Limitazioni delle cellule Caco-2

Malgrado l’ampio utilizzo delle cellule Caco-2 nel corso degli anni, questo modello cellulare presenta ancora diverse limitazioni.

Una di queste, già menzionate in precedenza, è il livello di TEER, che risulta molto maggiore rispetto quello dell’epitelio in vivo, una volta raggiunto il completo differenziamento. La cacofilicità e la staticità dei parametri ambientali rappresentano un ulteriore ostacolo alla riproducibilità in vitro su Transwell^®; ostacolo al quale hanno tentato di far fronte i diversi design fluidici e tridimensionali dei bioreattori sviluppati.

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Figura 38 (A) schema del sistema automatizzato di dispensazione del media fra i vari OOC controllato tramite l’azione programmabile dell’interrogator. (B) Rappresentazione degli 8 OOC utilizzati per modellare i rispettivi organi biologici.

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65 Un limite ancora difficile da superare è quello dovuto alla variabilità nelle colture sviluppate nei diversi laboratori, che si rispecchia nelle discrepanze fra i risultati ottenuti in set-up distinti. La variabilità può essere data da differenze in: condizioni di coltura (composizione, pH, osmolarità del terreno di coltura), condizioni sperimentali (trattamento delle cellule, lavaggi con buffer salino) e numero di passaggi ed età delle cellule. Anche a parità di protocollo di coltura, queste sorgenti di errore possono portare alla diversa espressione di alcuni trasportatori, come il P-gp.

Proprio il pattern di espressione di enzimi e trasportatori può rivelarsi il maggior fattore limitante nell’utilizzo di cellule Caco-2. Alcuni trasportatori, particolarmente rilevanti nella ricerca farmaceutica, sono sottoespressi rispetto all’ambiente in vivo, come nel caso di quelli che, come substrato, presentano i farmaci ACE-inibitori, la cui permeabilità in vitro risulta molto ridotta. Anche molecole terapeutiche idrofiliche con basso peso molecolare come la metformina sono scarsamente assorbite in vitro mentre, sull’uomo, l’assorbimento si attesta attorno al 50%. Tali mancanze sono dimostrate anche dalla differente espressione genica delle cellule Caco-2.

L’espressione ridotta riguarda anche l’enzima digestivo CYP-3A4, che può essere, però, incentivata attraverso una diversa composizione del terreno di coltura o con la trasfezione delle cellule.

Tale tecnica è stata impiegata anche per indurre l’espressione del trasportatore PEPT1 che non può essere, altrimenti, sintetizzato dalle cellule Caco-2 in condizioni di coltura standard. L’utilizzo di questa strategia di biologia molecolare ha, tuttavia, presentato diversi svantaggi e risultati non sempre consistenti. [47]

La soluzione nella quale avviene sviluppata la coltura è di natura acquosa, perciò, nel caso di molecole scarsamente idrosolubili in fase di studio è necessario aggiungere solventi che possono, tuttavia, essere dannosi per le cellule Caco-2, se addizionati in alte concentrazioni. [50]

La natura neoplastica, inoltre, si rivela un fattore limitante, poiché sono stati riscontrati comportamenti differenti dalle cellule native intestinali nel caso di interazione con microbi e patogeni.

Spesso, le cellule Caco-2, poiché dimostrano una scarsa capacità di differenziarsi in cellule mucipare, devono essere poste in co-coltura con HT29-MTX che, invece, riproducono tale fenotipo e secernono lo strato di muco necessario per la riproduzione fisiologica intestinale. [47] [50]

Il throughput degli assay di permeabilità intestinale su 12 o 24-well standard è molto basso e ciò provoca l’aumento del prezzo per la sperimentazione di nuovi farmaci, che si attesta attorno ai 19$

per ogni test effettuato. A tale scopo sono stati implementati multi-well più ampi (che comprendono fino a 96 pozzetti) per aumentare l’efficienza dei processi di studio. [76]

Il cambio del terreno di coltura nell’arco dei 21 giorni standard per raggiungere confluenza e differenziamento deve essere effettuato ogni 2-3 giorni (minimo 9 cambi in tale arco temporale) e ciò

