Nel periodo da Maggio 2002 a Giugno 2012, 14191 pazienti ostetriche a basso rischio (13833 singole, 358 gemellari) sono state valutate nell’ambito dello screening del primo trimestre principalmente per la Sindrome di Down o Trisomia 21, ma anche per altre anomalie che interessano il cariotipo fetale, presso l'ambulatorio ecografico dedicato nella Divisione di Ostetricia e Ginecologia Universitaria dell'AOU di Pisa, per la personale valutazione del rischio nel primo trimestre a 11-13+6 settimane di amenorrea secondo le linee guida della Fetal Medicine Foundation di Londra (37).
Dopo consenso informato, ogni Paziente è stata sottoposta ad un esame ecografico per via transaddominale ed, in alcuni casi, per via endovaginale, allo scopo di identificare la maggior parte dell’anatomia normale fetale e di eventuali difetti e di misurare il CRL fetale, lo spessore della traslucenza nucale (NT) ed eventuali altri parametri ultrasonografici. (37-39, 42-44, 75- 78, 83, 108, 120, 128, 142). L'esame si è svolto per valori di CRL compresi tra 48 ed 84 mm. La misurazione della translucenza nucale segue dei canoni ben precisi, come precedentemente descritto.
In questi 10 anni, l’esame è stato eseguito con apparecchi ecografici diversi. Nello specifico: dal 2002 al 2004 con Esaote AU5, dal 2004 al
2009 con Esaote Technos e, quindi, dal 2009 ad oggi con Voluson E8 Expert della GE Healthcare.
Le Pazienti si presentavano alle ore 8.00 del mattino per eseguire un prelievo ematico volto alla valutazione biochimica di PAPP-A e free β- hCG: l’analisi successiva dei campioni di sangue è stata affidata al sistema Brahms Kryptor della Brahms AG, Berlino, Germania, capace di fornire misurazioni del markers biochimico già dopo 30 minuti.
Le Pazienti, dopo approfondita anamnesi genetica, si sono sottoposte ad ecografia ostetrica per la valutazione della NT.
Per prima cosa, è stato calcolato il rischio per trisomia 21 legato all’età materna a termine e quindi aggiustato in base all’epoca gestazionale al tempo dello screening. Successivamente, il valore della NT misurata è stato trasformato in LR (likelihood ratio) ricorrendo al modello misto di distribuzione della NT. I valori misurati di free β-hCG e PAPPA sono stati convertiti in MoM in base all’epoca gestazionale, il peso materno, l’etnicità, lo smoking status, il metodo di concepimento e la parità, e successivamente è stata calcolata la LR a partire dalle distribuzioni Gaussiane bivariate nelle gravidanza affette da trisomia 21 e in quelle non affette. I valori di LR per NT e per i markers biochimici sono stati quindi moltiplicati per il rischio legato all’età materna al tempo dello screening in ogni caso e le detection rates e il tasso di falsi positivi calcolate considerando la proporzione di gravidanze al disopra di un dato limite di
rischio fissato al valore di 1 su 250 in base alle linee guida nazionali e regionali toscane. I dati sono stati elaborati tramite software ASTRAIA della FMF.
Dal momento della loro introduzione nella nostra pratica clinica a partire dal 2008 abbiamo applicato lo screening con i markers ultrasonografici addizionali solo a quella sottopopolazione ostetrica con rischio intermedio risultante al primo step combinato del primo trimestre, ovvero alle pazienti con rischio compreso tra 1:250 e 1:1000, sottopopolazione dove risultano circa il 10-12% di feti Down. Quindi le misurazioni ecografiche sono state introdotte nel software per il nuovo calcolo del rischio specifico per quella paziente.
È importante sottolineare che il Dottor Carlo Luchi ha deciso di includere dal 2004 la valutazione dell’osso nasale in maniera integrata all’interno del calcolo del rischio per aneuploidie, considerando che esso ha una LR positiva media del 45% per trisomia 21. A tal riguardo, Pisa è stata il primo centro in Toscana e tra i primi in Italia ad adottarlo in questa maniera. Solo successivamente all’introduzione dell’utilizzo dei markers addizionali e, dunque, dell’aggiornamento dell’algoritmo, ovvero dal 2008, la valutazione dell’osso nasale è stata eseguita, da sola o congiuntamente alla valutazione degli altri markers ultrasonografici, solo nei casi con rischio intermedio risultanti al primo step dello screening combinato.
