TEER

Per la valutazione dell’integrità del monolayer, oltre allo stato di differenziamento cellulare vengono utilizzati diversi metodi di ispezione e testing, che si avvolgono dell’utilizzo di biomarker specifici.

Uno degli esami maggiormente applicati alle colture epiteliali è quello della valutazione del TEER (Transepithelial Electrical Resistance). Questo parametro fornisce una panoramica diretta dell’integrità strutturale dello strato cellulare e dello sviluppo delle giunzioni strette fra le cellule.

Il TEER è rilevato fornendo, con degli elettrodi, una corrente nota (I) attraverso l’epitelio e registrando la differenza di potenziale (V) che si genera a causa dell’ostacolo cellulare interposto (Figura 19A).

Con questo dato sarà, quindi, possibile calcolare la resistenza opposta dall’epitelio attraverso l’applicazione della legge di Ohm: 𝑉 = 𝑅 𝑥 𝐼. Più la resistenza R sarà alta, più le giunzioni strette

39 saranno sviluppate fra cellule adiacenti. Il TEER è, inoltre, correlato alla superficie epiteliale studiata, perciò viene misurato in 𝛺𝑐𝑚². [51] [52]

La corrente può essere fornita con due metodologie distinte: in continua o in alternata. Nel primo caso, tuttavia, si corre il rischio di causare un danno alle cellule e la polarizzazione degli elettrodi. Utilizzando una corrente alternata, è possibile evitare queste problematiche ed estrapolare una maggiore quantità di informazioni dal test stesso. L’epitelio, infatti, può essere elettricamente visto come un circuito che comprende sia componenti capacitive che resistive (Figura 19B). Queste ultime, a basse frequenze (<5 kHz), non permettono il passaggio di corrente, comportandosi come circuiti aperti mentre, aumentando la frequenza, le capacità diventano sempre più conduttive, aggiungendo il loro contributo al TEER. In questo modo è possibile monitorare, oltre all’integrità della barriera, l’adesione, la migrazione e i micro-movimenti cellulari. [51]

Il sistema di rilevamento più utilizzato per il TEER è il EVOM (Epithelial VoltOhmMeter), che sfrutta due elettrodi a bacchetta con i quali fornisce una corrente alternata alla frequenza di 12,5 Hz e con un’ampiezza di 10 µA. Questo strumento è, successivamente, stato sostituito dall’𝐸𝑉𝑂𝑀², che sfrutta quattro elettrodi per effettuare la misura ad istanti discreti. [45]

Alcuni dei problemi di questo sistema, tuttavia, sono stati riscontrati nella non uniformità del campo elettrico prodotto, che può portare ad una misura imprecisa e dipendente dalla posizione degli elettrodi al di sopra del materiale cellulare. Inoltre, essendo le colture standard prevalentemente statiche, il passaggio netto di soluti fra i due compartimenti può causare la formazione di strati di fluido con concentrazioni differenti, che influiscono sulla misura del TEER. [53]

Esponendo gli elettrodi a un flusso, invece, si corre il rischio di ottenere degli artefatti dovuti al movimento ionico attorno ad essi. [45]

Il supporto stesso dell’inserto può dare un contributo non trascurabile alla misura del TEER perciò, in certi casi, può essere consigliabile valutare la resistenza nel Transwell in assenza della componente cellulare, per poi sottrarre tale valore a quello ottenuto in sua presenza.

Inoltre, a causa dell’applicazione di corrente alternata, la componente resistiva del monolayer viene in parte cortocircuitata, portando a una sottostima della resistenza epiteliale effettiva.

Quest’ultima mostra anche una dipendenza dalla temperatura, perciò gli elettrodi devono essere sottoposti ad un costante controllo tramite appositi sensori per effettuare misure prolungate. [53]

In alternativa all’utilizzo di elettrodi controllati manualmente, è stato sviluppato un sistema automatizzato denominato cellZscope (Figura 19C), in grado di esaminare il valore di TEER di cellule in coltura sulle membrane porose degli inserti standard. Questo strumento sfrutta il principio della spettroscopia di impedenza, in cui la frequenza della tensione alternata somministrata viene fatta

40 variare in un range di valori misurando, per ognuno di essi, la fase e l’ampiezza della corrente alternata risultante. La spettroscopia di impedenza si rivela un metodo affidabile e non invasivo per la valutazione dell’impedenza totale del monolayer, che comprenderà sia il valore di resistenza, che quello di capacitivo del materiale cellulare.

Il cellZscope, in particolare, fornisce uno stimolo sinusoidale a 45mV e restituisce in uscita i valori di TEER, capacità e resistenza dello strato cellulare. Il valore capacitivo registrato si è rivelato un buon indicatore per il monitoraggio dello sviluppo delle estroflessioni cellulari apicali (microvilli).

Fra i principali vantaggi del cellZscope possono essere annoverati la capacità di alloggiare una grande quantità di inserti standard (da 24, 12 o 6-well) senza la necessità di dispositivi aggiuntivi e ciò lo rende un valido strumento per il controllo dello stato delle colture e la valutazione degli effetti delle molecole in fase di studio, su di esse. [51] [52] [54]

Alla luce delle varie misurazioni effettuate in diversi studi, il valore di TEER delle cellule Caco-2 esprime un plateau a 234 𝛺𝑐𝑚², mentre è stato stimato che quello dell’epitelio del tenue si aggira attorno ai 25-40 𝛺𝑐𝑚². Ciò indica una sovraespressione di giunzioni strette nella linea cellulare immortalizzata rispetto all’epitelio in condizioni fisiologiche; mentre risulta maggiormente accurato per la modellazione del colon, dove il TEER può raggiungere i 300 𝛺𝑐𝑚² in vivo. Il valore di TEER presentato delle cellule Caco-2, tuttavia, ha dimostrato una enorme variabilità fra diversi studi laboratoriali, spaziando da 80 a 1420 𝛺𝑐𝑚². [50] [55]

Figura 19 (A) Modalità di misura del TEER attraverso due elettrodi posizionati ai lati opposti del monolayer, fra i quali viene fatta scorrere la corrente. (B) Analogo elettrico del monolayer, dove Rmedium è la resistenza offerta dal terreno di coltura, Rmembrana è la resistenza offerta dalla membrana, mentre il TEERrappresenta la resistenza della via paracellulare. Le capacità CCl e CEl rappresentano, rispettivamente, quelle offerte dalla cellula e dall’elettrodo di misurazione. (C) Schema del dispositivo CellZscope che permette di misurare automaticamente e in modo continuo il TEER all’interno di colture standard con un design in grado di ospitare da 6 a 24 inserti.

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