pasiutligės epidemiologinis statusas yra tiesiogiai susijęs su populiacijos imuniniu statusu. Analizuojant statistinius susirgimų pasiutlige skaičius skirtingose Lietuvos apskrityse, pastebėta, kad 2004 m. jų sumažėjo. Tai tiesiogiai siejama su pasiutligės, kaip gamtinės infekcijos, aktyvumo svyravimais. Seniai žinomas fenomenas, kad įgyvendinus ilgalaikes POV programas dideliuose regionuose, padaugėja susirgimų pasiutlige (Breitenmoser ir kt., 2000; Chautan ir kt., 2000, Zienius, 2007). Pasiutligės virusams infekuojant populiaciją, individų skaičius joje pradeda mažėti iki slenkstinės imlių gyvūnų koncentracijos ploto vienete, užtikrinančios pasiutligės persistentinį perdavimo tipą (EC, 2002; Tinline, MacInnes, 2004, Singer ir kt., 2009). Tokiu periodu pasiutligės atvejų natūraliai mažėja. Lietuvoje 2004 m. mažėjo ir sumedžiotų žvėrių, ir susirgimų skaičius: lapių ir usūrinių šunų populiacijoje 2,2–1,9 karto. Tada populiacija pradeda gausėti, kartu daugėja susirgimų. Lietuvoje 2005–2006 m. lapių pasiutligės atvejų didėjo 2,6–3,4 karto, usūrinių šunų – 3,7–5,9. Tokie paraboliniai svyravimai klimatinėse juostose, kokioje yra Lietuva, galimi kas 5–10 metų (Zienius, 2007). Per kelis metus populiacijos koncentracija gali padidėti nuo 4 iki 8 kartų, lyginant su minimaliu gyvūnų skaičiumi esant pasiutligės
persistentinei fazei (Eisinger ir kt., 2005). Pasiutligės epidemiologinis statusas populiacijoje yra skirtingas: vienu metu čia gali būti užsikrėtę, bet nesergantys klinikine forma, t. y. inkubacijos periode, sergantys ir imunizuoti gyvūnai. Užsikrėtę suserga per 2–4 savaites, tuo metu jie gali platinti virusus, be to, virusus platina ir susirgę gyvūnai kol nugaišta. Šis periodas – mažiausiai viena savaitė (Charlton, 1988; Vos, 2003, Mantovani, Marabelli, 2004; Zienius, 2007). Todėl pasiutligės epidemiologinės situacijos dinamikos tyrimas, atžvelgiant į pernešėjo populiacijos struktūrinius pokyčius, yra vienas iš pagrindinių kriterijų, leidžiančių prognozuoti bei įtakoti pasiutligės diagnostikos ir kontrolės priemones nacionaliniu lygmeniu.
2.2. Pasiutligės virusų klasifikacija ir pasiutligės viruso struktūra
Pasiutligės sukėlėjas yra neurotropinis neigiamos poliarizacijos RNR-virusas, priklausantis Rhabdoviridae šeimai, Lyssavirus genčiai. Naudojant monokloninius antikūnus (MAk) bei polimerazės grandininę reakciją (PGR) nustatyta dvylika skirtingų pasiutligės virusų genetinių tipų ir dvi filogenetinės grupės. Pirmai filogenetinei grupei priklauso klasikinis pasiutligės virusas (PV), Duvenhage virusas, Europinis šikšnosparnių
Lyssavirus 1 ir 2 tipas, Australijos šikšnosparnių Lyssavirus, Aravan
virusas, Khujand virusas ir Irkut virusas. Antrai filogenetinei grupei priklauso Lagos šikšnosparnių virusas, Mokola virusas, Shimoni šikšnosparnių virusas ir Vakarų Kaukazo šikšnosparnių virusas (http://www.ictvonline.org).
Viruso genetinė informacija yra koduojama taip vadinamo ribonukleoproteino komplekso, kuriame RNR yra glaudžiai susieta virusiniu nukleoproteinu. Viruso RNR genomą sudaro penki genai – nukleoproteinas (N), fosfoproteinas (P), apvalkalo (matricos) proteinas (M), glikoproteinas (G) ir virusinė RNR polimerazė (L). Lyssavirus turi spiralinę simetriją ir yra panašios į kulką formos (Finke, Conzelman, 2005) (3, 4 pav.).
3 pav. Pasiutligės virusas smegenų ląstelėje
Pastaba: Elektroninė mikrografija 64,000x padidinimu
Kulkos formos dariniai aplink pilkos spalvos sferą yra pasiutligės virusai. Pagal http://ictvdb.bio-mirror.cn/Images/Murphy/rabies.htm
4 pav. Pasiutligės virusas
Pastaba: Elektroninė mikroskopija. Kulkos formos dariniai yra pasiutligės virusai.
Pagal http://www.stanford.edu/group/virus/rhabdo/2004bischoffchang/ Rabies%20Profile.htm
Pasiutligės viruso genomas yra sudarytas iš 11931 nukleotidų (nt): nukleoproteino N (1350 nt), fosfoproteino P (891 nt), matricos proteino M (606 nt), glikoproteino G (1572 nt), RNR priklausomos RNR-polimerazės L (6384 nt) bei Psi regiono arba G-L tarpgeninio regiono (400 nt) (Wu ir kt., 2007). Visi šie genai gali būti sekvenuojami, o gauti duomenys įtraukiami į filogenetinę analizę (Wu ir kt., 2007), tačiau epizootiniu požiūriu vertingiausi duomenys gaunami tiriant nukleoproteino N ir glikoproteino G genų regionus. Pasiutligės virusų nukleoproteino genetinė analizė panaudojant atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją (AT-PGR) (Sacremento ir kt., 1991) leidžia įvertinti pasiutligės sukėlėjo geografinius ir rūšinius ypatumus – identifikuoti 11 PV genotipų skirtinguose pasaulio geografiniuose arealuose (Kissi ir kt., 1995) ir atlikti visos Lyssavirus genties pasiutligės virusų genetinį tipavimą (Vazques-Moron ir kt., 2006).
