Linee guida per la somministrazione del farmaco in funzione dei diversi genotipi 49

Le mutazioni del gene CYP2C9 possono influenzare la corretta determinazione della dose terapeutica iniziale per molti farmaci; per i pazienti cui è stato evidenziato un profilo metabolico alterato (PM e IM) è auspicabile un attento e continuo monitoraggio dell’effetto terapeutico dei farmaci somministrati (§1.3) (Lindh et al., 2009). Queste tipologie di pazienti sono infatti esposte più frequentemente ad effetti indesiderati qualora vengano trattate seguendo l’approccio terapeutico standard e necessitano di un dosaggio farmacologico inferiore alla norma per ottenere un’azione terapeutica ottimale.

Relativamente al dosaggio, su una ricerca di Kirchheiner et al. (2004) riguardante i metabolizzatori PM e IM, si può affermare che:

 nei metabolizzatori lenti (PM) occorre ridurre il dosaggio di circa il 20-60% o oltre rispetto alla dose standard somministrata a un individuo wild type; è raccomandato inoltre il monitoraggio dell’attività terapeutica del farmaco attraverso la valutazione dell’INR;

 nei metabolizzatori intermedi (IM) occorre accertarsi che la dose di somministrazione sia circa del 5-25% inferiore a quella standard ed evitare terapie farmacologiche multiple, che possono causare possibili squilibri nel metabolismo umano.

Lo studio di Adcock et al. (2004) ha riscontrato che i pazienti con polimorfismi del genotipo CYP2C9, in particolare le varianti alleliche *2 e *3, dimostrano una ridotta capacità

enzimatica nella terapia con la warfarina e richiedono pertanto un regime a basso dosaggio. Per gli individui con genotipo CYP2C9 *3/*3 è prevista una riduzione della dose del 90% rispetto alla dose standard somministrata a un individuo wild type, mentre per un paziente CYP2C9 *2/*3 è prevista una riduzione del 20% rispetto alla dose standard.

Un altro fattore che complica l’azione farmacologica è la possibile interazione con altri farmaci assunti contemporaneamente, i quali possono ridurre o aumentare l’attività catalitica del CYP2C9. Un paziente può richiedere pertanto una notevole riduzione del dosaggio del farmaco rispetto ad un altro soggetto, pur avendo la stessa tipologia di genotipo; è quindi molto importante interpretare i risultati dell’effetto farmacologico nel contesto della somministrazione contemporanea con altri farmaci.

L’attività del genotipo CYP2C9 dipende infine anche dallo stato funzionale epatico e renale; non vi sono attualmente evidenze sperimentali relative all’effetto diretto dell’età del paziente sull’efficienza catalitica del genotipo CYP2C9; tuttavia, quest’ultima può essere indirettamente alterata a causa di variazioni del flusso sanguigno epatico o di ridotta capacità di eliminazione renale dei metaboliti dovuta all’età (Mangoni et al., 2004) (Klein et al., 2009).

La warfarina, come già accennato, inibisce il genotipoVKORC1 riducendo la quantità di vitamina K disponibile nella fase di coagulazione del sangue; questo aspetto della coagulazione è collegato anche alla fase di attribuzione della dose al paziente, se questo presenta alterazioni alleliche anche per il genotipo VKORC1. Un dosaggio inappropriato di warfarina è stato associato a un rischio sostanziale di maggiori e minori emorragie (Kamali et

al., 2006) (Limdi et al., 2010).

Uno studio di Carlquist et al. (2006) ha individuato nelle varianti alleliche dei genotipi CYP2C9 e VKORC1 la causa della sostanziale variabilità della dose giornaliera di warfarina richiesta durante la terapia di stabilità dell’INR; in particolare, si ha che per un wild type la dose di warfarina settimanale è di 33.3 mg, per un CYP2C9 *2 la dose settimanale è di 25 mg e per un CYP2C9 *3 è di 10 mg. Si evidenzia come la dose per un soggetto con CYP2C9 *3 sia inferiore del 70% rispetto a quella attribuita a un soggetto wild type. Analogamente, per quanto concerne il genotipo VKORC1 è prevista una dose settimanale di 38.4 mg per soggetti GG, 28.6 mg per gli AG e 20.9 mg per i AA.