66 causa uno stress importante sulle cellule. In caso di rimpiazzo completo del terreno di coltura esausto con quello fresco (ricco di nutrienti, fattori di crescita e antibiotici) è stata osservata in diverse linee cellulari l’attivazione di geni legati alla sofferenza cellulare come il p8, che riveste la stessa funzione di risposta ad eventi stressogeni anche in altri tessuti. Tale effetto è transitorio, ma può provocare artefatti nei risultati degli studi, se non viene preso in considerazione. È stato notato, tuttavia, che un rimpiazzo solamente del 25% del terreno di coltura annulla gli effetti cellulari della perturbazione. [77]

Il tempo necessario per il completo differenziamento del monolayer (circa 21 giorni), è uno dei fattori che limita maggiormente l’efficienza dei modelli cellulari basati su Caco-2. Diverse metodologie di coltivazione sono state sviluppate per far fronte al problema. Una di queste è l’utilizzo di supporti 3D, l’applicazione di un flusso o una combinazione delle due, mediata dall’uso dei bioreattori, ma al momento tali strumenti non sono ancora standardizzati e, di conseguenza, utilizzabili su larga scala in ambito industriale.

In uno studio si è proceduto alla supplementazione con 2% siero fetaledi vitello (sCS – supplemental Calf Serum) e una combinazione di fattori di crescita e ormoni che hanno permesso di ridurre la quantità di FBS (che normalmente si attesta attorno al 10%) e i costi di coltura. La variabilità nelle caratteristiche dell’FBS, inoltre, può portare ad uno sviluppo imprevedibile delle cellule. Con l’utilizzo di sCS sono stati sufficienti 4 giorni per il completo differenziamento del monolayer.

Tuttavia, malgrado la comparsa di giunzioni strette, queste non sono risultate sufficientemente strutturate, causando l’aumentata permeabilità ad alcune molecole (come il Mannitolo). Le cellule, inoltre, non hanno sviluppato lo stesso numero di pompe di membrana rispetto alle colture canoniche.

In un lavoro successivo è stata addizionata al terreno di coltura, della puromicina. Questa, molecola ha funzione antibiotica e si ipotizza che possa migliorare la compattezza epiteliale in vitro eliminano le cellule contaminanti, come i periciti. In questo esperimento le cellule Caco-2 hanno mostrato un completo differenziamento in 6 giorni di coltura e una buona affidabilità nel valutare la Papp di diversi composti. [78] [79]

In commercio è presente un sistema di coltura HTS (High throughput screening) pronto all’uso:

il BioCoat^®. Si tratta di un supporto che offre un array di inserti nei quali le membrane contengono già il medium ottimizzato per la tipologia di cellule da porre in coltura e sono rivestiti di materiali in grado di promuovere la proliferazione e l’adesione cellulare. In particolare, sono commercialmente disponibili kit che sfruttano rivestimenti in Collagene (tipo I o IV), Gelatina, Poli-lisina, Fibronectina, Laminina o Matrigel.

Il Caco-2 BioCoat Assay System, particolarmente adatto alla coltura di cellule Caco-2, sfrutta una membrana in PET, rivestita di collagene fibrillare, in un sistema a 24-well uniti in un'unica piastra.

67 L’impiego di questo strumento si è dimostrato vantaggioso in quanto, oltre a permettere la riduzione della quantità di siero utilizzato, minimizza il tempo necessario per la coltura a solamente 3 giorni.

Inoltre, grazie alla consistenza delle caratteristiche fra lotti diversi dei KIT, i controlli sulla qualità del prodotto e la riduzione del rischio di errore dovuto alla manipolazione dell’operatore nel set-up dell’assay, risulta un metodo standardizzato sicuro e affidabile per la coltura, in grado di eliminare parte delle discrepanze nei risultati ottenute da laboratori diversi.

Tuttavia, si tratta di un prodotto proprietario, dal costo elevato e, per questo, difficilmente sfruttabile su larga scala. [47] [80] [81] [82]

Figura 39 Papp relativa ad (A) Lucifer Yellow e (B) Propanolo nelle cellule trattate con il metodo di coltura standard, dopo 21 giorni (bianco) e quelle poste in coltura (nero) in un sistema BIOCOAT^® HTS Caco-2 Assay modificato. (C) Monolayer formato dalle cellule Caco-2 nel Corning® BioCoat™ Intestinal Epithelial Cell Environment ottenuto dopo soli 3 giorni di coltura.

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