Būdamas santykinai konservatyvus, pasiutligės virusų nukleoproteinas N tinkamas filogenetiniams tyrimams ir panaudojamas rūšies ir virusų plėtros
faktoriams tirti (Kuzmin ir kt., 2004; McElhinney ir kt., 2006), nustatyti pasiutligės virusų adaptaciją skirtingose rūšyse, pvz. filogenetiniams saitams tarp lapių ir usūrinių šunų. Tuo tarpu PV glikoproteino G genetinis kintamumas yra žymiai didesnis, palyginus su N-genu (Johnson ir kt., 2002), tačiau jis taip pat gali būti naudojamas genetiniam PV tipavimui atlikti (Kissi ir kt., 1995, Bourhy ir kt., 1999; Kuzmin ir kt., 2004; Hyun ir kt., 2005) (5 pav.).
5 pav. Pasiutligės viruso struktūra
Pastaba: pagal http://www.flickr.com/photos/41447040@N08/ 3815910986/in/photostream Glikoproteinas Lipidinis apvalkalas Matricos proteinas Ribonukleoproteinas RNR
PV glikoproteinas G koduoja specifines antigenines determinantes, nuo kurių priklauso PV neurotropizmas (Faber ir kt., 2005), patogeniškumas ir potencialus specifiškumas ląstelių-taikinių atžvilgiu (Thoulouze ir kt., 1998, Badrane, Tordo, 2001; Guyatt ir kt., 2003). Taip pat PV glikoproteinas G inicijuoja specifinių neutralizuojančių antikūnų gamybą (Wiktor ir kt., 1973), todėl ženkli studijų dalis skiriama glikoproteino antigeninių saitų ir determinančių linijiniam ir erdviniam žymėjimui bei filogenetinei analizei.
2.3. Pasiutligės laboratorinė diagnostika
2.3.1. Mėginių paėmimas, saugojimas ir transportavimas
Pasiutligės virusas greitai inaktyvuojasi kambario ir aukštesnėje temperatūroje. Todėl teisingas mėginių paėmimas, saugojimas ir transportavimas turi didelę įtaką sėkmingai ir patikimai laboratorinei diagnostikai. Į laboratoriją pasiutligės tyrimams gali būti pristatomas visas gyvūno lavonas (smulkaus gyvūno) arba gyvūno galvos smegenys (stambaus gyvūno), taip pat gali būti pateikiami gyvūnų smegenų biopsijos mėginiai. Pasiutligės tyrimams smulkių žinduolių (šunų, kačių, lapių, usūrinių šunų ir kt.) lavonai ar stambių žinduolių galvos smegenys į laboratoriją atvežami kaip galima greičiau (Montana ir kt., 1991, Barrat, 1996, Bingham, Van der Merwe, 2002). Gyvūnų lavonai ar galvos smegenys transportuojami šaltai, tačiau neužšaldomi. Mėginiai į laboratoriją transportuojami drėgmei atspariuose ir skysčių nepraleidžiančiuose konteineriuose, prisilaikant biosaugos reikalavimų.
Pasiutligės diagnozė gali būti patvirtinama tik atliekant laboratorinius tyrimus. Tinkamiausia patologinė medžiaga laboratoriniams tyrimams yra galvos smegenys arba jų dalys. Didžiausia virusų koncentracija yra smegenų gumbure, pailgosiose smegenyse, mažesnė – hipokampe, smegenėlėse ir kitose smegenų dalyse. Taip pat viruso antigenas ar virusas gali būti nustatomas seilių liaukose (Bingham, Van der Merwe, 2002).
2.3.2. Histologiniai metodai
2.3.2.1. Formaline fiksuotų smegenų audinių dažymas ir mikroskopinis tyrimas Negri kūnelių nustatymui
Virusinių baltymų užpildai (Babešo-Negri kūneliai), kurie gali kauptis tam tikrų smegenų ląstelių, ypatingai neuronų, citoplazmoje yra laikomi patognominiu pasiutligės požymiu. Tačiau juos sunku atskirti nuo kitų smegenų ląstelių intarpų (Bowen-Davies, Lowings, 2000). Be to, Babešo-Negri kūneliai nėra tolygiai pasiskirstę smegenyse ir smegenų kamiene ir dažnai nenustatomi smegenų audiniuose net esant pasiutligės infekcijai
(Mayer ir kt. 1986; Bowen-Davies, Lowings 2000). Formaline fiksuotų smegenų audinių paruošimas ir tyrimas gali užtrukti dvi ir daugiau dienų, nors pats audinių dažymas ir Babešo-Negri kūnelių nustatymas (6 pav.) yra pakankamai greitas metodas ir užtrunka apie dvi valandas (Bowen-Davies, Lowings 2000; Finnegan ir kt., 2004). Lyginant su kitais metodais – pelių užkrėtimo metodu (MIT), audinių kultūrų užkrėtimo metodu (RTCIT) ir fluorescuojančių antikūnų metodu (FAT) – šis histologinis tyrimas turi trūkumų dėl žemo jautrumo ir specifiškumo, todėl nerekomenduojamas taikyti pasiutligės tyrimui ir diagnozės patvirtinimui (Tustin, Smith, 1962; Nietfeld ir kt.; 1989; OIE, 2012).
