La marcatura con alizarina, si presenta come un sistema molto valido per verificare il tasso riproduttivo in ambiente naturale e controllare se i soggetti presenti sono conseguenza del solo ripopolamento (quindi senza popolazioni riproduttive in natura).
Il rosso Alizarina è comunemente utilizzato per identificare la presenza di calcio nei tessuti. Questa molecola, infatti, si lega agli ioni di calcio, con il quale, grazie ad un processo di chelazione crea un complesso stabile. Questo complesso è rifrangente e ne permette quindi la sua facile identificazione, lasciando quindi una marcatura perenne (rossa) all’interno del tessuto osseo.
Otoliti marcati con alizarina (destra) dove si osserva la linea rossa più evidente, rispetto ad uno non marcato (sinistra).
Il prodotto è già stato autorizzato e certificato dalla Biological Stain Commission
45 Esistono diversi protocolli, per il suo impiego, per la marcatura sia delle uova embrionate che degli stadi giovanili.
MARCATURA DELLE UOVA EMBRIONATE
Questa tecnica permette di marcare uova embrionate di salmonidi, alla comparsa degli occhi, grazie alla capacità dell’alizarina di fissarsi al calcio degli otoliti, in sviluppo durante questa fase. La marcatura è possibile quando le uova hanno uno sviluppo compreso tra il 65 % ed il 90 %. La soluzione per la marcatura è realizzata sciogliendo 20 gr di Alizarina in 1 litro di soluzione. Il ph deve essere mantenuto prossimo a 7, la temperatura inferiore a 10 °C, e la concentrazione di ossigeno compreso tra 80 – 100 % della avannotto a sacco vitellino parzialmente riassorbito. E’
quindi possibile verificare la riuscita del ripopolamento o la percentuale di soggetti selvatici o immessi, in base alla presenza della colorazione con alizarina, anche a distanza di molto tempo.
Purtroppo non è stato possibile testare, almeno per il 2014, testare questa metodica con le uova di trota marmorata, ma si spera di poterlo eseguire nel corso della stagione riproduttiva 2014/2015.
MARCATURA DEI GIOVANILI DI TROTA
Questo metodica è quella adottata per la marcatura di giovanili di salmonidi e prevede il seguente protocollo:
1 – Bagno di circa 3 ore degli avannotti, ormai in fase di alimentazione (almeno 800 ° giorno) alla concentrazione di 150 ppm di alizarina e alla densità massima simile a quella delle vasche di allevamento. 2 dosi da 3 gr di alizarina permettono di realizzare 20 litri di soluzione per la marcatura.
46 2 – Durante il bagno l’acqua deve essere mantenuta ben ossigenata (100 – 150 %), con un ph superiore a 6,8 e temperatura inferiore a 12 °C.
3 – Una volta terminata la prova, il bagno sarà lasciato evaporare per poi essere eliminato come normale rifiuto.
Dopo il bagno, i pesci saranno fatti crescere in una vasca separata per altri 30 giorni, in modo tale da permettere il completo fissaggio dell’alizarina a livello del tessuto osseo e, in particolare, degli otoliti ed eventualmente delle scaglie. Il rosso Alizarina permette di lasciare un “segno” perenne nel tessuto osseo e quindi permette di identificare anche a distanza di molti anni un esemplare marcato.
Questa metodica è stata già provata con gli avannotti di trota marmorata in una prima fase nel corso del 2012 e poi nuovamente nel 2014. Nel 2012 è stato possibile verificare che gli esemplari presentavano anche le scaglie marcate. Questo sarebbe un grande vantaggio perché eviterebbe la soppressione dell’esemplare per la rimozione degli otoliti. Sarebbe però opportuno ripetere questa prova anche con soggetti rilasciati in ambiente naturale, perché si potrebbe verificare la scomparsa della marcatura.
La mortalità durante il bagno colorante è stata comunque minima ed inferiore al 10 %.
Nel corso del 2014 è stata condotta una seconda prova di marcatura con alizarina con giovanili di trota marmorata del peso medio di 1 gr per un totale di 8.000 esemplari.
Sono stati impiegati 25 g di alizarina per ottenere 170 litri di soluzione colorante, divisa in due grosse vasche (70 l ciascuna) ed una piccola (30 l totale) con la funzione per vasca di accumulo per il piccolo sistema a ricircolo.