Tutte le pazienti nel corso di questi anni sono state informate riguardo il significato del valore del rischio combinato calcolato al termine dello screening del primo trimestre e anche riguardo alle opzioni di management disponibili per la diagnostica prenatale, compresa l’amniocentesi ed il prelievo dei villi coriali, nel caso di un valore superiore a 1 su 250.
Ciò premesso, sono state estrapolate dal software cinque stringhe di ricerca del database: NT ed età materna - NT, età materna e biochimica - NT, età materna ed osso nasale - NT età materna, osso nasale e biochimica - NT, età materna, osso nasale, biochimica e tutti i markers ultrasonografici addizionali.
Analisi statistica
Si è ricorso al modellamento dei dati tramite regressione multipla dei valori dei markers biochimici trasformati in log10 per produrre logaritmi dei MoM per free B-hCG e per PAPP-A, ottenendo distribuzioni bivariate Gaussiane fittate su tali log10. L’adeguatezza del modello fittato è stata valutata tramite le distanze quadratiche di Mahalanobis su cui è stata eseguita statistica con chi-quadro. Gli outliers al 99,99esimo percentile sono stati rimossi.
La detection rate (DR) e la percentuale di falsi positivi (FPR) sono state calcolate considerando nella popolazione screenata solo quelle con rischio superiore ad un dato valore soglia (1:250). A partire da queste (DR e FPR) sono stati quindi ottenuti i tassi standardizzati pesandoli sulla distribuzione dell’età materna in Toscana anni 2002-2004.
Successivamente i tassi ottenuti sono stati confrontati con quelli nati dalle catene di Markov del metodo Monte Carlo (MCMC), costruite sulla sopracitata distribuzione dell’età materna nelle gravidanze affette e in quelle non affette in Toscana dal 2002 al 2004, sulla distribuzione della NT secondo il modello misto e sulle distribuzioni fittate dei log10 dei MoM di free B-hCG e per PAPP-A, simulando dati per 10000 unità per ogni categoria considerata.
Per modello misto di distribuzione della NT fetale, dal punto di vista statistico, si intende una commistione di due distribuzioni Gaussiane: la prima, una proporzione (1-p) in cui esiste una relazione quadratica tra il log10 (NT) medio (µo) e il CRL fetale (µ0 = β0 + (β1 × CRL) + (β2 × CRL2)) con una deviazione standard costante (σ0), e la seconda, una proporzione in cui la NT è indipendente dal CRL fetale con una media µ1 ed una DS σ1. La prima si osserva nelle gravidanze non affette, la seconda in quelle affette, con le proporzioni che ovviamente differiscono a seconda del tipo di anormalità (trisomia 21, trisomia 18, trisomia 13 e sindrome di
Turner). Per le gravidanze affette, la componente CRL-dipendente domina e p è vicina a zero, mentre, per quelle affette la componente CRL- dipendente è non comune e p quindi è vicina a 1. In questo modello p = 1/(1 + exp(−α0 – α1CRL)).
In ogni caso il rischio specifico per trisomia 21 è stato stimato moltiplicando il rischio legato all’età per la frazione di verosomiglianza o likelihood ratio (LR) per la NT secondo il suo modello misto di distribuzione nel caso di NT+MA e, aggiuntivamente, per la LR dei markers materni nel caso di NT+BIO, di NT+NB+BIO e di NT+BIO+ULTRA.
Inoltre, nel caso dei markers ultrasonografici addizionali (ULTRA), il rischio è stato modificato ricorrendo all’analisi dei dati tramite regressione logistica multipla per modellare la probabilità condizionale di una caratteristica ultrasonografica addizionale per volta e poi tutte insieme (osso nasale assente o dotto venoso con flusso assente o invertito o tricuspide con rigurgito o angolo facciale (FA) superiore al 95esimo percentile) a partire dal cariotipo fetale, la NT fetale e i markers biochimici utilizzando come covariabili l’abitudine al fumo e il peso materno. Successivamente, è stato applicato il teorema di Bayes per predire i rischi di trisomia 21, trisomia 13, trisomia 18 e sindrome di Turner.