6 pav. Histologinis tyrimas. Babešo–Negri kūneliai
Pastaba: pagal http://osp.mans.edu.eg/elsawalhy/Inf-Dis/Rabies.htm
2.3.2.2. Negri kūnelių nustatymas šviežiuose smegenų audiniuose (Selerio metodas)
Šis metodass yra greitas ir po audinių paruošimo tyrimas gali užtrukti apie 1 valandą. Tačiau dėl per žemo metodo jautrumo ir specifiškumo, kaip ir tradicinis histologinis metodas, yra naudojamas labai retai ir nerekomenduojamas taikyti pasiutligės laboratoriniams tyrimams (OIE, 2012).
2.3.3. Imunologiniai metodai
2.3.3.1. Fluorescuojančių antikūnų tyrimo metodas (FAT)
FAT yra didelio jautrumo ir specifiškumo metodas, kuris leidžia nustatyti pasiutligės virusą gyvūnų galvos smegenų audiniuose. Šiame metode yra naudojami specifiniai antikūnai prieš pasiutligės viruso antigeną, kurie yra chemiškai sujungti su fluorescuojančia medžiaga. Metodas pagrįstas fluorescuojančių antikūnų ypatybe specifiškai jungtis su homologiniais
antigenais ir sukelti jų švytėjimą liuminescencinio mikroskopo ultravioletinėje spektro dalyje (Meslin, Kaplan, 1996). FAT pirmą kartą aprašytas 1958 metais, vėliau modifikuotas ir yra plačiausiai naudojamas pasiutligės diagnostikoje (Goldwasser, Kissling, 1958; Kissling, 1975; Dean ir kt., 1996). Metodas yra dažnai vadinamas „auksiniu“ standartu pasiutligės diagnostikai ir yra rekomenduojamas Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) ir Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacijos (PGSO). Naudojant FAT viruso antigenas gali būti tiesiogiai nustatomas smegenų atspauduose, seilių liaukose (OIE, 2012) ir idealiai tinka viruso antigeno nustatymui acetonu fiksuotose ląstelių kultūrose (Davis ir kt., 1997). Anti-pasiutligės serumas ar imunoglobulinas ir konjugatas gali būti paruošiami laboratorijoje. Komerciškai gaminami fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatai gali būti ne tik polikloniniai konjugatai, kurie yra skirti tiesiogiai pasiutligės virusui nustatyti, bet ir monokloniniai – paruošti su pasiutligės monokloniniais antikūnais (MAk). Diagnostiniai konjugatai turi būti aukštos kokybės, kad paruoštais darbiniais praskiedimais būtų galima nustatyti skirtingus Lyssavirus genotipus ir sumažinti iki minimumo klaidingai teigiamų rezultatų skaičių (Dean ir kt., 1996). Šis tyrimas yra atliekamas per 1- 3 valandas ir jo jautrumas prilygsta pelių užkrėtimo metodo (MIT) jautrumui. Šių metodų jautrumas yra 95–99 proc. (Wachendorfer ir kt., 1985; Webster, Casey, 1988; Bourhy ir kt., 1989). FAT jautrumas priklauso nuo audinių autolizės laipsnio, pasiutligės viruso genotipo ir nuo smegenų audinių būklės (užšaldymo–atšildymo). Jautrumas taip pat gali būti žemesnis, jeigu tiriami mėginiai buvo paimti iš vakcinuotų gyvūnų, kai viruso antigenas lokalizuojasi smegenų kamiene. Kiti faktoriai, kurie gali turėti įtakos šio metodo jautrumui, yra konjugato kokybė ir liuminescencinio mikroskopo kokybė. Kartais dėl labai mažo viruso antigeno kiekio smegenų audinyje ir infekuotumo šis testas gali duoti neigiamus rezultatus, todėl yra rekomenduojama FAT neigiamus rezultatus tvirtinti kitu pasiutligės tyrimo metodu, pvz. viruso izoliacijos metodu (Bowen-Davies, Lowings, 2000). FAT metodu galima tirti ne tik šviežius smegenų audinius, bet ir formaline fiksuotus (Dean ir kt.,1996; Whitfield ir kt., 2001), nors fiksavimas formaline gali trukdyti nustatyti viruso antigeną. Todėl, jeigu prieinama tyrimo medžiaga yra tik formaline fiksuotos smegenys, reikėtų audinių pjūvius paveikti proteolitiniais fermentais, pvz. tripsinu (Johnson ir kt., 1980; Barnard, Voges, 1982; Umoh ir kt., 1985, Warner ir kt., 1997). Tačiau reikia pažymėti, kad naudojant tyrimams formaline fiksuotus smegenų audinius, net ir po apdorojimo tripsinu, tyrimų rezultatai yra mažiau patikimi ir viruso antigenas sunkiau nustatomas, negu naudojant šviežius smegenų audinius (Dean ir kt., 1996) (7 pav.).
7 pav. FAT teigiamas smegenų atspaudas
Pastaba: pagal http://www.maine.gov/dhhs/mecdc/public-health-systems/ health-and-environmental-testing/rabies/rabies.htm
2.3.3.2. Imunocheminis tyrimo metodas
Imunocheminiam pasiutligės tyrimo metodui yra naudojami specifiniai pasiutligės serumai arba globulinai, konjuguoti su fermentais, pvz. peroksidaze. Šis metodas gali būti naudojamas tiesiogiai pasiutligės antigeno diagnostikai šviežioje smegenų medžiagoje. Metodo principas panašus į FAT metodą, todėl šių metodų jautrumas irgi panašus. Tačiau šio metodo nerekomenduojama taikyti vietoj FAT metodo, naudojamo rutininėje diagnostikoje (Genoverse, Andral, 1978; Lembo ir kt., 2006; OIE, 2012) (8 pav.).