Confezione di alizarina in polvere da 25 g (costo totale approssimativo 70 Euro).
La prova è stata condotta in data 7 maggio 2014, ed in una sola fase sono state marcate 8000 trotelle di marmorata. Si tratta infatti, di un sistema veloce (ed economico) perché in sole tre ore è stato marcato tutto il lotto indicato.
Di seguito, le diverse fasi dell’operazione:
1 – Vasche allestite prima della marcatura. Si nota la presenza della bombola di ossigeno e degli ossigenatori.
47 2 – Vasche con le trotelle, prima di aggiungere il colorante.
3 – Fase di marcatura con alizarina. Si nota l’intensa aereazione/ossigenazione all’interno delle vasche.
4 – Fase finale del processo di marcatura, con l’aggiunta di acqua fresca e la diluizione dell’alizarina.
Il procedimento è stato condotto dalle ore 13 alle ore 16 per tre ore, durante le quali è stato monitorato costantemente il pH, la temperatura e la concentrazione di ossigeno disciolto (vedi dati)
ORARIO TEMPERATURA OSSIGENO % PH MORTALITÀ
13.00 12,8 °C 84 % 7,70 nessuna
14.00 13,1 °C 82 % 7,80 nessuna
15.00 13,4 °C 82 % 7,90 nessuna
16.00 13,7 °C 82 % 7,98 nessuna
Valori di riferimento nell’acqua di allevamento: temperatura 12,2 °C, Ossigeno 84 %, ph: 7,98.
La mortalità osservata è stata inferiore alle 0,5 %.
48 Dopo un’ulteriore fase di accrescimento di circa 45 giorni per permettere il completo fissaggio dell’alizarina, i soggetti marcati sono stati rilasciati in ambiente. Solo un piccolo lotto di circa 50 esemplari è stato mantenuto in allevamento per la verifica dell’avvenuta marcatura e come campione di riferimento.
I soggetti rilasciati il 17 giugno 2014 dovevano essere ricatturati nel corso del 2015 per verificare sia la presenza della marcatura sia il loro adattamento e colonizzazione dell’ambiente naturale.
Purtroppo in data 21 luglio si sono verificati nelle zone di semina eventi meteorologici avversi che ha provocato danni notevoli sul territorio, coinvolgendo, tra l’altro, la troticoltura “La Peschiera di Velo d’Astico. Questo evento non ci ha permesso il recupero nei posti di semina e dintorni degli esemplari marcati.
Dott. Armando Piccinini
Spin Off Accademico Gen Tech – Parma
Parma, Ottobre 2015
49 PRODUZIONE DI TROTA FARIO STERILI – TRIPOIDI
Attività presso il Centro Ittico di Valdastico
E’ stata richiesta e fornita assistenza tecnica per eseguire prove sperimentali di produzione di trote fario sterili (triploidi) con trattamento pressorio di uova fecondate a mezzo della nuova macchina pressoria presente presso il centro per verificare la fattibilità e l’efficienza di tale attrezzo, e redatto un protocollo tecnico applicativo per una produzione massiva di trote fario triploidi presentanti condizioni di sterilità.
Cenni del metodo di produzione di fario sterile
Per chiarire il principio per cui con il metodo dello shock pressorio su uova fecondate di salmonidi si possono ottenere soggetti triploidi (con condizione di sterilità), è bene ricordare brevemente cosa avviene nell’uovo al momento della fecondazione: si ha l’incontro tra uno spermatozoo,
con corredo aploide (n) di cromosomi monocromatidici, ed un uovo bloccato alla metafase della seconda divisione meiotica (ovocita secondario), recanteun corredo aploide (n) di cromosomi dicromatidici. Con l’ingresso del nucleo spermatico nell’ovocita, si ha la ripresa della meiosi ovocitaria, con disgiunzione dei cromatidi fratelli, e la segregazione dei cromosomi monocromatidici nel pronucleo della cellula uovo e nel secondo globulo polare. Dopo l’espulsione di quest’ultimo, avviene la fusione tra i pronuclei femminile e maschile con formazione dello zigote diploide (2n), dotato di un doppio corredo di cromosomi monocromatidici. Prende, quindi, l’avvio la prima segmentazione che, come una normale mitosi, segrega un’identica copia del corredo cromosomico dello zigote nei due primi blastomeri i quali, a loro volta, si moltiplicheranno per dar origine al futuro individuo (2n).