Risultati
• # NT+MA
Sono state sottoposte a screening del primo trimestre per anueploidie 14191 gravidanze di cui 13833 gravidanze singole e 358 gravidanze gemellari (342 gravidanze bigemine, 15 trigemine e 1 sola gravidanza quadrigemina). L’età media totale è stata di 32 anni circa con un range che va dai 16 ai 56 anni di età e con il 31% della popolazione con età superiore o uguale a 35 anni di età.
Su un totale di 13833 gravidanze singole l’età materna è stata valutata in feti di CRL tra 48 e 84 mm in associazione con la misurazione della NT in 1296 casi.
In questa sottopopolazione l’età materna media è stata di 31 anni, con un range che va dai 20 ai 42 anni e con circa il 19.3% delle pazienti con età maggiore o uguale a 35 anni. L’associazione NT ed età materna ad un tasso di falsi positivi fisso del 3% e del 5% presenta una sensibilità stimata rispettivamente del 73% e del 75% per tutte le anomalie cromosomiche e del 69% e 72% circa per la sola trisomia 21 (cfr tabelle sottostanti).
Sulle 32 gravidanze gemellari e sull’unica trigemina screenata tramite NT ed età materna, invece, l’età materna media è di 35 anni circa (range: dai 32
ai 40 anni). Nessuna gravidanza è risultata positiva al test o è stata successivamente interessata da anomalie cromosomiche.
Nell’insieme delle gravidanze gemellari screenate con NT ed MA si segnalano, inoltre, due casi molto rari di cui con una feto acranico e una con feto affetto da TRAP syndrome.
• # NT+NB
Nell’ambito dello screening del primo trimestre, l’osso nasale è stato valutato in 3882 gravidanze singole (età media: 31,7; range: 16-56), in 111 gravidanze gemellari (età media: 33,3; range: 21-46), in 14 trigemine (età media: 33; range: 27-36) e nella unica quadrigemina (età: 32 aa) valutata in dieci anni di esperienza.
Nel 95,63% dei casi è risultato normale, incerto nel 4,04% e anormale (assente o ipoplastico) in circa una gravida su 300. Solo 10 gravidanze sono risultate affette da cromosomopatie ed hanno richiesto interruzione a seguito di conferma tramite amniocentesi. Sono state escluse dalla valutazione gli aborti e i record incompleti.
Nel 70% circa delle gravidanze affette da Trisomia 21 l’osso nasale è risultato essere incerto o assente/ipoplastico.
L’associazione NT, MA e valutazione qualitativa dell’osso nasale a tassi fissi del 3% e del 5% presenta una detection rate modellata rispettivamente dell’ 83% e 85% e del 79% e dell’82% per la sola sindrome di Down (cfr tabelle sottostanti).
Nelle 111 gravidanze gemellari indagate, solo 6 gravidanze sono risultate positive allo screening con età materna ed osso nasale (età media: 33.5; range: 29-40) e di queste una sola ha avuto come esito dell’amniocentesi una trisomia 18. In questo caso il 50% delle pazienti screenate positive presentano osso nasale incerto o assente/ipoplastico e di esse, come già detto, un terzo è affetto da aneuploidia. La DR ad una FPR del 3% e del 5% risulta essere rispettivamente del 71% e del 74%
Nelle quattordici gravidanze trigemine e nell’unica quadrigemina screenate con l’associazione NT, età materna e osso nasale, il rischio per aneuploidie è risultato negativo in ogni caso. Non esistono record falsi negativi in questa sottopopolazione.
• # NT+BIO
Il dato biochimico è risultato associato all’età materna e alla translucenza in soli 197 record (età media: 31,1; range: 18-44), in cui lo screening ha
prodotto 7 risultati positivi e dei quali solo uno è risultato essere affetto da trisomia 21 (cfr tabelle sottostanti).
La DR stimata di questo metodo di screening secondo i dati introdotti ad una FPR del 3% e del 5% sarebbe dell’ 86% e 88% e per la sola trisomia dell’83% e dell’85% 21.
Inoltre, complessivamente il dato biochimico è risultato alterato in solo 3 gravidanze singole e solo in una con risultato dello screening positivo che ha preferito non sottoporsi a indagini diagnostiche invasive e che partorito un feto sano a termine.