8 pav. Pasiutligės virusu infekuotos TE671 ląstelės - peroksidazės
imunocitochemija naudojant anti-pasiutligės polikloninius antikūnus, 24 h po infekcijos
Pastaba: (A) Ląstelės infekuotos pasiutligės CVS-BHK kamienu. (B) Ląstelės infekuotos pasiutligės CVS-MB kamienu. (C) Ląstelės infekuotos pasiutligės „lauko“ virusu. (D) Neifekuotos ląstelės (Rincon ir kt., 2005).
2.3.3.3. Imunohistocheminis tyrimo metodas (IHC)
IHC metodas yra santykinai jautrus ir specifiškas metodas pasiutligės viruso antigeno (Ag) nustatymui formalinu fiksuotuose smegenų audiniuose. Šio metodo technika yra daug jautresnė už histologinio metodo. Panašiai, kaip ir FAT metode, šiame tyrime yra naudojami specifiniai antikūnai pasiutligės viruso intarpų nustatymui. Aukštos kokybės monokloninių antikūnų (MAk) naudojimas padidina fluorescentinių reagentų kokybę ir užtikrina IHC metodo jautrumą nustatant pasiutligės antigeną formalinu fiksuotuose audiniuose. MAk gali būti naudojami IHC nustatatant ir charakterizuojant skirtingus pasiutligės viruso genotipus (Warner ir kt., 1997, Faizee ir kt., 2012) (9.1, 9.2 pav.).
9.1. pav. Galvijų smegenėlės
Pastaba: Rudi, apvalūs intarpai Purkinje ląstelių citoplazmos viduje ir jų dendrituose – mėginys stipriai teigiamas pasiutligės virusiniam antigenui. IHC. Dažyta hematoksilinu.
9. 2 pav. Šuns amonio ragas
Pastaba: Rudos spalvos intarpai neuronų perikarionuose - mėginys teigiamas pasiutligės virusiniam antigenui. IHC. Dažyta hematoksilinu (Stein ir kt., 2010).
2.3.3.4. Imunofermentinės analizės metodas (IFA Ag)
Pasiutligės virusų nukleokapsidinis antigenas gali būti nustatomas naudojant imunofermentinės analizės metodą (IFA) (Atanasiu ir kt., 1980). IFA pasiutligės antigeno nustatymas yra viena iš imunocheminių metodų variacijų ir gali būti taikoma pasiutligės epidemiologinei priežiūrai. Šio metodo jautrumas ir specifiškumas vietiniam dominuojančiam pasiutligės viruso variantui turi būti tikrinamas prieš naudojimą. Kadangi šis testas yra žemesnio jautrumo, todėl pasiutligės teigiamu atveju šis testas gali būti naudojamas tik kartu su patvirtinamaisiais testais, tokiais kaip FAT ar viruso izoliacija (Perrin ir kt., 1986; Perrin, Sureau 1987; Bourhy ir kt., 1989, Xu ir kt., 2007; OIE, 2012).
2.3.3.5. Greitasis imunochromatografinis testas (RIDT)
Šis paprastas testas gali būti naudojamas lauko sąlygomis ir šalyse, kuriose yra riboti diagnostiniai resursai. Šio tyrimo metodo principas yra greitas kokybinis ir vizualus pasiutligės tyrimas in vitro gyvūnų seilių ar smegenų mėginiuose. Šio tyrimo kokybinis rezultatų patikimumas yra pakankamai tikslus, lyginant su kitais PSO ir PGSO nurodytais FAT ir RTCIT tyrimo metodais (Kang ir kt., 2007;OIE, 2012).
Reikia pabrėžti, kad visi metodai, išskyrus „auksinį“ standartą FAT, gali būti naudojami pasiutligės diagnostikai tik atlikus daugiakartinę kartotinę validaciją keliose specializuotose laboratorijose (OIE, 2012).
2.3.4. Pasiutligės viruso izoliacijos metodai
2.3.4.1. Pelių užkrėtimo metodas (MIT)
Šio tyrimo metu pelės yra intracerebriškai užkrečiamos homogenizuota gyvūnų smegenų suspensija. Šis metodas šiuo metu nėra rekomenduojamas rutininei laboratorinei pasiutligės diagnostikai, tačiau jis gali būti naudojamas neigiamų ar teigiamų FAT rezultatų patvirtinimui arba pasiutligės virusų padauginimui prieš viruso izoliatų charakterizavimą (Bourhy ir kt., 1989). MIT yra taip pat naudojamas, kai gyvūnų pasiutligės atvejis yra susijęs su kontaktu su žmonėmis (Swanepoel, 2004). Metodas yra jautrus, jeigu patologinė medžiaga yra šviežia ir neautolizuota. Galutiniai tyrimo rezultatai gaunami po 4 savaičių ir vėliau.
2.3.4.2. Ląstelių kultūrų užkrėtimo metodas (RTCIT)
Pasiutligės virusas gali būti izoliuojamas įvairių linijų ląstelių kultūrose. Tačiau pelių neuroblastomos ląstelės yra naudojamos dažniausiai ir yra jautriausios pasiutligės „lauko“ virusams (Iwasaki, Clark, 1977; Smith ir kt., 1977; Smith ir kt., 1978; Clark, 1980; Rudd ir kt., 1980; Rudd, Trimarch,1987; Bourhy ir kt., 1989; Rudd, Trimarch 1989; Zimmer ir kt., 1990). Homogenizuota tiriamoji medžiaga gali būti tiesiogiai inokoliuojama į ląstelių monosluoksnį. Pasiutligės virusas nesukelia citopatogeninio efekto, todėl viruso buvimą ląstelėse galima nustatyti tik naudojant FAT. RTCIT yra patvirtintas PGSO ir turėtų būti taikomas kaip vienas iš pagrindinių viruso izoliacijos metodų, kadangi šiam metodui nereikia naudoti laboratorinių gyvūnų. Virusas gali būti aptiktas per 1 dieną, bet dauguma atvejų per 2 dienas. Naudojant RTCIT kartu su FAT metodo jautrumas yra didesnis negu 98 proc. (OIE, 2012).
