SEZIONE INNOVAZIONE E SVILUPPO
Centro Ittico Sperimentale Valdastico
T
RASFERIMENTO DELL’
INNOVAZIONE A SUPPORTO DELLA PESCA SPORTIVA A SALVAGUARDIA DELLA TROTA MARMORATA,
TEMOLO ED ALTRE SPECIESENSIBILI ALLA SEV E NEI
D.G.R. n. 2570 del 20.12.2013 - Contributo regionale per la realizzazione di iniziative progettuali in materia di conservazione del patrimonio ittico autoctono regionale.
RELAZIONE FINALE Anno 2015
MARIA FABIANA BILO’ 30.10.2015
1 SOMMARIO
PREMESSA ... 2
FORMAZIONE E DIVULGAZIONE ... 3
GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE PER LE ASSOCIAZIONI DI PESCA ... 3
FORMAZIONE PROFESSIONALE PER LA GESTIONE DELLA RIPRODUZIONE DEL TEMOLO E DI ALTRE SPECIE SENSIBILI ALLA SEV E NEI ... 4
CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI RIPRODUTTORI DI TROTA MARMORATA ... 7
CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME DI TROTA MARMORATA DI ALLEVAMENTO ... 35
PROTOCOLLO FECONDAZIONE UOVA DI SALMONIDI ... 39
PROVE DI FOTOPERIODO ... 44
MARCATURA DI GIOVANILI DI TROTA MARMORATA CON ALIZARINE RED (ROSSO ALIZARINA) ... 44
MARCATURA DELLE UOVA EMBRIONATE ... 45
MARCATURA DEI GIOVANILI DI TROTA ... 45
PRODUZIONE DI TROTA FARIO STERILI – TRIPOIDI ... 49
BIBLIOGRAFIA CITATA ... 53
ALLEGATI ... 54
2 PREMESSA
L’Azienda Regionale Veneto Agricoltura, facendo perno sui contributi regionali per la realizzazione di iniziative progettuali in materia di conservazione del patrimonio ittico autoctono regionale, ha avviato da molti anni un programma di ricerca multidisciplinare per la valorizzazione di una delle più importanti entità faunistiche presenti nei bacini idrografici del Veneto: la trota marmorata (Salmo trutta marmoratus) – specie in allegato II della direttiva habitat (92/43/CEE). Purtroppo nell’elenco delle priorità si aggiunge un altro salmonide da salvaguardare, non meno importante per le nostre acque, il temolo (Thymallus thymallus) “pinna blu”. Questa specie anche se non citata dalla direttiva habitat come specie di interesse comunitario in Italia, negli ultimi decenni ha subito la quasi totale scomparsa dalle acque vocate a salmonidi.
A seguire, gli ambiziosi obiettivi a lungo termine per la tutela delle specie sopraccitate:
promuovere una corretta gestione delle popolazioni selvatiche a supporto della pesca sportiva;
contribuire alla conservazione genetica e all'incremento delle specie nelle acque della Regione Veneto;
promuovere e sviluppare l’innovazione tecnologica e gestionale nei campi della produzione, igiene, valorizzazione qualitativa dei prodotti dell’acquacoltura;
promuovere la cooperazione fra Veneto Agricoltura e gli Incubatoi di valle.
Per corrispondere concretamente a queste finalità le proposte progettuali da implementare sono sia di tipo sperimentale sia di tipo formativo.
Le azioni formative prevedono:
FORMAZIONE PROFESSIONALE del personale qualificato del Centro Ittico Valdastico con l’obiettivo di acquisire competenze tecnico-scientifiche e gestionali sulla specie temolo;
GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE con argomenti proposti dalle Associazioni di pesca sportive, rivolte al personale addetto alla gestione degli impianti ittiogenici/incubatoi di valle.
Le azione sperimentali prevedono:
CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI RIPRODUTTORI DI TROTA MARMORATA (allevamento e/o selvatici) per il loro utilizzo nelle pratiche di riproduzione. Applicazione di marcatori microsatellite, dopo la selezione con l’approccio classico D-Loop/LDH;
CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME DI TROTA MARMORATA DI ALLEVAMENTO, di maschi appartenenti a bacini diversi per preservare al meglio la variabilità genetica dei soggetti allevati;
MARCATURA MEDIANTE COLORANTE A BASE DI ALIZARINA DI TROTA MARMORATA, rilascio e recupero in ambiente naturale controllato.
PROVE DI FOTOPERIODO per la verifica della sincronizzazione nella maturazione delle gonadi nelle femmine;
PRODUZIONE DI TROTA FARIO STERILI (TRIPLOIDI) per evitare fenomeni di ibridazione fra la trota fario e la trota marmorata nelle aree di sovrapposizione.
3 FORMAZIONE E DIVULGAZIONE
La complessità nella corretta gestione del materiale ittico selvatico e di quello prodotto negli impianti ittiogenici, condotti sia dal Centro Ittico di Valdastico sia dalle diverse Associazioni di Pesca, impone un continuo aggiornamento ed un ininterrotto sostegno tecnico scientifico.
GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE PER LE ASSOCIAZIONI DI PESCA
Con il compito di sensibilizzare e coinvolgere le diverse Associazioni di pesca, alla luce della recente normativa, si sono organizzate giornate informative, rivolte sia alle Associazioni di pescatori sportivi sia agli operatori delle strutture pubbliche regionali e territoriali, addetti al settore ittico.
Sono state affrontate le principali tematiche legate alla gestione, produzione e igiene dei prodotti dell’acquacoltura. Il programma è stato proposto in quattro diverse località del territorio veneto (Corte Benedettina- Legnaro (PD), Cantina dei Colli Berici – Lonigo (VI), Museo Etnografico di Serravella- Cesiomaggiore (BL) e San’Artemio – Treviso) con l’intento di favorire la massima partecipazione da parte degli operatori interessati.
Gli argomenti trattati, con i rispettivi relatori, sono stati i seguenti:
Principali problematiche sanitarie nell’allevamento delle specie ittiche d’acqua dolce-Amedeo Manfrin - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie;
Biosicurezza e benessere animale -Andrea Fabris - Veterinario A.P.I.
Normativa vigente in materia di immissioni nelle acque pubbliche e laghetti di pesca sportiva- Manuela Dalla Pozza, Chiara Ceolin - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie;
Ruolo dell’ULSS nel settore della Pesca - Interventi dei Servizi Veterinari Sanità Animale Daniele Boffo - Ulss 9, Marcello Malacarne - Ulss 2 e Michele Zaghi - Ulss 16;
Approccio di gestione sostenibile per il mantenimento degli stock ittici autoctoni - Fabio Borghesan – Ittiologo, Consulente Veneto Agricoltura.
Nel seguito vengono allegate le relazioni dei formatori.