L’FDA (Food and Drug Administration) nel 2007 ha approvato una revisione del foglietto illustrativo del farmaco, sottolineando l’opportunità e l’utilità di considerare il dato genetico

CYP2C9

VKORC1 *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3

GG 5-7 mg 5-7 mg 3-4 mg 3-4 mg 3-4 mg 0.5-2 mg

AG 5-7 mg 3-4 mg 3-4 mg 3-4 mg 0.5-2 mg 0.5-2 mg

AA 3-4 mg 3-4 mg 0.5-2 mg 0.5-2 mg 0.5-2 mg 0.5-2 mg

3.2.4 Tecniche di identificazione dei genotipi

Le tecniche di identificazione dei genotipi permettono sia di classificare i soggetti in relazione alla tipologia di genotipo, sia di ricercare i possibili polimorfismi dei CYP2C9 e VKORC1. Una delle tecniche maggiormente utilizzate per l’identificazione è la PCR (Polymerase Chain

Reaction); la metodologia classica si basa sull’amplificazione specifica ed esponenziale di

sequenze di DNA di lunghezza variabile a partire da una quantità esigua di DNA in esame. La specificità del metodo si deve all’utilizzo di corte sequenze nucleotidiche, che appaiano in maniera specifica su filamenti opposti di DNA, delimitando in tal modo la sequenza da amplificare. Esse inoltre fungono da innesco per la DNA polimerasi, la quale catalizza l’addizione dei deossinucleotidi (unità ripetitive nel DNA) al filamento nascente. La reazione di PCR si svolge in tre fasi: denaturazione (i due filamenti di DNA vengono separati),

annealing (creazione di un legame tra due parti complementari del DNA) ed allungamento (o

estensione); la ripetizione di queste, per un numero di volte che va da 30 a 35, permette di aumentare in modo esponenziale la popolazione di sequenze amplificate del DNA di interesse.

Una variante della tecnica PCR è la cosiddetta RT-PCR (Real Time PCR); essa rappresenta un’evoluzione della tecnica PCR end-point (cioè di reazione terminale) che consente non solo un’analisi quantitativa del DNA di partenza, ma anche una riduzione delle manipolazioni post-amplificazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale. La PCR Real Time può essere effettuata con due differenti chimiche di reazione; la prima vede l’utilizzo di coloranti fluorescenti che si intercalano in modo aspecifico nella

doppia elica del DNA amplificato, la seconda vede invece l’utilizzo di sonde fluorescenti specifiche per il tratto di DNA da amplificare. L’utilizzo di sonde specifiche viene sfruttato nelle indagini di discriminazione allelica per identificare i polimorfismi di sequenza, così come per l’uniformazione di virus e batteri.

Allo stato attuale, la miglior tecnica per l’identificazione delle varianti alleliche dei geni CYP2C9 e VKORC1, e per le informazioni per il dosaggio della warfarina, sia il sequenziamento bidirezionale (McClain et al., 2008); in commercio sono disponibili diversi kit diagnostici basati su altre tecnologie, meno costose e più rapide. Nel settembre 2007 l’FDA ha approvato la prima notifica per un test farmacogenetico sviluppato da Nanosphere Inc., “Verigene®

Warfarin Metabolism Nucleic Acid Test” (Verigene^® System) per identificare le varianti alleliche dei geni VKORC1 e CYP2C9 *2 *3. Altri tre test diagnostici sono stati approvati dalla FDA nel 2008-2009: “AutoGenomics, Inc., Infiniti^® Warfarin Assay” (sistema

biofilm-chip-microarray), “Paragon DX, Rapid Genotyping Assay CYP2C9 & VKORC1” (sistema RT-PCR) e “Osmetech Molecular Diagnostics, eSensor^® Warfarin Sensitivity Test and eSensor^® XT-8 System” (sistema micro array con estrazione del DNA, purificazione e

ibridazione su chip) e “TrimGen Corp., eQ-PCR^™ LC Warfarin Genotyping Kit” (tecnologia

Real-Time); tali test indagano sulla possibile presenza dei polimorfismi sugli alleli CYP2C9 *2 *3 e VKORC1.

È possibile, inoltre, conoscere i diversi genotipi, per le varianti alleliche CYP2C9 e VKORC1, anche da alcuni laboratori riconosciuti che utilizzano come metodologie di indagine la PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) o il sequenziamento.