2.3.5. Serologiniai tyrimo metodai
Antikūnai pasiutligės virusui ir pasiutligei giminingiems virusams gali būti nustatomi naudojant įvairias sistemas, pvz. netiesioginę imunofluorescenciją, komplemento fiksaciją, latekso agliutinaciją, imunofermentinę analizę ir virusų neutralizaciją (Campbell, Barton, 1988; Bourhy ir kt.; 1989; Cliquet ir kt., 1998; Madhusudana, Saraswati, 2003).
Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacijos (PGSO) rekomenduojami serologiniai pasiutligės antikūnų tyrimo metodai yra fluorescuojančių antikūnų virusų neutralizacija (FAVN) (Cliquet ir kt., 1998), greitasis fluorescuojančio židinio inhibicijos testas (RFFIT) (Smith ir kt., 1996) ir imunofermentinė analizė (IFA) (Cliquet ir kt., 2003; Otachycyna-Hawranek, 2003; Cliquet ir kt., 2004b). Antikūnų prieš pasiutligės virusą titravimas parodo vakcinuotų gyvūnų imuninio atsako intensyvumą. Pagal PSO rekomendaciją po vakcinacijos 0,5 TV/ml ribinis antikūnų titras rodo gerą apsaugą nuo pasiutligės viruso (Matouch ir kt., 1998). Kita vertus, antikūnų prieš pasiutligės virusą nustatymas leidžia netiesiogiai įvertinti vakcinų efektyvumą oralinės laukinių gyvūnų vakcinacijos metu (Cliquet ir kt., 2000; Cliquet ir kt., 2003; Servat ir kt., 2007).
2.3.6. Molekuliniai tyrimo metodai
Šiuo metu pasiutligės tyrimams naudojami įvairūs molekulinės diagnostikos metodai, tokie kaip atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR), PGR-ELISA, hibridizacija in situ ir realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (Fooks ir kt., 2009). Šie metodai turi labai aukštą jautrumo lygį, todėl neužtikrinant šių metodų standartizacijos ir labai aukštos kokybės kontrolės gali būti gaunama labai daug melagingai teigiamų ar melagingai neigiamų tyrimų rezultatų; dėl šios priežasties šie metodai nėra rekomenduojami rutininei pomirtinei pasiutligės laboratorinei diagnostikai. Tačiau jie gali būti naudojami rezultatų patvirtinimui kaip pirmas žingsnis viruso tipavimui (Sacrimento ir kt., 1991; Heaton ir kt., 1999; Kulonen ir kt., 1999; Black ir kt., 2000; Smith ir kt. 2000; Gupta ir kt., 2001; Black ir kt., 2002; Franka ir kt., 2004; Hughes ir kt., 2004; Picard-Mayer ir kt., 2004; Wakeley ir kt., 2005; Nagaraj ir kt., 2006). AT-PGR metodas yra naudojamas diagnostinėse laboratorijose pasiutligės viruso nukleino rūgščių nustatymui gyvūnų smegenyse ir kituose audiniuose, taip pat biologiniuose skysčiuose (seilės, odos biopsija, šlapimas) (Sacrimento ir kt., 1991; Smith ir kt., 1991; Whitby ir kt., 1997a; Ito irkt., 2001; Ma ir kt., 2001; Wacharapluesadee, Hemachudha, 2001). Šis metodas taip pat gali būti sėkmingai taikomas pasiutligės viruso RNR nustatymui irstančiuose ir formalinu fiksuotuose smegenų audiniuose (Whitby ir kt., 1997b; Kulonen ir kt., 1999; David ir kt., 2002), o kai yra
naudojamas kombinacijoje su nukleotidų sekvenavimu AT-PGR galima įtraukti į pasiutligės viruso genotipo identifikavimą (Smith ir kt., 1991; Nadin-Davis, 1998; Nel ir kt., 1998; Heaton ir kt., 1999). Greitas lizdinės AT-PGR metodas yra naudojamas visų Lyssavirus genotipų nustatymui. Šis metodas negali diferencijuoti šių genotipų, bet gautas PGR produktas gali būti naudojamas genų sekvenavimui, o tai gali būti naudojama izoliatų charakterizavimui ir filogenetinei analizei (Heaton ir kt., 1997; Heaton ir kt., 1999).