4 FORMAZIONE PROFESSIONALE PER LA GESTIONE DELLA RIPRODUZIONE DEL TEMOLO E DI ALTRE SPECIE SENSIBILI ALLA SEV E NEI
Il temolo (Thymallus thymallus) è una specie ittica diffusa su quasi tutto il continente europeo; a nord si spinge fino alla Scandinavia settentrionale, fanno invece eccezione le regioni più meridionali. Nelle acque italiane era in origine presente nel bacino padano-veneto. Negli ultimi decenni, come già successo con la trota marmorata, la specie ha subito importanti disturbi di tipo antropico, quali inquinamento delle acque e degrado degli habitat. L’introduzione e la traslocazione di ceppi non nativi di provenienza danubiana e atlantica a scopi prettamente alieutici, hanno potenzialmente alterato i pool genici locali della specie. Ciò ha portato ad una situazione in cui le popolazioni che per definizione potrebbero essere considerate autoctone, presentano invece alti livelli di introgressione (es. fiume Adige) o addirittura, nel peggiore dei casi, la completa sostituzione delle popolazioni localmente adattate (es. fiume Brenta).
Dalle ricerche effettuate - Progetto ABaTe - del dott. A. Gandolfi e A. Meraner, del Centro di Ricerca e Innovazione, Fondazione Mach di Trento, emerge infatti la presenza di gruppi genetici differenti di Temolo nell’areale di campionamento dell’Adriatico settentrionale. Due gruppi genetici appartengono al “Temolo adriatico” nativo (il primo gruppo individuato nel Bacino dell’Adige e il secondo nei fiumi Sesia e Adda e in Friuli), mentre i rimanenti gruppi genetici sono esotici e riferibili alle popolazioni di Temolo della Drava, del Danubio del Nord, della Sava o del Bacino Atlantico (corsi d’acqua dell’Europa Centrale o della Scandinavia).
Tracce genetiche esotiche sono state rinvenute in tutti i siti di campionamento investigati, a testimonianza dell’imponente impatto che le semine hanno avuto sulla componente genetica nativa delle popolazioni selvatiche.
La proporzione delle componenti genetiche non-native è diversa da sito a sito, da un massimo del 100%
(= estinzione locale del Temolo nativo) a un minimo del 5-7% (a indicare una quasi totale persistenza delle originarie popolazioni di Temolo).
Elevate proporzioni di componenti genetiche native sono state osservate nei fiumi Sesia (Piemonte), Adda (Lombardia) e in particolare nei tratti medi del Fiume Adige. A titolo di esempio, la componente genetica riferibile al Temolo adriatico nativo è pari al 93% nell’Adige in prossimità di Merano e addirittura pari al 95% tra Bolzano e Ora.
La composizione genetica del Temolo nelle acque del sottobacino dell’Adige orientale (alto Isarco, Rienza e Aurino) merita una descrizione particolare: mentre i temoli dell’Adige occidentale sono principalmente caratterizzati da pattern genetici adriatici, gli esemplari campionati nell’Adige orientale sono geneticamente più simili alle popolazioni della Drava (Alto Adige orientale; tributario del Danubio).
Complesse analisi dei dati osservati e di dati genetici simulati suggeriscono effettivamente per le popolazioni di Temolo nelle acque tra Dobbiaco e Bressanone un’origine geografica a partire dalle
5 popolazioni della Drava e un’origine temporale databile intorno alla metà del sedicesimo secolo.
Quindi, l’origine delle popolazioni dell’Adige orientale può essere fatta risalire al regno di Massimiliano I (1486- 1519), già noto, in ambito ittiologico, per avere avviato le prime diffuse traslocazioni di salmonidi. (Andreas Meraner, 2013)
Sulla scorta di queste ricerche, l’obiettivo ambizioso del Centro Ittico di Valdastico è di riuscire a provvedere alla riproduzione in ambito artificiale di questa specie di interesse alieutico in Regione Veneto. Partendo da uova di esemplari possibilmente selvatici, provenienti dal fiume Adige e/o dal fiume Livenza, si intende ottenere una prima linea di temoli da accrescere fino a farli diventare riproduttori; con questi dare quindi avvio alla produzione su larga scala a scopo di ripopolamento e alieutico in Regione Veneto.
Da molti anni, per cercare di arrestare la perdita di esemplari del ceppo autoctono di temolo, i vicini Sloveni ed i Centri Ittici del Friuli Venezia Giulia hanno avviato nei loro territori progetti di allevamento in cattività della specie (A. Sabbadini, 2007). Sono state riscontrate grandi difficoltà in merito, legate all’incapacità degli esemplari selvatici di adattarsi alla cattività, fattore che limita fortemente la possibilità di ottenere uova. Il problema è stato superato facendo crescere in ambiente artificiale esemplari giovanili con i quali si è allestito un primo parco riproduttori, ottenendo cosi una buona quantità di uova fecondate. Grazie anche a queste ricerche è stata individuata una dieta adatta alla crescita della specie in cattività. Facendo tesoro di tali esperienze, maturate negli anni, è stato attivato un rapporto di collaborazione con l’Ente Tutela Pesca della Regione Friuli Venezia Giulia, indirizzato alla formazione professionale del personale del Centro Ittico di Valdastico, volto a favorire l’acquisizione di competenze tecnico-scientifiche e gestionali sulla specie temolo.
Il tutto è iniziato con l’incontro tenutosi al Centro Ittico Valdastico il 19.02.2014. Per l’occasione è stato presentato il progetto “Nuove tecniche di crio – conservazione e analisi genetica come strumenti per implementare e migliorare la conservazione di specie ittiche protette e le performance delle specie allevate” che ha interessato la specie marmorata.
Nelle diverse visite, effettuate nei mesi da maggio a luglio, nei Centri Ittici friulani, a Maniago e Forni di Sopra (PN) dell’Ente Tutela Pesca, sotto la direzione tecnica del Sig. Gian Maria Sigalotti e del Dott.
Andrea Fabris, si sono apprese alcune specifiche tecniche operative concernenti le fasi produttive relative al mantenimento dei riproduttori e all’allevamento e allo svezzamento dei giovanili.
Non è stato possibile partecipare alle fasi di spremitura e di fecondazione delle uova, per mancato coordinamento dei tecnici friulani.
Le principali difficoltà che ogni anno si evidenziano negli impianti friulani e che complicano l’allevamento del temolo, soprattutto dopo il raggiungimento del terzo anno di età degli esemplari, sono le comparse di varie patologie, specialmente della foruncolosi. La somministrazione di antibiotici per fronteggiare tali malattie diventa a lungo termine inefficace, provocando la quasi totale scomparsa dei lotti allevati. L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie ha cercato di
6 produrre uno specifico vaccino, ma senza risultati apprezzabili. Sono a tutt’oggi in atto diverse attività sperimentali volte alla risoluzione del problema.
Le ipotesi più probabili alla radice di questo fenomeno sono riconducibili ad un mancato raggiungimento delle condizioni ideali di alimentazione e di densità degli individui negli Impianti.
Grazie alle informazioni scambiate ed alle nozioni apprese durante gli incontri, è stato possibile valutare l’idoneità del Centro ittico di Valdastico in ordine alla realizzazione degli obiettivi prefissati.
La prima difficoltà che si evidenzia per la produzione di temoli nel Centro Ittico Valdastico è la bassa escursione termica dell’acqua utilizzata in Impianto (range fra 9.5°C– 11°C); questa influirebbe negativamente sulla maturazione delle gonadi dei futuri riproduttori da allevare.
Queste stesse condizioni, invece, sono buone per la schiusa delle uova e per lo svezzamento del novellame.
Le larve di temolo, sia in cattività sia in natura, cominciano a nutrirsi autonomamente, una volta riassorbito il sacco vitellino; essi sono in grado di alimentarsi di zooplancton, tanto di quello raccolto in natura (sia vivo sia congelato) quanto di quello prodotto in avannotteria, fornito dai naupli di Artemia sp..
