CAMPIONAMENTO
Tutti i campioni di materiale prelevato provengono da animali cacciati da novembre 2010 a gennaio 2013, nel corso di tre stagioni venatorie,in diverse zone della provincia di Pisa (43°24’ N, 10°52’ E).
Il materiale è stato prelevato dalle carcasse al momento dell’eviscerazione.
- 50 campioni di feci, prelevate dall’ampolla rettale. I campioni sono stati messi in appositi contenitori in plastica, identificati (numero di capo abbattuto, data di raccolta, località) e conservati, tramite refrigerazione, fino al momento della flottazione.
- Il primo tratto intestinale di 32 soggetti. I campioni sono stati messi in buste in plastica, identificati (numero di capo abbattuto, data di raccolta, località) e conservati a -20°C fino al loro esame.
- Campioni di diaframma prelevati da 65 soggetti. I campioni sono stati messi in appositi contenitori in plastica, identificati (numero di capo abbattuto, data di raccolta, località) e conservati a -20°C fino al loro esame.
- 213 campioni di siero. Il sangue è stato raccolto tramite provette di vetro sterili direttamente dalla cavità toracica al momento dell’eviscerazione o, quando possibile, dalla cavità cardiaca, prima possibile dopo l’abbattimento usando una siringa da 20ml. Abbiamo lasciato coagulare il sangue a temperatura ambiente e quindi separato il siero, tramite centrifugazione. Il siero è stato conservato in provette Eppendorf da 1,5ml a -20°C fino ad analisi.
FLOTTAZIONE CON SOLUZIONE SATURA DI NITRATO DI SODIO
Per ogni campione è stato effettuato un esame coprologico tramite flottazione con soluzione satura di NaNO3 (ps=1200). Una quantità pari a circa 2 grammi di feci viene
messa in un colino a maglie strette posto sopra ad un mortaio e vi si addiziona la soluzione di nitrato di sodio. Quindi si stempera con una bacchetta di vetro in modo tale da ottenere una soluzione quanto più possibile omogenea e in modo tale che nel colino rimangano le impurità più grossolane.
Si versa il filtrato in una provetta di vetro della capacità di 15 ml riempiendola fino a formare un menisco convesso, facendo attenzione a non sversare il composto. Poniamo sopra il menisco un vetrino copri-oggetto e attendiamo circa dieci minuti affinché l’eventuale materiale parassitario presente possa aderire al vetrino.
Trascorso il tempo necessario, il vetrino viene posto su un vetrino porta-oggetto, pronto per l’osservazione al microscopio.
E’ importante che la velocità di esecuzione sia quella corretta affinché le uova o le oocisti abbiano modo di risalire ma senza lasciar trascorrere troppo tempo, perché una soluzione a così alta concentrazione salina andrebbe incontro a fenomeni di cristallizzazione, che inevitabilmente comprometterebbero la buona visibilità del campione.
Il vetrino deve essere visionato subito dopo essere stato allestito, iniziando ad esaminarlo a basso ingrandimento (10x) per avere una visione d’insieme e poi a ingrandimento maggiore (40x). Il vetrino deve essere controllato nella sua totalità, senza trascurare nessuno spazio in particolare il bordo. Una volta individuato l’elemento parassitario passiamo all’ingrandimento da 100x ed eventualmente misurarlo con un oculare micrometrico.
La flottazione è una tecnica qualitativa che si basa sullo sfruttamento del peso specifico degli elementi che desideriamo isolare per separarli dal resto del materiale.
RICERCA VISIVA MACROSCOPICA DI PARASSITI
Gli intestini tenui, individualmente congelati ed etichettati, dopo preventivo scongelamento sono stati analizzati per la ricerca di eventuale materiale parassitario al loro interno.
In sala necroscopie, ogni organo è stato aperto in senso longitudinale e ne è stato esaminato il contenuto ad occhio nudo.
DIAGNOSTICA SIEROLOGICA : MAT- MODIFIED AGGLUTINATION TEST
Abbiamo saggiato i campioni di siero delle stagioni venatorie 2012 e 2013 per la presenza di IgG contro T. gondii, con la metodica MAT, usando un kit commerciale (TOXO SCREEN DA®, bioMérieux, Lyon, France) con tachizoiti interi fissati in formalina, come antigene.
L’aggiunta di 2-beta-mercaptoetanolo permette la denaturazione delle IgM per cui rimarranno solamente le IgG. All’aggiunta dell’antigene, dopo incubazione, nei sieri positivi si assisterà ad un fenomeno di agglutinazione, in quanto gli anticorpi antitoxoplasma sono agglutinanti.