2.4. Pasiutligės oralinės vakcinos
Laukinių gyvūnų POV naudojamos modifikuotos, gyvos atenuotos arba modifikuotos rekombinanatinės pasiutligės virusų vakcinos, kurios dažniausiai kildinamos iš vieno bendro prototipo – Street Alabama Dufferin (SAD) lauko padermės virusų, izoliuotų Šiaurės Amerikoje 1935 metais (Fenje, 1960, Stek, 1982). 1960 metais Evelyn Rokitnicki Abelseth (ERA) vakcininės padermės pasiutligės virusai buvo izoliuoti iš SAD padermės originalo skirtingų tipų persėjamose bei pirminėse ląstelių kultūrose (Pastoret ir kt., 2004) ir praeitame dešimtmetyje vis dar buvo naudojami oralinei vakcinacijai rudųjų lapių populiacijoje Kanadoje (MacInnes ir kt., 2001). 1970 metais šveicarų mokslininkai parsisiuntė pasiutligės ERA padermės virusus iš JAV CDC infekcinių ligų kontrolės laboratorijos (Atlanta, JAV) į Berną (Šveicarija) ir po daugybinės adaptacijos BHK-21 ląstelių kultūroje pasiutligės virusų padermei suteikė SAD-Bern pavadinimą. SAD-Bern derivatas buvo sėkmingai naudojamas šveicarų epidemiologų likviduojant pasiutligės židinius Šveicarijoje 1978 m. POV metu (Steck ir kt., 1982; Schneider, Cox, 1983; Matouch, 2006). 1980–1990 metais SAD-Bern ir jo adaptuotų derivatų (SADP588, SAD1, SAG1-2, SAD B19) pasiutligės oralinė vakcinacija buvo sėkmingai taikoma kontroliuojant šią infekciją daugelyje Europos valstybių. SAG2 yra gyva modifikuota pasiutligės vakcina, indikuotina rudosioms lapėms (Vulpes
vulpes) ir usūriniams šunims (Nyctereutes procyonoides). Veiklioji
medžiaga yra dvigubai mažesnio virulentiškumo SAD-Bern padermės mutavę virusai, kultivuoti dviem nuosekliais atrankos etapais, norint išvengti natūralios reversijos į prototipinę padermę (Leblois ir kt., 1990; Schumacher ir kt., 1993; Lafay ir kt., 1994). Gyvų virusų rekombinuotose vakcinose (V-RG vakcina) naudojamas pasiutligės viruso glikoproteinas. Veiklioji medžiaga yra virusai (Kopenhagos padermė) su pasiutligės virusų glikoproteinu; vakcinos biologinis aktyvumas turi būti 108 TCID50 (Kieny ir kt., 1984, Wiktor ir kt., 1984; Blancou ir kt., 1986). Visos vakcinos yra skystos, supilstytos į polietilenines kapsules ar pakelius, apgaubtus laukinių gyvūnų apetitą keliančiu jauku, kurio sudėtyje yra biologinis žymuo – tetraciklinas (10 pav.).
10 pav. Pasiutligės oralinės vakcinos laukiniams gyvūnams Pastaba: pagal http://altex.kiev.ua,
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Vac-lysvulpen.jpg
Virusų stabilumui labai svarbios yra vakcinų laikymo ir transportavimo sąlygos. Gyvų virusų modifikuotos vakcinos turi būti laikomos – -20ºC temperatūroje, o V-RG vakcinos – +2–8ºC temperatūroje (EC, 2002). Vakcinos nuo pasiutligės turi būti saugios. Jų patogeniškumas turi būti tiriamas mėsėdžiams, paukščiams, žemesniesiems primatams, graužikams ir pelėms, turinčioms imuninės sistemos nepakankamumą. Nustatyta, kad SAD padermės yra patogeniškos pelėms ir kitiems graužikams. SAD-Bern padermės patogeniškos babuinams (Bingham ir kt., 1992). V-RG vakcinos visiškai nepavojingos žmonėms ir aplinkai (Rupprecht, 2001; WHO, 2005). Vakcinacijos nuo pasiutligės efektyvumas labai priklauso nuo virusų ir jauko stabilumo. Pavasarį ir vasarą virusų kiekis vakcinoje greitai mažėja. Jaukas greitai yra, esant aukštai aplinkos temperatūrai bei lyjant (EC, 2002). Pavasarį didelę lapių populiacijos dalį sudaro lapiukai, kurie turi antikūnus prieš pasiutligės virusą. Tai įtakoja lapiukų vakcinacijos efektyvumą. V-RG vakcina yra pranašesnė už kitas vakcinas imunizuojant lapiukus, turinčius antikūnų prieš pasiutligės virusus (Bruyere ir kt. 2000; Muller ir kt., 2001; Blasco ir kt., 2001). Pasiutligės vakcinų serijos kokybė ir saugumas prieš vakcinaciją turi būti tiriamas tarptautinėse pasiutligės referentinėse laboratorijose pagal Pasaulio sveikatos organizacijos rekomendacijas ir Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacijos standartus. Keletas tyrėjų yra pateikę mokslinių duomenų, kad vakcinos ir jaukų stabilumas turi nemažai įtakos oralinės vakcinacijos efektyvumui (Balbo, Rossi, 1988; Thomas ir kt., 1989; Aubert ir kt., 1994; Masson ir kt.; 1996). Pagal Europos farmakopėjos rekomendacijas vakcinos vienos dozės vakcininis pasiutligės viruso padermės titras, užtikrinantis 100 proc. apsaugą (Blancou ir kt., 1986), turi
būti stabilus +25°C temperatūroje ne trumpiau kaip 7 dienas. Jaukas, gaubiantis vakcinos kapsulę ar paketėlį, turi būti stabilus aukštoje +40°C temperatūroje ne trumpiau kaip 7 dienas. Vakcinos efektyvumas rudosioms lapėms ir usūriniams šunims turi būti ne mažesnis kaip 90 proc. Šiuo metu vakcinacijai nuo laukinių gyvūnų pasiutligės rekomenduojama naudoti V-RG ir SAG2 vakcinas (WHO, 2005; EMA, 2010). Tačiau praktiškai visos aukščiau išvardintos vakcinos yra veiksmingos tiek rudosioms lapėms, tiek usūriniams šunims imunizuoti prieš pasiutligės virusą ir užtikrina pakankamą efektyvumą likviduojant pasiutligę Europoje (Nyberg ir kt., 1992; Aubert ir kt., 1994; Schluter ir kt., 1997; Muller, 1997; Muller, Schluter, 1998; Vos ir kt., 2000; Breitenmoser ir kt., 2000; Brochier ir kt., 1990, 2001; Cliquet ir kt., 2004; Cliquet ir kt., 2006; Matouch ir kt., 2006, Niin ir kt., 2006).