In questa fase, il Centro Ittico Valdastico sarebbe in grado di svezzare il materiale prodotto, cosi come viene fatto attualmente per la trota marmorata.
Le uova dovrebbero essere spremute da esemplari maturi, catturati in natura e/o da riproduttori in sosta presso un altro impianto, indenne e con acque idonee, per poi provvedere allo spostamento delle uova fecondate nell’avannotteria del Centro.
Per questa specie - ceppo adriatico – nelle nostre acque gravemente minacciata di estinzione, si intende valutare la possibilità di coinvolgere altre strutture (Associazioni di Pesca che gestiscono impianti Ittiogenici e Amministrazioni provinciali) per riuscire a presentare in futuro un progetto correttamente articolato in tutte le sue fasi, dalla produzione allo svezzamento.
temolo – foto di Emanuele Turato
7 Spin off accademico GEN TECH - Tecnologie innovative in biologia animale
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CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI RIPRODUTTORI DI TROTA MARMORATA
INTRODUZIONE
Da alcuni anni la proficua collaborazione tra l’Amministrazione Regionale del Veneto e lo spin off accademico Gen-Tech dell’Università degli Studi di Parma ha portato alla realizzazione di un progetto di ricerca dedicato al miglioramento delle metodiche di allevamento della trota marmorata. Tra i vari endemiti presenti nei corsi d’acqua italiani, la trota marmorata è considerata una delle specie di maggior valenza biogeografica e naturalistica. Il suo stato di conservazione, classificato ad “elevato rischio” (Critically Endangered) dalla recente revisione della Lista Rossa IUCN dei vertebrati italiani (Rondinini et al., 2013), conferma la necessità di rigidi interventi di protezione e salvaguardia delle popolazioni alpine. Nonostante la specie sia inserita fin dal 1992 nell’allegato II della Direttiva Habitat (92/43/ CEE), la situazione dei popolamenti italiani è andata via via peggiorando, in relazione soprattutto alle continue modificazioni di habitat e alla costante antropizzazione dei corsi d’acqua settentrionali (Meraner et al., 2007; 2008).
Per tale motivo la trota marmorata è oggi tra le specie dell’ittiofauna dulcicola italiana quella che richiama maggiore attenzione in pratiche di allevamento a fini conservazionistici. La Regione Veneto, ed in particolare il Centro Ittiogenico di Valdastico (VenetoAgricoltura), ha avviato da anni un progetto per il recupero della trota marmorata nei maggiori bacini idrografici del Veneto e si è impegnata per l’applicazione di metodologie innovative per il miglioramento delle pratiche in acquacoltura (Best practices in aquaculture).
Nello specifico il Centro Ittiogenico di Valdastico nel corso degli anni 2014 e 2015 ha condotto una tipizzazione molecolare degli stock di riproduttori avvalendosi della collaborazione dello spin off dell’Università di Parma, implementando inoltre tecniche di riproduzione assistita e allevamento anche in collaborazione con partner Norvegesi nell’ambito di un progetto finanziato dal Regional Governement of Norway e coordinato dalla Cryogenetics di Hamar (si allega frontespizio della partnership di progetto nella figura sottostante).
E’ bene precisare che la selezione genetica dei riproduttori è uno degli aspetti cruciali per il successo dei piani di salvaguardia e di conservazione della specie, alla luce di ricerche pregresse che hanno messo in evidenza l’alta percentuale di ibridi (introgressione da geni atlantici) presente nelle popolazioni naturali.
Nella presente relazione vengono illustrate i principali aspetti tecnici ed i risultati di ricerche condotte sia presso l’impianto di Valdastico, sia in Laboratorio presso l’Università di Parma. La relazione è strutturata in due differenti sezioni. Una prima sezione riguardante le attività svolte per la
8 tipizzazione genetica dei riproduttori, condotte anche in collaborazione con partner norvegesi ed una seconda parte riguardante metodologie innovative per l’allevamento di stadi giovanili di trota marmorata.
Illustrazione della partnership di progetto svolto in collaborazione con enti di ricerca norvegesi.
ATTIVITA’ DI GENETICA MOLECOLARE
MATERIALI E METODI
E’ stato applicato un approccio integrato basato sull’analisi di marcatori mitocondriali, di SNPs nucleari e di loci microsatellite altamente polimorfici. L’analisi della regione di controllo mitocondriale D-Loop, associata all’analisi RFLP del gene nucleare LDH-C1 ha consentito
9 l’effettuazione di uno screening di primo livello (Fase 1) degli esemplari da avviare alla tipizzazione microsatellite (Fase 2). L’approccio intergrato consente di definire con ragionevole certezza il grado di purezza dei riproduttori e la loro attribuzione a gruppi/popolazioni ben differenziate.
Relativamente all’analisi del DNA mitocondriale (D-Loop), esso consente di definire anche l’origine fileogeografica degli esemplari sulla base dell’attribuzione alle linee Mediterranea Adriatica, Atlantica, Danubiana e Marmoratus. Per quanto concerne la determinazione delle frequenze alleliche dei loci microsatellite sono stati analizzati 11 diversi loci in un primo stock di 96 esemplari allevati presso il Centro di Valdastico. Di questi 30 erano provenienti dai bacini Piave (catturati anno 2008), 30 dell’Adige (2010) e 36 Brenta (2009). In realtà 6 esemplari del ceppo Brenta, dei 36 analizzati, erano esemplari selvatici catturati in ambiente naturale nel 2013. I loci analizzati sono stati i seguenti:
BHMS330, BHMS349, BHMS429, Ssa197, Ssa85, SsaD157, SsaD190, SsaD58, SsaD85, STR-2, Tap2B.
Ulteriori 3 loci, STR15, Ssa85 e Ssa197 sono stati analizzati in un secondo stock di 169 campioni di cui 84 appartenenti al ceppo Brenta Cismon e 85 al ceppo Piave portati a Valdastico nel 2014.
Nella tabella sottostante è riportate il quadro dei campionamenti con i codici di riferimento associati ad ogni marmorata, per una migliore identificazione operativa durante le prossime campagne ittiogeniche. Ogni trota è stata infatti dotata di un Pit Tag (Personal Integrated Trasponder) intramuscolo.