Il dato biochimico in associazione alla NT è stato utilizzato solo in 6 gravidanze gemellari (età media: 34.5; range: 29-40) di cui nessuna è risultata positiva al test.
Non esistono nel nostro database dati biochimici accoppiati a valutazione di screening al primo trimestre per gravidanze trigemine o di ordine superiore.
• # NT+NB_BIO
Degli 8251 casi in cui si è ricorso alla valutazione qualitativa dell’osso nasale (normal/abnormal/uncertain) in associazione alla NT-età materna e biochimica (età media: 32; range: 16-49) sono state definite ad alto rischio
per aneuploidie 125 casi di gravidanze singole, di cui 24 sono risultate essere affette da aneuploidie come evidenziato dal risultato dell’amniocentesi e dal riscontro genetico postmortem, identificando nell’ordine: 15 trisomie 21, una trisomia 18, 3 trisomie 13, 2 sindromi di Turner e altre tre aberrazioni cromosomiche. Si registrano, inoltre, 14 falsi negativi di cui 8 trisomie 21, due trisomie 18, una trisomia 13 e altre tre anomalie cromosomiche.
Dei 125 casi screenati positivi la biochimica è risultata alterata nel 35,7% dei casi, di cui circa un quinto ha poi realmente avuto una aneuploidia, mentre, il 60% delle volte in cui una biochimica alterata si associa ad una valutazione di osso nasale assente/ipoplastico è presente realmente una aneuploidia. La DR modellata di questo metodo di screening ad una FPR del 3% e del 5% risulta dell’ 88% e dell’86% e per la sola trisomia 21 dell’88% e dell’85% (cfr tabelle sottostanti).
Delle 190 gemellari indagate (età media: 34,3; range: 22-43), il rischio per aneuploidie è risultato positivo solo nell’1.1% dei casi. Non si registrano casi di aneuploidie in questa sottopopolazione o casi falsi negativi.
Per le gravidanze trigemine o di ordine superiore vale la considerazione sopradetta al paragrafo precedente.
• # NT+NB_ULTRA (DV, TR e FA)
Il dotto venoso è stato valutato durante la nostra esperienza in 245 casi risultati al rischio intermedio (tra 1:251 e 1:1000) al primo step dello screening combinato del primo trimestre, risultando anomalo nel 4.1% dei casi.
Tra questi 245 casi il dotto venoso è stato associato alla valutazione del rigurgito della valvola tricuspide in 211 casi, risultando presente nel 4.7% dei casi, e alla misurazione dell’angolo facciale in 220 casi con misurazione al di sopra del 95esimo percentile per l’epoca gestazionale e il CRL nel 7.3% dei casi. Solo in 140 casi l’associazione dei tre markers ne ha visto valutati almeno due insieme.
Inoltre, in 3 casi su 4 in cui ad una anomalia del flusso sul dotto venoso si associa ad un reperto di osso nasale assente/ipoplastico è presente una aneuploidia (nel nostro caso una trisomia 21, una trisomia 18 ed una sindrome di Turner).
La valutazione ultrasonografica addizionale è stata riservata solo a 3 gravidanze gemellari (età media: 26; range: 23-31) di cui nessuna è risultata positiva al test. Non esistono record falsi negativi in questa sottopopolazione.
La DR stimata ad una FPR del 3 e del 5% risulta essere rispettivamente del 94% e del 96% e del 91% e del 93% per la sola trisomia 21(cfr tabelle sottostanti).
Da ultimo, le due gravidanze gemellari in cui si è ricorso alla valutazione di screening attraverso i markers addizionali sono state definite a basso rischio e non hanno partorito feti affetti da cromosomopatie.