2.5. Laukinių gyvūnų pasiutligės oralinė vakcinacija ir jos efektyvumo kontrolė
Sėkminga laukinių gyvūnų POV priklauso nuo kelių elementų: aiškios vakcinacijos vietos, vakcinacijos laiko, vakcinos (jauko) platinimo būdo, jų kiekio, vakcinos savybių ir programos efektyvumo (Niin ir kt., 2008). Pasiutligės virusinė infekcija rudųjų lapių ir usūrinių šunų populiacijoje gali būti sėkmingai kontroliuojama, panaudojant klasikinę pasiutligės oralinę vakcinaciją (POV). Tai liudija sėkmingi lauko ir eksperimentiniai bandymai POV kampanijų metu Lenkijoje (Potzsch ir kt., 2006), Estijoje (Laine ir kt., 2008) ir Latvijoje (EC, 2008). Skirtingos pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) schemos naudojamos skirtinguose regionuose ir šalyse, bet daugelis epidemiologų naudoja „klasikinę“ pavasarinę ir rudeninę vakcinos platinimo schemą (Zanoni ir kt., 2000; Breitenmoser ir kt., 2000; Bruyere, Janot, 2000; Brochier ir kt., 2001; Besch, 2001), įskaitant ir Lietuvą, kurioje 2006-2011 m. buvo naudojama 20 jaukų su pasiutligės vakcina į 1 km2 platinimo schema.
Pasiutligės kontrolės ir kovos priemonės ilgą laiką buvo glaudžiai siejamos su lapių, kaip viruso plitimo vektoriaus, populiacijos mažinimo programomis, tačiau jos nedavė laukiamo rezultato. Tuo tarpu pradėjus taikyti pasiutligės oralinės vakcinacijos (POV) profilaktiką per paskutiniuosius 25 metus Europoje pasiektas 90–100 proc. efektyvumas. Tai įgalino pasiutligės epidemiologinį frontą nustumti į Europos rytinius regionus. Tai pirmasis atvejis, kai patogenas eliminuotas iš populiacijos taikant vakcinacijos ir nenaudojant populiacijos mažinimo priemonių (Vitasek, 2004). POV programų analizė daugelyje Europos šalių (Vokietijoje, Austrijoje, Šveicarijoje, Belgijoje, Prancūzijoje) įrodė šios priemonės išskirtinį efektyvumą kontroliuojant ir likviduojant pasiutligės
židinius lapių populiacijoje (Stohr, Meslin, 1996; Muller, Schlutter, 1998; Vos, 2003). 1980-aisiais pasiutligės vakcinos jaukai buvo platinami rankiniu būdu, pasitelkiant medžiotojus ir miškininkus. Šis metodas buvo veiksmingas, ypač aukšto urbanizacijos lygio regionuose, dėl galimybės platinti jaukus prie lapių olų, tačiau šis metodas buvo brangus, o vakcinacijos programa trukdavo ilgai (Winkler, Bogel, 1992). Pasiutligės profilaktikai panaudojus lėktuvus bei sraigtasparnius, vakcinos platinimo priemonės tapo efektyvesnės, atsirado galimybė atlikti POV dideliuose regionuose ir išmėtyti jaukus per trumpą laiką (Vos ir kt., 2000). Pagrindinis POV kampanijos tikslas yra pasiekti maksimalų vakcinuojamo gyvūno ir vakcinos kontaktą. Esant POV efektyvumui 60–70 proc., galima tikėtis nutraukti infekcijos grandinę. Tačiau tuo atveju, kai vakcinuojama 80 proc. populiacijos, galima tikėtis ne tik nutraukti pasiutligės plitimą, bet ir visiškai kontroliuoti infekcijos dinamiką bei pradėti likvidavimo procesą (Tischendorf ir kt., 1998; Vos, 2003). Kiekvienos POV programos teorinis planavimas siejamas su vakcinuojamų gyvūnų (lapių) populiacijos kiekybiniais ir kokybiniais rodikliais. Neįmanoma administruoti vakcinacijos programų neturint patikimų duomenų apie lapių populiacijos koncentraciją (tankumą) vakcinuojamame areale. Kai kurios POV buvo mažai efektyvios dėl mažo platinamų jaukų skaičiaus ploto vienete (Breitenmoser, Muller, 1997; Cliquet ir kt., 2000). Lapių populiacijos koncentracija ploto vienete (priimta 1 km2) gali keistis kasmet ir metų bėgyje, tačiau su statistinėmis programomis ir modeliais galima nustatyti vidutinį individų skaičių ir jų gyvenamojo arealo dydį. Pavyzdžiui, daugelyje POV programų buvo naudojamas statistinis jaukų vidurkis ploto vienete – 15 jaukų/km2, įvertinant vidutinį statistinį lapių koncentracijos vidurkį ploto vienete (1 lapė/km2), tai yra jaukų skaičius turi būti 10 – 15 kartų didesnis už vidutinį lapių skaičių 1 km2 ploto vienete (Linhart, 1993). Daugiausia diskusijų laukinių gyvūnų pasiutligės profilaktikos srityje kyla dėl POV strategijos. Teritorinis vakcinacijos planavimas ir jaukų koncentracija 20 jaukų/km2 (vertinant statistinį lapių tankį 1 lapė/km2) garantavo vakcinacijos efektyvumą daugelyje šalių, kur pasiutligės problema išspręsta (Muller, 1998; Thulke, 2004). Esant didesnei lapių koncentracijai rekomenduojama ne didinti jaukų skaičių, bet mažinti skridimo linijinius parametrus, tai yra skristi linijomis tarp kurių tarpas yra ne po 1 km, bet 500 metrų (Thulke, 2004). Lietuvoje statistinis lapių koncentracijos ploto vienete vidurkis skirtinguose regionuose yra 0,65–2,4 lapės/km2 (subjektyvūs duomenys, atsižvelgiant į medžioklės statistiką), todėl nacionalinė POV programa turi būti ruošiama įvertinant regioninius lapių populiacijos ypatumus. Paskutiniųjų metų pasiutligės epidemiologinė analizė Lietuvoje rodo aktyvius virusų persistentinius procesus usūrinių
šunų populiacijoje, todėl ne tik lapės, bet ir usūriniai šunys gali būti vertinami kaip kritiniai pasiutligės grėsmės faktoriai. Be to, usūrinių šunų pasiutligės ekologija yra skirtinga nuo lapių, atitinkamai šiame segmente turi būti koreguojamos ir POV programos, tačiau lapių oralinė vakcinacija lieka prioritetine pirmo pasirinkimo pasiutligės profilaktikos priemone visoje laukinių mėsėdžių kategorijoje (Zienius, 2007).