DOMESTIC - ADIGE 2010
SAMPLE NUMBER SEX BARCODE LENGHT cm WEIGHT kg
1 M 968000004730958 47 1,29
2 M 968000004568954 51 1,605
3 M 968000004746968 40 0,755
4 M 968000004273144 53 2,065
5 M 968000004566595 50,5 1,83
6 M 968000004736315 45 1,03
7 M 968000004735379 48 1,275
8 M 968000004749072 41 870
9 M 968000004567116 47 1,2
10 M 968000004706880 47 1,345
11 M 968000004729696 56 2,395
12 F 968000004568889 43,5 1,14
10
13 F 968000004734204 42,5 1,075
14 F 968000004767131 50,5 1,5
15 F 968000004567143 44 1,095
16 F 968000004756941 51 1,73
17 F 968000004739222 47 1,385
18 M 968000004744913 45 1,045
19 M 968000004565900 49 1,52
20 M 968000004706504 48 1,24
60 M 968000004747805 57,5 1,005
DOMESTIC - BRENTA 2009
SAMPLE NUMBER SEX BARCODE LENGHT cm WEIGHT kg
21 M 968000004267483 48 1,52
22 M 968000004737468 44 0,91
23 M 968000004569214 47 1,27
24 M 968000004745592 49 1,475
25 M 968000004748237 47,5 1,525
26 M 968000004740155 44 1,055
27 M 968000004735392 38 0,98
28 M 968000004747447 49 1,38
29 M 968000004571902 50,5 1,65
30 M 968000004830738 51 1,675
31 M 968000004762916 46 1,34
32 M 968000004748438 47 1,28
33 F 968000004725604 45 1,375
34 F 968000004705547 47 1,58
35 F 968000004747167 42,5 1,17
36 F 968000004568996 44 1,205
37 F 968000004748093 41 1,06
38 F 968000004729583 44 1,105
39 F 968000004741141 39 0,785
40 F 968000004269688 44 1,275
11 DOMESTIC - PIAVE 2008
SAMPLE NUMBER SEX BARCODE LENGHT cm WEIGHT kg
41 M 968000004569125 55 1,5
42 F 968000004707174 47 1,23
43 M 968000004729678 49 1,31
44 M 698000004727888 57 1,935
45 M 968000004749944 50 1,58
46 M 968000004728308 49 1,48
47 M 968000004567749 51 1,53
48 M 968000004730384 48 1,205
49 F? 968000004738281 47 1,1
50 F 968000004271145 44 1,15
51 F 968000004748320 41 0,895
52 F 968000004741962 49 1,365
53 F 968000004747405 44 1,1
54 F 968000004727737 44,5 0,955
55 F 968000004570004 48 1,26
56 F 968000004739882 44 0,93
57 F 968000004747664 60 2,61
58 M 968000004572572 47,5 1,445
59 M 968000004567387 52 1,755
WILD – BRENTA 2013
SAMPLE NUMBER SEX BARCODE LENGHT cm WEIGHT kg NOTES
1 F 968000004733525 47 \
2 F 968000004705810 41 \
3 F 968000004735895 31 \
4 F 968000004740595 43 \
5 F 968000004733204 38 \ Hybrid pheno
6 F 968000004725752 48 \ Marble pheno
Per quanto concerne le metodologie molecolari applicate, esse sono già state descritte in modo dettagliato in relazioni precedenti e sono riconducibili a lavori presenti in letteratura. In particolare
12 per quanto concerne l’identificazione di aplotipi mitocondriali si è proceduto all’analisi di SNPs in multiplexing della regione di controllo mitocondriale utilizzando 5 diversi primer “forward” ed un solo
“reverse” secondo quanto proposto da Apostolidis et al. (2007).
In alcuni campioni selezionati in modo causale l’approccio multiplex è stato confermato da un’ulteriore analisi basata sull’utilizzo dell’enzima di restrizione AluI, effettuata su ampliconi ottenuti con primer L19/ H17 (Dovc et al., 2004).
Il gene nucleare LDH- C1* è stato amplificato con primer Ldhxon3F/ Ldhxon4R, con successiva identificazione dei genotipi mediante endonucleasi BslI e tecnica RFLP secondo quando descritto da McMeel et al. 2001. In questo caso il pattern di restrizione consente di identificare le diverse combinazioni alleliche in grado di definire omozigoti Atlantici 90/90, Mediterranei 100/100 o eterozigoti ibridi 90/100. In particolare, l’allele 100 identifica caratteristiche genetiche Mediterranee per il gene in questione.
I riproduttori risultati mediterranei all’analisi mitocondriale e LDH sono stati sottoposti ad ulteriore genotipizzazione dei loci microsatellite, utilizzando specifiche sequenze di primer riportate in letteratura (Pujolar, et al., 2011). L’analisi degli ampliconi per la definizione delle frequenze alleliche è stata condotta tramite elettroforesi capillare utilizzando un sistema automatizzato (sequenziatore automatico) CEQ8000 Beckman Coulter DNA Analysis System.
Il “Population assignment”, ossia l’attribuzione alla cieca alle diverse popolazioni/gruppi sulla base delle frequenze alleliche dei loci microsatellite, è stata eseguita con software STRUCTURE (v2.3.4.).
Gli esemplari ibridi 5, 13, 19, 56 e il locus SSaD170, caratterizzato da numerosi alleli nulli, sono stati omessi nella matrice originale. Sono inoltre riportati I seguenti parametri di elaborazione qualora fossero di interesse tecnico-specialistico: length of Burning Period 5000, numero di MCMC Repetitions after Burning 10000, Ancestry Model basato su “Admixture Model”, numero iniziale di K (populations) tra 1 e 10 (Software Structure Harvester Web v 0.6.94).
RISULTATI
I risultati delle analisi combinate degli aplotipi mitocondriali e del gene LDH-C1, effettuate nei 3 gruppi di marmorate “domestiche” (1-20 Adige, 21-40 Brenta, 41-60 Piave), sono illustrati nella tabella sottostante. Come già evidenziato nel paragrafo precedente, 4 esemplari tra i 60 analizzati (5,13, 19 e 56) sono stati scartati prima dell’analisi dei loci microsatellite in quanto risultati ibridi all’analisi LDH. In questo caso l’introgressione è stata apportata da maschi, in quanto il DNA mitocondriale (di provenienza materna) ha mostrato il 100% di appartenenza all’aplotipo
“marmoratus” (marble).
13 CAMPIONI “DOMESTICI” PRESSO IMPIANTO DI VALDASTICO
SAMPLE mt-Dloop LDH-C1 Diagnosi
1 Marble ME MARBLE
2 Marble ME MARBLE
3 Marble ME MARBLE
4 Marble ME MARBLE
5 Marble Heterozygote Hybrid
6 Marble ME MARBLE
7 Marble ME MARBLE
8 Marble ME MARBLE
9 Marble ME MARBLE
10 Marble ME MARBLE
11 Marble ME MARBLE
12 Marble ME MARBLE
13 Marble Heterozygote Hybrid
14 Marble ME MARBLE
15 Marble ME MARBLE
16 Marble ME MARBLE
17 Marble ME MARBLE
18 Marble ME MARBLE
19 Marble Heterozygote Hybrid
20 Marble ME MARBLE
21 Marble ME MARBLE
22 Marble ME MARBLE
23 Marble ME MARBLE
24 Marble ME MARBLE
25 Marble ME MARBLE
26 Marble ME MARBLE
27 Marble ME MARBLE
28 Marble ME MARBLE
29 Marble ME MARBLE
30 Marble ME MARBLE
31 Marble ME MARBLE
32 Marble ME MARBLE
33 Marble ME MARBLE
34 Marble ME MARBLE
35 Marble ME MARBLE
36 Marble ME MARBLE
14
37 Marble ME MARBLE
38 Marble ME MARBLE
39 Marble ME MARBLE
40 Marble ME MARBLE
41 Marble ME MARBLE
42 Marble ME MARBLE
43 Marble ME MARBLE
44 Marble ME MARBLE
45 Marble ME MARBLE
46 Marble ME MARBLE
47 Marble ME MARBLE
48 Marble ME MARBLE
49 Marble ME MARBLE
50 Marble ME MARBLE
51 Marble ME MARBLE
52 Marble ME MARBLE
53 Marble ME MARBLE
54 Marble ME MARBLE
55 Marble ME MARBLE
56 Marble Heterozygote Hybrid
57 Marble ME MARBLE
58 Marble ME MARBLE
59 Marble ME MARBLE
60 Marble ME MARBLE
Tra i campioni selvatici, 5 esemplari su 6 sono risultati idonei alla successiva genotipizzazione con microsatelliti. Il solo esemplare n. 5 ha mostrato segni di ibridazione a livello nucleare. Risultati riportati nella tabella sottostante.