Tabella 17
Quadro sinottico delle gravidanze singole screenate nel decennio 2002-2012
N° Aborti Veri positivi Falsi negativi
Osservati
NT+MA 1316 10 22 16 6
di
cui 6 2 Trisomia 21 4 Trisomia 21
1 positivi allo screening 6 5 Trisomia 18 1 Trisomia 18
4 3 Trisomia 13 1 Trisomia 13 2 2 Sindrome di Turner 0 Sindrome di Turner
7 record invalidi 4 4 Altre 0 Altre
NT+NB 3917 24 16 13 3
di
cui 6 6 Trisomia 21 0 Trisomia 21
8 positivi allo screening 7 5 Trisomia 18 2 Trisomia 18
0 0 trisomia 13 0 Trisomia 13 2 2 Sindrome di Turner 0 Sindrome di Turner
12 record invalidi 1 0 Altre 1 Altre
NT+BIO 209 1 1 1 0
di
cui 1 1 Trisomia 21 0 Trisomia 21
1 positivo allo screening 0 0 Trisomia 18 0 Trisomia 18
0 0 Trisomia 13 0 Trisomia 13 0 0 Sindrome di Turner 0 Sindrome di Turner
11 record invalidi 0 0 Altre 0 Altre
NT+NB_BIO 8251 1 38 24 14
di
cui 23 15 Trisomia 21 8 Trisomia 21
1 positivo allo screening 3 1 Trisomia 18 2 Trisomia 18
4 3 Trisomia 13 1 Trisomia 13 2 2 Sindrome di Turner 0 Sindrome di Turner
4 record invalidi 3 3 Altre 3 Altre
NT+
NB_ULTRA 140 0 5 5 0
di
cui 3 3 Trisomia 21 0 Trisomia 21
0 positivo allo screening 1 1 Trisomia 18 0 Trisomia 18
1 1 Trisomia 13 0 Trisomia 13 0 0 Sindrome di Turner 0 Sindrome di Turner
0 record invalidi 0 0 Altre 0 Altre
Totale 13833 36 10 positivi allo screening 82 59 23
Record
invalidi 34 di cui 27 Trisomia 21 12 Trisomia 21
Totale 12 Trisomia 18 5 Trisomia 18
screenate 13753 5 Trisomia 13 2 Trisomia 13
6 Sindrome di Turner 0 Sindrome di Turner 11 7 Altre 4 Altre
Tabella 18
Detection rates stimate a tassi di falsi positivi del 3% e del 5% per le gravidanze singole secondo il modello simulato a partire dalle distribuzioni dei nostri dati campionari
Detection Rate Detection Rate
FPR Totale Trisomia 21 FPR Totale Trisomia 21
NT+MA 0,03 73% 69% 0,05 75% 72% NT+NB 0,03 83% 79% 0,05 85% 82% NT+BIO 0,03 86% 83% 0,05 88% 85% NT+NB_BIO 0.03 88% 86% 0,05 91% 88% NT+NB_ULTRA 0,03 94% 91% 0,05 96% 93% Tabella 19
Valori osservati vs attesi a partire dal modello analitico utilizzato calcolati per Sindrome di Down, trisomia 18, trisomia 13 e Sindrome di Turner
t21 t18 t13 Turner
osservati attesi osservati attesi osservati attesi osservati attesi
NT *MA 6 9 6 8 4 5 2 3 NT *NB 6 8 7 9 0 0 2 3 NT* BIO 1 2 0 0 0 0 0 0 NT*NB_BIO 23 27 3 3 4 5 2 2 NT*ULTRA 3 4 1 1 1 1 0 0 TOTALE 39 50 17 21 9 11 6 8 Tabella 20
DR crude totali osservate nello studio NT *MA 67% NT *NB 77% NT* BIO 100% NT*NB_BIO 83% NT*ULTRA 100%
Conclusioni
Lo scopo dello screening per le anomalie cromosomiche nel primo trimestre di gravidanza è quello di selezionare, tramite l’integrazione dei dati anamnestici a quelli ecografici e biochimici materni, una popolazione a rischio di avere un feto affetto da una aneuploidia.
In particolare, si parla di screening per la trisomia 21 che permette una vita di relazione quasi normale, mentre, altri tipi di anomalie cromosomiche hanno una natimortalità elevata e non permettono una vita extrauterina. Il National Screening Committee Inglese raccomanda che lo screening test per la trisomia 21 debba avere una sensibilità almeno del 75% con una percentuale di falsi negativi del 3% o meno (177) e ciò per ridurre al massimo il numero di pazienti da sottoporre ad indagini di screening invasive.
In effetti, come abbiamo avuto modo di ricordare precedentemente, la sola età materna aveva il grosso svantaggio di sottoporre a metodiche di screening invasive tutta la popolazione ostetrica di età maggiore di 35 anni, a fronte di una sensibilità del 30% con una percentuale di falsi positivi del 10%.