1995 – 2000 metų laukinių gyvūnų pasiutligės oralinė vakcinacija (POV) Lietuvoje buvo neefektyvi – susirgimų pasiutlige po vakcinacijos padidėjo 3,7 karto, o šios zoonozės aktyvumas tarp laukinių gyvūnų pasidarė ypač ryškus – 74 proc. POV kontroliuojamas vakcinacijos efektyvumas nebuvo pakankamai efektyvus ir statistiškai patikimas (tetraciklino žymenų tyrimai: 189 (59 teigiami) – 0,023 proc. bendro vakcinacijai panaudoto vakcinos jaukų skaičiaus, serologinis tyrimas (IFA) – 138 (75 teigiami) – 0,017 proc. atitinkamai). 1995–2000 metų POV programa apėmė tik 15 proc. Lietuvos teritorijos ir pilnai įgyvendinta tik Šiaulių ir Panevėžio apskrityse (Zienius, 2007).
Nuo 2006 m. Lietuvoje įgyvendinama laukinių gyvūnų vakcinacijos nuo pasiutligės programa – Europos Komisijos koordinuojama ilgalaikė pasiutligės likvidavimo priemonė, apimanti visas Baltijos šalis. POV vykdoma visoje Lietuvos teritorijoje, kasmet pavasario ir rudens-žiemos vakcinacijos kampanijų metu išmėtoma po 1300 tūkst. pasiutligės vakcinos jaukų, vakcinacijos arealas – 65 tūkst. km2. 2007 m. laukinių gyvūnų vakcinacija, finansuojama iš ES biudžeto lėšų, pradėta ir Rusijos Federacijos Kaliningrado srityje. 2011 m. Lietuvos Respublikos Valstybinei maisto ir veterinarijos tarnybai (VMVT) ir Baltarusijos Respublikos žemės ūkio ir maisto ministerijai pasirašius bendradarbiavimo susitarimą dėl laukinių gyvūnų oralinės vakcinacijos Baltarusijos teritorijoje, pradėta laukinių gyvūnų pasiutligės oralinė vakcinacija 50 km buferinėje zonoje Baltarusijos Respublikoje. Šio susitarimo pagrindu skirtas neatlygintinas Europos Sąjungos finansavimas laukinių gyvūnų pasiutligės likvidavimui Baltarusijos ir Lietuvos pasienio teritorijoje (jaukų su vakcina nuo pasiutligės įsigijimui ir jų platinimui (išmėtymui iš orlaivių), laboratorinių tyrimų atlikimui, siekiant įvertinti POV efektyvumą.). Jaukai su vakcina nuo pasiutligės išmėtomi 50 km atstumu nuo Lietuvos sienos 33 000 km2 plote (11 pav.).
11 pav. Pasiutligės oralinės vakcinacijos buferinė zona Baltarusijos
Respublikoje
Pastaba: pagal http://vmvt.lt
Pasiutligės likvidavimo programų vykdymas kaimyninėse šalyje yra labai svarbus veiksnys, siekiant kontroliuoti ir likviduoti pasiutligę Lietuvoje.
2.6. Pasiutligės oralinės vakcinacijos epidemiologinė rizika (gyvų atenuotų pasiutligės oralinių vakcinų persistencija)
Gyva atenuota pasiutligės vakcina turi būti kontroliuojama dėl PV patogeniškumo reversijos galimybės ir vakcininės padermės virusų persistencijos laukinėje faunoje. Gyvų atenuotų vakcinų panaudojimas profilaktikai visada susietas su rizika dėl vakcininių virusų padermių patogeniškumo reversijos. Vokietijoje ir Austrijoje (Muller ir kt., 2009), vykdant oralines pasiutligės vakcinacijas, nuo 1983 m. buvo panaudotos 97 mln. SAD B19 ir SAD P5/88 gyvų pasiutligės vakcinų dozių. 2001-2006 m. atliekant pasiutligės epidemiologinės stebėsenos programą, buvo nustatyti 6 lapių pasiutligės atvejai, kada FAT ir MIT tyrimais pasiutligės atžvilgiu teigiamuose mėginiuose filogenetiškai buvo nustatomos analogiškos amino rūgščių sekos ir nukleotidų pakitimai kaip ir prototipinėse vakcininėse padermėse. Nors eksperimentiniai tyrimai parodė, kad minėtos genetinės mutacijos neturėjo įtakos virusų patogeniškumui, teoriškai toks didelis pasiutligės vakcininės padermės plėtros arealas (beveik visa europinė