CAMPIONI SELVATICI
Brenta 1 Marble ME MARBLE
Brenta 2 Marble ME MARBLE
Brenta 3 Marble ME MARBLE
Brenta 4 Marble ME MARBLE
Brenta 5 Marble Heterozygote HYBRID
Brenta 6 Marble ME MARBLE
15 I risultati dell’analisi di 11 loci microsatellite polimorfici, precedentemente caratterizzati in Salmo salar e in Salmo marmoratus, e quindi potenzialmente fruibili per considerazioni di genetica di popolazione nei gruppi campionati, sono riportati nel prospetto sottostante. In generale i loci BHMS349, Ssa197, SSaD157, SsaD58, STR-2 hanno mostrato una ”allelic richness” superiore agli altri e pertanto sono stati considerati tra i più informativi (aspetto da considerare nelle tipizzazioni future).
Per quanto concerne aspetti specifici di variabilità genetica, l’eterozigosità medià entro gruppi, determinata considerando tutti i loci polimorfici, è risultata scarsa e variabile tra 61,10% Adige, 58,18
% Brenta e 51,81% Piave. Da un punto di vista conservazionistico questo aspetto non è trascurabile, considerando i livelli di variabilità definiti in altre specie ittiche solitamente in grado di raggiungere anche valori di eterozigosità variabili tra 70 e 90%. La bassa eterozigosità riscontrata nelle marmorate di Valdastico è presumibilmente attribuibile a fenomeni di inbreeding (inincrocio), assai comuni in materiale di allevamento.
DOMESTIC - ADIGE
LOCI GENOTYPE N° IND %
BHMS330
92/96 1 5,55%
90/90 4 22,22%
90/94 1 5,55%
90/96 10 55,55%
90/110 1 5,55%
90/92 1 5,55%
18 99,97%
BHMS349
123/163 3 16,66%
119/123 3 16,66%
123/129 5 27,77%
123/123 4 22,22%
125/163 1 5,55%
111/123 1 5,55%
123/161 1 5,55%
18 99,96%
BHMS429
195/195 4 22,22%
16
205/205 1 5,55%
195/205 3 16,66%
195/201 8 44,44%
201/205 1 5,55%
191/191 1 5,55%
18 99,97%
Ssa197
177/185 1 5,55%
197/197 3 16,66%
177/193 1 5,55%
157/193 2 11,11%
185/193 3 16,66%
185/185 2 11,11%
193/197 2 11,11%
177/177 1 5,55%
181/185 1 5,55%
193/193 1 5,55%
177/197 1 5,55%
18 99,95%
SSa85
108/108 17 94,44%
108/132 1 5,55%
18 99,99%
SSaD157
311/319 1 5,55%
291/319 1 5,55%
287/299 1 5,55%
287/307 2 11,11%
311/327 2 11,11%
287/291 2 11,11%
275/287 2 11,11%
287/319 2 11,11%
17
299/319 1 5,55%
287/287 2 11,11%
283/303 1 5,55%
307/307 1 5,55%
18 99,96%
SSaD190
132/136 9 50%
132/132 7 38,88%
136/136 2 11,11%
18 100%
SsaD58
279/283 1 5,55%
267/283 2 11,11%
317/317 1 5,55%
287/315 1 5,55%
283/291 1 5,55%
291/291 1 5,55%
279/279 3 16,66%
279/287 2 11,11%
283/303 1 5,55%
287/291 1 5,55%
279/321 1 5,55%
285/291 1 5,55%
265/265 1 5,55%
307/307 1 5,55%
18 99,93%
SSaD85
192/192 2 11,11%
196/226 1 5,55%
196/222 1 5,55%
226/230 1 5,55%
192/222 3 16,66%
18
186/226 1 5,55%
222/230 2 11,11%
214/234 1 5,55%
214/236 1 5,55%
222/232 1 5,55%
192/212 1 5,55%
226/226 1 5,55%
212/234 1 5,55%
204/214 1 5,55%
18 99,93%
STR-2
333/361 1 5,55%
328/352 1 5,55%
331/357 1 5,55%
322/352 2 11,11%
353/357 1 5,55%
361/361 1 5,55%
350/359 1 5,55%
322/354 1 5,55%
359/359 2 11,11%
324/346 1 5,55%
357/357 2 11,11%
332/352 1 5,55%
321/359 2 11,11%
346/361 1 5,55%
18 99,94%
Tap2B
313/313 7 38,88%
321/321 3 16,66%
313/321 8 44,44%
18 99,98%
19 DOMESTIC BRENTA
LOCI GENOTYPE N° IND %
BHMS330
90/90 15 75%
90/102 4 20%
90/96 1 5%
20 100%
BHMS349
99/151 3 15%
101/151 1 5%
109/151 3 15%
151/165 3 15%
109/165 1 5%
99/109 6 30%
101/117 1 5%
101/109 1 5%
99/145 1 5%
20 100%
BHMS429
195/195 3 15%
195/201 13 65%
201/201 3 15%
195/215 1 5%
20 100%
Ssa197
208/208 1 5%
147/189 1 5%
165/177 3 15%
177/181 1 5%
147/177 4 20%
147/165 2 10%
20
181/181 1 5%
165/181 6 30%
161/181 1 5%
20 100%
SSa85
108/108 19 95%
108/132 1 5%
20 100%
SSaD157
283/311 3 15%
311/315 4 20%
315/315 3 15%
283/283 3 15%
152/283 1 5%
283/299 1 5%
307/311 1 5%
299/311 1 5%
245/283 1 5%
299/311 2 10%
20 100%
SSaD190
132/132 11 55%
128/132 1 5%
132/146 7 35%
142/146 1 5%
20 100%
SsaD58
315/315 4 20%
295/295 4 20%
295/315 9 45%
279/295 2 10%
279/279 1 5%
21
20 100%
SSaD85
208/208 6 30%
226/236 1 5%
186/200 2 10%
200/208 2 10%
208/236 2 10%
236/236 1 5%
200/236 4 20%
190/208 1 5%
186/226 1 5%
20 100%
STR-2
352/352 1 5%
372/372 4 20%
345/352 2 10%
345/372 1 5%
327/339 1 5%
339/372 1 5%
346/346 1 5%
325/345 1 5%
341/344 1 5%
325/352 1 5%
344/352 1 5%
352/359 1 5%
344/344 1 5%
344/361 1 5%
325/344 2 10%
20 100%
Tap2B
321/321 12 60%
201/201 1 5%
22
313/321 7 35%
20 100%
DOMESTIC PIAVE
LOCI GENOTYPE N° IND %
BHMS330
90/90 15 83,33%
90/92 3 16,66%
18 99,99%
BHMS349
151/153 4 22,22%
99/99 3 16,66%
99/151 4 22,22%
125/151 1 5,55%
99/145 5 27,77%
125/125 1 5,55%
18 99,97%
BHMS429
177/193 1 5,55%
195/195 10 55,55%
195/201 1 5,55%
191/195 5 27,77%
195/211 1 5,55%
18 99,97%
Ssa197
137/177 3 16,66%
177/181 2 11,11%
157/181 1 5,55%
181/181 1 5,55%
157/177 3 16,66%
137/185 2 11,11%
131/177 1 5,55%
23
181/185 2 11,11%
137/181 1 5,55%
177/185 1 5,55%
137/185 1 5,55%
18 99,95%
SSa85
108/108 15 83,33%
108/112 1 5,55%
108/132 2 11,11%
18 99,99%
SSaD157
291/307 1 5,55%
247/303 2 11,11%
291/299 1 5,55%
247/303 2 11,11%
247/299 2 11,11%
299/307 1 5,55%
299/319 3 16,66%
291/319 1 5,55%
247/319 1 5,55%
299/303 1 5,55%
287/299 1 5,55%
299/315 1 5,55%
291/303 1 5,55%
18 99,94%
SSaD190
132/142 7 38,88%
132/132 9 50%
132/136 2 11,11%
18 99,99%
SsaD58
0/0 1 5,55%
24
319/319 6 33,33%
245/285 1 5,55%
245/245 2 11,11%
245/319 2 11,11%
285/311 3 16,66%
287/311 1 5,55%
311/311 2 11,11%
18 99,97%
SSaD85
182/214 5 27,77%
182/182 8 44,44%
182/196 2 11,11%
182/212 3 16,66%
18 99,98%
STR-2
359/359 9 50%
346/359 1 5,55%
333/341 2 11,11%
344/359 1 5,55%
341/359 1 5,55%
344/363 1 5,55%
337/339 1 5,55%
344/344 1 5,55%
350/359 1 5,55%
18 100%
Tap2B
313/313 11 61,11%
313/321 7 38,88%
18 99,99%
Il “Population Assignment” eseguito con Structure Harvester Web ha confermato l’attribuzione di questo gruppo di campioni ad un numero di popolazioni variabile tra 3 e 4. Vedi immagine sottostante.