Nel nostro studio, che ha ricoperto un lasso di tempo di dieci anni – da Maggio 2002 a Giugno 2012 - sono state sottoposte a screening per aneuploidie 14191 pazienti per mano di un unico operatore, il Dottor Carlo
Luchi, il quale, partendo inizialmente con la valutazione della sola translucenza nucale associata all’età materna, a partire dal 2004, ha iniziato a valutare qualitativamente l’osso nasale in maniera integrata, facendo diventare Pisa in questo campo il primo centro in Toscana e tra i pochi in Italia ad adottarlo in questa maniera.
Successivamente, lo screening del primo trimestre ha previsto l’integrazione del dato biochimico e, solo dal 2008, l’aggiunta dell’osso nasale all’interno dell’algoritmo di calcolo per il rischio per aneuploidie insieme alla valutazione qualitativa del dotto venoso e del rigurgito della tricuspide e alla misurazione dell’angolo facciale, riservandolo alle sole gravide con rischio intermedio (tra 1:250 e 1:1000).
Su queste oltre 14000 donne solo 226 casi (circa l’1,6%) sono risultate positive allo screening e di esse circa il 70% (165 donne) ha eseguito analisi del cariotipo ovvero solo l’1% circa della popolazione totale (una donna su 100).
Tale percentuale di positivi allo screening ha permesso, dunque, di restringere ulteriormente il target della popolazione da sottoporre ad indagini invasive, riducendo di fatto il numero di potenziali aborti, complicanza nota per tali metodiche con un rischio di circa l’1%.
A tal riguardo, se avessimo dovuto sottoporre ad amniocentesi/villocentesi le gravide con età superiore o uguale a 35 anni – il 31% circa -, circa una
donna su 3 sarebbe stata sottoposta al rischio di abortire a seguito della procedura.
Inoltre, su 14191 pazienti solo 71 casi sono risultati affetti da aneuploidia di cui 39 da Sindrome di Down, ovvero lo 0,27% della popolazione totale, ovvero una donna su 360 circa, a fronte di una percentuale di falsi positivi complessiva media di poco superiore al 2% (range: 1-4%).
La percentuale di falsi negativi maggiore di Trisomia 21 si è registrata nella categoria NT+MA, laddove si osserva lo 0,3% ovvero 1 donna su 333 screenate negative rispetto allo 0,10% circa (ovvero una donna su 1000) osservato tra le donne sottoposte a screening con NT, osso nasale e dato biochimico.
Non si è osservato, invece, nessun record falso negativo per trisomia 21 all’interno dello screening combinato con sola biochimica, nessuno all’interno della sottopopolazione sottoposta a screening con translucenza nucale fetale e osso nasale in maniera integrata e nessuno all’interno della categoria sottoposta a screening con i markers addizionali.
Dai dati introdotti all’interno del modello analitico è interessante, inoltre, notare come la stima in base alla distribuzione dell’età materna del numero di casi per Trisomia 21 risulti esser significativamente distante da quella cruda osservata nel campione (39 osservati vs 50 attesi) (cfr tabella 19). Abbiamo ipotizzato che la dispersione dei dati relativi alle anomalie cromosomiche nel nostro campione possa esser dovuta al fatto che alcuni
degli aborti registrati sul nostro database potessero esser affetti da aneuploidie.
Infatti per alcuni di essi, indipendentemente dal quadro ecografico successivamente valutato, il software ha comunque calcolato sulle base dei valori inseriti il rischio risultante. Si ricorda, a tal riguardo, che circa il 30% delle gravidanze affette da trisomia 21 si interrompono spontaneamente al primo trimestre di gravidanza.
Nel nostro database esistono circa 36 aborti spontanei, di cui sappiamo che il 30.5% ha avuto un risultato positivo al test. È ragionevole supporre che una quota di essi fossero interessati da anomalie cromosomiche che sono giocoforza sfuggite alla identificazione tramite analisi del cariotipo.
Nello specifico, la maggior dispersione si registra soprattutto a livello delle sottopopolazioni screenate con sola età materna e con osso nasale, che pertanto sono quelle in cui si osservano valori inferiori agli standard per quanto riguarda la sensibilità cruda del test (cfr tabella 19 e 20).
I dati che risultano dal nostro studio evidenziano come, nel corso degli