L’applicazione dello shock pressorio prevede di impedire la 2° meiosi che segue la fecondazione, provocando la mancata espulsione del globulo polare (n) e la sua conseguente inglobazione nel nucleo, generando un soggetto triploide. La condizione di triploidia nei salmonidi induce una sterilità di tipo gonadico, per disgenesia ovarica nelle femmine (mancato/ridotto sviluppo dell’ovario), e per spermatogenesi abortiva nei maschi (mancata maturazione degli spermatozoi).
Processo di fecondazione e sviluppo normale
50 Attuazione della triploidizzazione mediante shock pressorio
L’applicazione dello shock pressorio deve tener conto fondamentalmente per una buona riuscita dell’induzione della triploidia delle seguenti principali variabili:
1) Qualità delle uova
2) Quantità delle uova trattate simultaneamente 3) Temperatura dell’acqua
4) Intervallo di tempo intercorrente fra fecondazione e applicazione dello shock 5) Valore di pressione applicato per lo shock
6) Tempo di durata dello shock 7) Capacità gestionali degli operatori
La diagnosi della triploidia può essere eseguita con varie metodiche, ma quella che sintetizza maggiormente precisione, accuratezza, oggettività, automazione, numerosità del campione e costo, è rappresentata dalla citofluorimetria a flusso; nei salmonidi tale analisi può essere eseguita sia su una porzione di pinna caudale (minima lunghezza trotella 5 cm ), sia sugli avannotti in toto fra il ca 5 e 12 gg dalla schiusa (a ca 10°CT) prima di una eccessiva pigmentazione, sia sul plasma per singolo soggetto (minima lunghezza ca 8 cm). E’ consigliato per avere una rappresentatività statistica della popolazione eseguire la diagnosi su almeno 30 soggetti, mentre 150 soggetti rappresentano il massimo numero rappresentativo.
Il disegno sperimentale applicato nel contesto per effettuare le prove di triploidizzazione ha previsto le seguenti fasi :
a) La metodica è recente ed ancora poco diffusa nel contesto nazionale e europeo, le aziende di produzione sono reticenti a fornire dati applicativi, ci sono variabili sito-specifiche che possono modulare i risultati, perciò si è provveduto a fare una ricognizione della bibliografia tecnica dell’argomento ed a estrapolare i valori maggiormente attendibili per pianificare un disegno sperimentale dei parametri di progetto.
b) Sono stati individuati due allevamenti fornitori di uova di trota fario per eseguire le prove, non essendo disponibili presso il centro, il Centro Ittico di Bolzano Bellunese (BL) dell’Amministrazione
51 Provinciale di Belluno e gestito dalla Coop Il Parco, e la Troticoltura Valsugana di Grigno (TN).
Ambedue sono riconosciute indenni da SEV e NEI.
c) In due giorni diversi, nelle due aziende, sono state eseguite le operazioni di raccolta dei gameti, uova e sperma, (mezzo di normale spremitura dei pesci), e in giornata avveniva il loro trasporto (uova in soluzione acquosa salina 0,9 %; sperma in capsule petri refrigerate) presso il Centro Ittico di Valdastico.