25 Il risultato è stato confermato dall’analisi bayesiana con STRUCTURE in grado di differenziare correttamente gli esemplari già attribuiti in partenza ai ceppi Adige, Brenta e Piave con l’unica eccezione dell’esemplare n. 60 (Pit tag barcode n. 968000004747805) erroneamente attribuito ai campioni Adige ma appartenente geneticamente al ceppo Piave. E’ plausibile che l’erronea attributizione fosse imputabile ad un riproduttore fuggito da una vasca o accidentalmente isnerito nella vasca non corretta durante precedent pratiche gestionali.
L’immagine sottostante identifica chiaramente tre gruppi nell’ambito delle 56 marmorate inizialmente selezionate con DNA mitocondriale e LDH (Fase 1) e successivamente tipizzate con microsatelliti a livello di popolazione (Fase 2).
IMAGE 1
26 Considerando la bassa variabilità genetica evidenziata con l’analisi dei microsatelliti, è stata effettuata una valutazione della diversità allelica dei singoli esemplari al fine di identificare possibili accoppiamenti da effettuare nel corso delle prossime campagne ittiogeniche. Nella tabella sottostante è riportato il numero di alleli determinati nei singoli esemplari (variabili tra 13 e 21); sono evidenziati quelli a maggior variabilità. In verde gli esemplari a maggior variabilità genetica, in giallo quelli a variabilità intermedia, in rosso gli ibridi da scartare.
individuo n alleli loci non amplificati
1 19
2 17 1 no
3 19
4 21 1 no
5 16 IBRIDO
6 21
7 17 1 no
8 18 1 no
9 19
10 19 1 no
11 21
12 18 IBRIDO
13 18
14 19
15 18
16 17 1 no
17 18
18 17 IBRIDO
19 20
20 17 1 no
21 13 1 no
22 19
23 17
24 19
25 18 1 no
26 16 1 no
27 15
27
28 18 1 no
29 16
30 19 1 no
31 17
32 19
33 18 1 no
34 19 2 no
35 18
36 19 1 no
37 18
38 18 1 no
39 19 1 no
40 19 1 no
41 16 2 no
42 14 1 no
43 16
44 16 1 no
45 16
46 17
47 17
48 20
49 16
50 19
51 21
52 18 1 no
53 20
54 21
55 16 IBRIDO
56 19 1 no
57 18
58 18
59 22
60 16 1 no
28 Relativamente agli ulteriori 169 esemplari appartenenti ai ceppi Cismon e Piave, le analisi di Fase 1 (mtDNA e LDH-C1) hanno evidenziato una differenza sostanziale tra i due diversi gruppi.
Nel gruppo Cismon, infatti, 25 su 84 esemplari sono risultati eterozigoti al locus LDH-C1, pur in presenza di mtDNA “marmoratus” (MA) in tutti i pesci analizzati. La presenza negli esemplari ibridi dei soli genotipi LDH eterozigoti 90/100, in assenza di quelli omozigoti atlantici 90/90, farebbe propendere per una loro assegnazione ad ibridi di prima generazione (generazione F1) generati dall’incrocio di femmine marmoratus con maschi atlantici o ibridi. Nella tabella sottostante è riportato il quadro analitico con evidenziati in giallo gli esemplari da avviare alla carriera riproduttiva.
SAMPLE
NUMBER CODE LENGHT cm WEIGHT kg D-LOOP LDH-C1* SSa85 SSa197 STR15
1 1910251 37 0,675 MA ME 105 187/191 219/227
2 1971917 37 0,525 MA ETER
3 2036581 45 1,11 MA ME 105/113 138/150 219/227
4 1936462 42 0,775 MA ME 105 165/178 219
5 1841077 35 0,675 MA ME 105 200/232 219
6 2019401 46 1,195 MA ME 105 189 219
7 1866632 43 0,855 MA ME 105 146/179 219
8 1819445 45 1,025 MA ME 105/113 166/179 219
9 1937888 34 0,38 MA ETER
10 1948881 34 0,36 MA ETER
11 1990803 36 0,52 MA ETER
12 1959111 44 1,05 MA ETER
13 1947234 42 1,055 MA ETER
14 1725244 32 0,395 MA ME 105/113 rifare 219/227
15 1900413 40 0,84 MA ETER
16 1825241 41 0,685 MA ME 105 165/182 219
17 1924464 42 0,935 MA ME 105 146 219
18 1949263 42 0,9 MA ME rifare 165/186 219
19 1752922 43 0,985 MA ETER
20 1991222 40 0,695 MA ME 105 178/190 219
21 2038294 42 0,89 MA ME 105 165/186 219
22 1974549 46 1,235 MA ETER
29
23 1967632 40 0,765 MA ME 105 165/190 219
24 1944455 40 0,7 MA ME 105/113 138/165 219
25 1945699 45 0,96 MA ME 105 190/198 219
26 1910354 34 0,555 MA ME 105/113 165/206 219/227
27 1931664 56 2,5 MA ME 105 185/189 219
28 1954799 47 1,235 MA ME 105 177/189 219
29 2017761 40 0,705 MA /
30 2037733 41 0,8 MA ME 105 189/189 219
31 19522688 40 0,71 MA ME 105 146/198 219
32 1992492 35 0,6 MA ME 105/113 189/206
? 219/227
33 1720248 39 0,69 MA ME 105/113
? O 115 149/181 219
34 1797981 45 1,5 MA ETER
35 2038335 50 1,325 MA ME 105 146/177 219
36 2016794 44 0,97 MA ME 105 189/206 171/219
37 1913666 41 0,905 MA ETER
38 1976178 35 0,53 MA ETER
39 1951130 35 0,535 MA ME 105 rifare 171/219
40 1945926 43 0,875 MA ME 105 138/189 171/219
41 1810615 34 0,445 MA ETER
42 1757262 43 0,875 MA ME 105 164/176 171/219
43 1960089 41 0,84 MA ME 105 164/176 171/219
44 2011792 46 1,41 MA ME 105 136/164 171/219
45 2616146 40 0,725 MA ME 105 145/185 171/219
46 1888482 53 1,825 MA ME 100 145 171/219
47 1967202 40 0,52 MA ME 105 181/189 171/219
48 1908757 39 0,775 MA ETER
49 1819454 34 0,455 MA ETER
50 1905158 40 ? MA ME 105 145/189 171/219
51 1443702 45 1,025 MA ME 105/113 148/176 171/219
52 1757852 47 1,1 MA ME 105 DA FARE
30
53 2015119 39 0,7 MA ETER
54 1815207 36 0,49 MA /
55 1807966 52 1,56 MA ME 105 rifare 171/219
56 1951741 56 2,27 MA ME 105 145 171/219
57 1955550 49 1,335 MA ME 105 145 171/219
58 1805424 45 1,04 MA ME 105 149/205
? 171/219
59 1952870 42 0,87 MA ETER 171/219
60 1757076 45 1,035 MA ME 105 145/189 171/219
61 1820708 44 0,97 MA ETER
62 2017644 36 0,525 MA ME 105 164/189
? 171/219
63 1954308 34 0,445 MA ME 105 189/197 171/219
64 1935300 36 0,54 MA /
65 1876275 51 1,6 MA ME 105 181/189 171/219
66 1936050 43 0,825 MA ME 100/108 189/205 171/219
67 1828071 45 1,235 MA ETER
68 1889656 45 1,07 MA ME 105 189/213 171/219
69 1912164 42 0,905 MA ETER
70 2014442 46 0,96 MA ETER
71 1955563 35 0,49 MA /
72 1909081 39 0,595 MA ETER
73 1948803 41 0,785 MA ME 105 181/189 171/219
74 1931470 33 0,49 MA ETER
75 1778271 33 0,46 MA ETER
76 1910226 48 1,175 MA ME 105 189 171/219
77 1930561 41 0,895 MA ME 105 189/213 171/219
78 1851063 43 0,84 MA ME 105 164/180 171/219
79 1821695 37 0,73 MA ME 105 177/189 219
80 1781363 33 0,405 MA ME 105/113 189/197 219/227
81 1916523 39 0,818 MA ETER
82 1766616 33 0,39 MA ME 105 177/189 219
31
83 1935257 38 0,66 MA ME 105 164/180 219
84 2015624 36 0,565 MA ME 105 164/180 219
Lo stesso approccio è stato eseguito su 85 esemplari appartenenti al ceppo Piave. In questo caso la percentuale di marmorate pure ai marcatori D-Loop ed LDH è risultata dell’87%. Settantaquattro esemplari su un totale di 85 analizzati sono utilizzabili in pratiche ittiogeniche. Gli esemplari da avviare alla carriera riproduttiva sono evidenziati in giallo nella tabella sottostante.
SAMPLE
NUMBER CODE LENGHT cm WEIGHT kg D-LOOP LDH-C1* SSa85 SSa197 STR15
85 1825414 57 0,625 MA ME 105/113 144/180 219
86 1955725 43 0,795 MA ME 105 144/180 219
87 1945756 48 1,34 MA ME 105 180/184 219/229
88 1950078 54 1,8 MA ME 105 144/184 219/229
89 1950910 39 0,66 MA ME 105/113 144/180 219/227
90 2037561 55 1,88 MA ME 100/108 156/180 219
91 1915335 47 1,41 MA ME 105 144/184 219/229
92 1916583 48 1,395 MA ME 105 180/184 220?
93 1908492 47 1,1 MA ME 105/113 180/184 220?
94 1889766 50 1,445 MA ME 105/113 144/184 220?
95 1907291 38 0,665 MA ME 105/113 176/180 228/230?
96 1825868 42 0,85 MA ME 105 180/184 219/227
97 1908492 44 0,955 MA ME 105 144/180 220/230
98 1811447 48 1,59 MA ME 105 156/180 rifare
99 1990801 47 1,21 MA ME 105 184/188 219/227
100 1843876 51 1,575 MA ME 105 156/180 219
101 1816235 53 1,79 MA ETER
102 1913269 44 0,9 MA ATL
103 1888815 37 0,72 MA ME 105 176/180 219/227
104 1971694 52 1,83 MA ME 105 180 219
105 1889295 50 1,56 MA ME 105 132/176 219
106 1946858 47 1,31 MA ME 105/111 180 219
107 1867477 50 1,428 MA ME 105/113 176/180 219
32
108 1977368 48 1,425 MA ME 105 180/184 219
109 1907036 53 1,63 MA ME 105/113 144 219
110 1951134 47 1,29 MA ME 105/113 180 219
111 1890678 41 0,55 MA ME 110/112 144 219
112 1890484 45 1,085 MA ATL
113 1888431 52 1,625 MA ME 105/113 144/184 219/229
114 2013281 37 0,555 MA ME 105 180/184 171/219
115 1811683 51 1,555 MA ME 105 144/184 171/219
116 1975730 54 1,32 MA ME 105 144/184 171/219
117 1972028 59 2,285 MA ME 105/113 144 171/219
118 1991478 46 1,115 MA ME 105 144/176 171/219
119 1950102 48 1,64 MA ME 105 180 171/219
120 1992057 43 1,01 MA ME 105 192/200 171/219
121 2038133 46 1,08 MA ME 105 176/184 171/219
122 1971105 45 1,145 MA ME 105 176/180 219/229
123 1922674 44 1 MA ME 105 144/176 219/229
124 1857300 49 1,395 MA ME 105/113 144/180 171/219
125 1971603 44 1,035 MA ME 105/113 180/184 171/219
126 1825763 46 1,295 MA ME 105 144/176 171/219
127 1826384 44 1,143 MA ME 105 144 171/219
128 2016077 52 1,47 MA ME 105/113 144 171/219
129 1856077 53 1,7 MA ME 105/113 144 171/219
130 1912067 48 1,395 MA ME 105/113 176/180 171/219
131 1868099 44 0,935 MA ETER
132 1911249 51 1,815 MA ME 105 176/180 219
133 1974237 41 1 MA ME 105/113 180 219/227
134 1929996 47 1,8 MA ME 105/113 181/184 219/227
135 1953878 45 1,14 MA ME 105 182/186 219
136 1953197 52 1,795 MA ETER
137 1757775 50 1,71 MA ETER
138 1968444 44 1,01 MA ETER
139 1932780 46 1,09 MA ME 105 140/176 219/227
33
140 1934735 47 1,295 MA ETER
141 1961311 44 0,985 MA ME 105/113 176/180 219/229
142 1919466 47 1,39 MA ME 105/113 rifare 219
143 1966315 51 1,755 MA ETER
144 1959843 51 1 MA ETER
145 1818898 41 0,777 MA ETER
146 1889618 52 1,13 MA ME 105 rifare 219