d) All’arrivo al centro le uova venivano conteggiate e divise nei gruppi sperimentali, quindi fecondate e successivamente trattate con lo shock pressorio secondo lo schema sperimentale prefissato e) I gruppi sperimentali sono stati incubati e allevati separati presso il Centro Ittico di Valdastico,
fino alla taglia idonea per l’analisi della triploidia, eseguita sul plasma a mezzo di prelievo individuale dalla vena caudale (metodo consigliato, nel contesto, dal laboratorio di analisi) . f) I campioni di plasma (da 24 a 30 pesci per gruppo) sono stati analizzati presso il laboratorio dell’
UO Patologia Clinica ed Ematologia dell’IZS delle Venezie (Legnaro,PD), a mezzo della metodica di Citofluorimetria a Flusso (ref. Dr.ssa Stefani Annalisa)
Schema sperimentale e risultati
Intertempo*= intervallo di tempo decorrente fra l’atto di fecondazione e l’inizio dell’applicazione dello shock; nd = materiale non disponibile
52 Le prove sono state effettuate in due giorni diversi con una differenza di ca 20 gg (1° giorno per gruppi 1-7 e 2° giorno per 8-12 ). Le uova per i gruppi da 1 a 7 erano di diametro di ca 4 -4,5mm, per i gruppi 8-12 erano di diametro ca 3 mm
Analisi dei risultati
Dai risultati ottenuti si può evidenziare che :
• Il valore di sopravvivenza dei controlli (46% Bolzano Bellunese e 47% Troticoltura Valsugana), è inferiore all’atteso, se confrontato con la media standard che di norma si collocano fra il 70 e 90%. La spiegazione più probabile sembra essere legata al fattore trasporto/tempo di trasporto che per quanto sia stato eseguito seguendo un idoneo protocollo, ha probabilmente influito sulla qualità finale dell’uovo diminuendo la resa alla fecondazione. Si noti che a distanza di ca 20gg fra le due prove, e con una provenienza diversa la sopravvivenza dei controlli sono quasi uguali; ciò sembra confermare l’ipotesi sopracitata
• La macchina pressoria è effettiva nell’indurre la condizione triploide in percentuale elevata, seppur con valori differenti (da ca 73% a 100% ) in funzione sia delle diverse prove effettuate sia di variabili aziendali (qualità gameti, numero di riproduttori utilizzati, manipolazione ecc…), come da descrizione in bibliografia, sebbene nella trota fario i dati non sono numerosi come nella iridea. Nelle produzioni massive commerciali di trota iridea triploide in Francia, viene riportato come valore medio massimo ca il 98%.
Dalla tabella si nota come la prova effettuata con le uova della Troticoltura Valsugana, non ha prodotto nessun valore del 100% di triploidia, sebbene alcuni valori di pressione e intertempo testati erano riportati come effettivi da alcuni autori. E’ probabile che ciò sia dipeso dalla qualità dei gameti, in particolare dalla sincronizzazione temporale non ottimale nella maturazione degli ovociti (e quindi dalla variabilità individuale dei riproduttori), e questo avviene soprattutto quando si utilizza per il trattamento un lotto con uova provenienti da molti riproduttori.
• L’induzione della triploidia provoca sempre (come riportato in bibliografia) una minore percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo, sebbene con una variabilità che può essere ampia in funzione di diversi parametri non ben controllabili (qualità gameti, età dei riproduttori manipolazioni pre e post trattamento ecc…). Nel contesto il valore percentuale di sopravvivenza sebbene appaia basso in assoluto, deve essere confrontato con il rispettivo valore relativo al controllo; i migliori valori relativi ottenuti (con il 100% di triploidia) di ca 72 e 55 corrispondono al valore di pressione di 690 bar con 30 minuti di intertempo a 10°C, che rientrano nell’intervallo considerato ottimale in bibliografia.
Sebbene alcuni Autori hanno ottenuto valori di sopravvivenza relativa maggiori (fino a 90%), si deve tener conto dell’effetto trasporto dei gameti effettuato, che ha sicuramente influito in modo significativo. La minor sopravvivenza ottenuta nelle prove eseguite il materiale della Troticoltura Valsugana, potrebbe correlarsi, oltre che con i trattamenti, anche con la significativa minor dimensione delle uova (diametro ca 3 mm), le quali possono essere risultate maggiormente sensibili alle manipolazioni.
53
• Il sangue è un tessuto idoneo su cui fare la diagnosi di ploidia, ha il vantaggio di non far sopprimere gli animali (in base alla capacità dell’operatore), e di facilitare i tempi di diagnosi (ca 1-2 gg per 100 cp). Per contro, si deve attendere che il pesce raggiunga la taglia idonea al prelievo, ed il prelievo deve essere eseguito da personale specializzato .
Conclusioni
• Le prove effettuate danno indicazioni che la macchina pressoria è efficiente nell’indurre la poliploidia (la triploidia nel contesto).
• I migliori valori da applicare per ottenere la triploidia in relazione alla sopravvivenza ed alle condizioni testate sono i seguenti:
intertempo (dalla fecondazione all’inizio dello shock , T°C 9,5-10°): 30 minuti valore di pressione applicato: 690 bar tempo di shock : 5 minuti
• La percentuale di triploidia è maggiore, quanto minore è il numero di femmine utilizzato per produrre il lotto di uova da sottoporre al trattamento.
• Per ottenere le massime percentuali di sopravvivenza dovrebbe essere eseguita la spremitura dei riproduttori e la fecondazione in loco, ove avviene il trattamento pressorio.
Borghesan Dr.Fabio