147 1973898 47 1,2 MA ME 105 144/180 219/227
148 1961954 43 1,075 MA ME 105/113 90/94 227/229
149 1990392 52 1,79 MA ME 105/113 180 219
150 1959449 50 1,?50 MA ME 105/113 144/180 171/219
151 2015056 52 1,65 MA ME 105/113 144/176 171/219
152 1908064 49 1,37 MA ME 105/113 144 171/219
153 1909610 50 1,52 MA ME 105 180/184 171/219
154 1961717 52 1,83 MA ME 105/113 144/176 171/219
155 1888174 45 1,19 MA ME 105/113 144/176 171/219
156 1973055 56 2,9 MA ME 105 144/184 171/219
157 1768571 44 1,09 MA ME rifare 176/180 171/219
158 2038205 45 1,1 MA ME 105 144/184 219/229
159 1812568 51 1,87 MA ME 105/113 144/184 219/229
160 1889801 43 0,95 MA ME 105/113 180/184 219/229
161 1888785 43 0,835 MA ME 113 180/184 219/229
162 1955741 39 0,735 MA ME 105 176/180 171/219
163 1976864 47 1,28 MA ME 105 144/184 171/219
164 1962136 40 0,965 MA ME 105 184 171/219
165 2018053 48 1,33 MA ME 105 176/180 171/219
166 1848122 47 1,485 MA ME 105 144/180 219/229
167 1810431 48 1,33 MA ME 105/113 144/184 171/219
168 1960518 46 1,34 MA ME 113 144/180 171/219
169 1968843 40 0,76 MA ME 105/113 180/184 171/219
Per quanto concerne i marcatori microsatellite è bene precisare che su questo lotto il numero di marcatori analizzato non consente, al momento attuale, valutazioni conclusive sui livelli di variabilità
34 genetica. Su questo lotto è infatti in corso un’ulteriore fase sperimentale, non prevista inizialmente, di messa a punto di ulteriori loci microsatellite al fine di aumentare il potere di risoluzione analitica da associare alle pratiche di crioconservazione già in atto presso l’impianto di Valdastico.
Prof. Francesco Nonnis Marzano
Spin Off Accademico Gen Tech e Università Parma
Parma, Ottobre 2015
35 CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME DI TROTA MARMORATA DI ALLEVAMENTO
L'attività principale effettuata in collaborazione con la Gen Tech srl, spin off, è stata quella di fornire i campioni di sperma e tessuto alla Cryogenetics, coordinare i processi di fecondazione con il materiale crioconservato e valutare la sopravvivenza del materiale prodotto.
Tutto il lavoro è stato eseguito presso il Centro Ittico Sperimentale Valdastico.
Date Attività
11 novembre 2013
La raccolta di campioni genetici di trota marmorata per la crioconservazione e la pianificazione degli incroci per ottenere la massima variabilità genetica.
27 novembre 2013 Controllo della maturità dei maschi per la raccolta dello sperma.
9 dicembre 2013 Raccolta dello sperma dai maschi di trota di marmorata e spedizione in Norvegia a Cryogenetics.
20 dicembre 2013
Recupero del serbatoio criogenico all'Università di Parma con lo sperma congelato trota marmorata, provenienti dalla Norvegia - Cryogenetics.
20dicembre 2013 Trasporto del serbatoio criogenico al Centro Ittico Valdastico.
23 dicembre 2013 Fecondazione delle uova di trota marmorata.
30 dicembre 2013 Processo e controllo di fecondazione delle uova di trota marmorata
7 gennaio 2014 Processo e controllo di fecondazione delle uova di trota marmorata
15 gennaio 2014 Processo e controllo di fecondazione delle uova di trota marmorata.
23 gennaio 2014 Processo e controllo di fecondazione delle uova di trota marmorata.
04 gennaio 2014 Controllo di fecondazione delle uova di trota marmorata.
Processo di fecondazione delle uova di trote marmorata è stato eseguito come indicato dal specifico protocollo fornito dalla Cryogenetics. La maggior parte delle femmine utilizzate (raccolta di tessuto in data 11.11.2013) sono state studiate analizzando una decina di loci polimorfici che consente una diagnosi più particolareggiata, caratterizzata da un maggiore potere di risoluzione per l’identificazione di ibridi.
36 Raccolta dello sperma dai maschi maturi
Attività durante le prove di fecondazione. In primo piano il serbatoio criogenico con lo sperma congelato.
In seguito vengono riportati i dati relativi ai campioni di sperma raccolti di ogni maschio di trota marmorata per pianificare la conservazione a lungo termine e successivo utilizzo nelle fecondazioni.
Le uova fecondate con lo sperma crioconservato sono state incubate in embrionatori separati per la corretta tracciabilità dei lotti e successivo controllo del tasso di fecondazione.
37 Il tasso di fertilizzazione con lo sperma crioconservato, è stato stimato immergendo in acido acetico le uova per qualche minuto, permettendo cosi di sottolineare gli embrioni in via di sviluppo dopo 7/10 giorni dalla fecondazione e contare il numero di embrioni in via di sviluppo.
Le uova sono state raccolte a random dei diversi incubatori in un numero di 30/50 uova ogni volta.
Nella fotografia si evidenziano nelle uova immerse in acido acetico gli embrioni di colore bianco; il tasso di fecondazione risulta elevato.
Nella fotografia si evidenziano uova immerse in acido acetico con pochissimi embrioni; il tasso di fecondazione risulta molto basso.
In totale, un numero di 16.500 uova sono stati utilizzati durante le prove di fecondazione con lo sperma crioconservato. I risultati finali sono buoni dati relativi tasso di fecondazione relative a diversi maschi e femmine, sono in seguito elencati
38 Per il calcolo della percentuale di fecondazione non sono state considerate le uova che evidenziavano qualche alterazione. Le uova dei lotti con tasso di fecondazione pari al 0% sono state eliminate.
Una piccola quantità di uova è stata fecondata utilizzando sperma fresco di trota marmorata, come gruppo di controllo. La percentuale di fecondazione con sperma fresco è risultata tra il 40 e l'70%.
Il materiale prodotto rimane in accrescimento in impianto con l’obiettivo di poter utilizzarli come futuri riproduttori.
Lo sperma congelato restante rimarrà fino a dicembre 2015 in Norvegia - Cryogenetics; verrà utilizzato se continuerà l’nel periodo di fecondazione 2015/2016.
Questo primo processo di fecondazione, eseguita durante 2013/2014, utilizzando sperma crioconservato è stato uno strumento innovativo, utile a migliorare il protocollo di allevamento e conservazione della variabilità genetica di questa specie endemica italiana.
Le nuove pratiche impegnate in Impianto prevedono che lo sperma fresco venga raccolto in mattina conservandolo a 4°C. Questo comporta meno stress per i maschi che tornano immediatamente nelle vasche.
Lo sperma fresco può essere stoccato e conservato fino a 14 giorni con l’utilizzo di specifiche sostanze chimiche per l'uso durante giorni successivi.