- Si procede con una prima diluizione 1:5 dei sieri in esame con tampone PBS: si usa una pipetta monocanale per mettere 10µl di siero da testare con 40 µl di tampone PBS in una piastra multi pozzetto;
- Si aggiungono 50µl di 2-beta-mercaptoetanolo, così da poter permettere la denaturazione delle IgM ed arrivare ad una diluizione del siero di 1:10;
- Si prelevano 50µl del composto (siero + tampone PBS + 2-beta-mercaptoetanolo) e vi si aggiungono 50µl di antigene;
- Tra un passaggio e l’altro provvediamo a mescolare il composto;
- Si lascia incubare la piastra a temperatura ambiente,coperto da una pellicola trasparente onde evitare l’evaporazione. I risultati sono visibili dopo circa 4 ore ma è preferibile lasciar trascorrere almeno 8 ore per massimizzare la visibilità di una eventuale agglutinazione;
- Per ogni piastra è stato messo un campione positivo e negativo di controllo;
- I campioni negativi si presentano come puntini netti nel pozzetto, dati dalla precipitazione sul fondo dell’ antigene, che non si è legato agli anticorpi;
- I campioni positivi si presentano come un alone nel pozzetto dato dall’agglutinazione dell’antigene;
- Abbiamo analizzato i campioni risultati positivi alla diluizione 1:10 a diluizioni seriali per raddoppio, fino ad arrivare a stabilire il titolo;
- L’analisi viene eseguita sotto cappa a flusso laminare.
La scelta di usare il test MAT è stata dettata dal fatto che tale test è stato precedentemente provato essere il più specifico e sensibile per la diagnosi di T. gondii nel maiale (Sus scrofa domesticus) che è anche la stessa specie del cinghiale (Sus scrofa scrofa ) (Dubey 1997; Dubey et al. 1995; Dubey et al 1997; Coelho et al., 2014).
Inoltre, tra tutti i test sierologici disponibili, il MAT è considerato il migliore per la determinazione di anticorpi anti-toxoplasma in animali anche con infezioni latenti (Dubey, 2010).
Il titolo 1:20 o 1:25 è stato validato per individuare IgG contro Toxoplasma gondii nel siero di maiali domestici (Dubey et al., 1995), anche se studi successivi (Richomme
et al., 2009) hanno tuttavia evidenziato che animali con titoli di agglutinazione più bassi di 1:25 presentassero cisti tissutali di T. gondii.
Questi risultati sollevano la questione della scelta del cut-off quando si interpretano test sierologici, soprattutto quando lavoriamo con i selvatici, usando test sviluppati per specie domestiche.
Richomme et al. 2009 sostiene la validità di una diluizione 1:6, come soglia biologica rilevante, dal momento che individui con titolo anticorpale 1:6 presentassero cisti tissutali, ma abbiamo preferito seguire Dubey el al. 1995, per evitare eventuali falsi positivi per il fenomeno di prozona.
PCR-RFLP
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una metodica di replicazione del DNA di un organismo attraverso l’amplificazione selettiva del DNA stesso.
Una singola copia del genoma, se presente nel campione diagnostico viene amplificato ottenendo milioni di copie ed il prodotto di amplificazione può essere poi messo in evidenza mediante elettroforesi.
La miscela di reazione contiene oltre al DNA del campione in esame (che potenzialmente contiene il segmento genomico bersaglio), due oligonucleotidi (primers) che si appaiano alle parti terminali opposte di ciascun filamento della sequenza bersaglio, desossinucleosidi trifosfati ed una DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi). La miscela di reazione è poi sottoposta a cicli di riscaldamento e raffreddamento per consentire la replicazione del DNA e così aumentare la quantità di DNA.
Le parti che andranno incontro a sintesi ed amplificazione saranno cioè solamente quelle che si appaieranno con gli oligonucleotidi specifici. Questa tecnica permette di rilevare tracce anche minime di acidi nucleici presenti in un campione e ciò gli conferisce grande specificità e sensibilità.
Nel nostro caso abbiamo effettuato la PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphysms) ovvero si utilizzano due frammenti di restrizione di lunghezza diversa, per la ricerca del DNA di T. gondii a partire da campioni di tessuto di diaframmi di cinghiale.
La nostra scelta è ricaduta sui campioni di diaframma in quanto risultano di facile reperibilità al momento della macellazione e poiché tale tessuto era già stato usato in maniera soddisfacente in precedenti studi inerenti la presenza di T. gondii effettuati nei cinghiali (Berger-Schoch et al.,2010), nei suini (Gajadhar et al., 1998), negli ovini (Da Silva e Langoni, 2001) e nei bovini (Dubey e Streitel , 1976).
I punti fondamentali per l’esecuzione della PCR sono:
- Estrazione del DNA;
- Amplificazione del DNA;
ESTRAZIONE DEL DNA
L’estrazione del DNA viene effettuata impiegando un kit commerciale (Tissue Genomic DNA Extraction kit - Fisher Molecular Biology®) che permette la distruzione delle cellule e dei nuclei, la precipitazione delle proteine e quindi la purificazione del DNA.
La procedura varia in base al tipo di tessuto che vogliamo analizzare. Nel nostro caso:
Step 1: dissociazione dei tessuti
- Porre circa 25mg di tessuto dei diaframmi, finemente tagliato in 4 pezzetti, in provette Eppendorf da 1,5ml;
- Aggiungere 200µl di tripsina, omogeneizzare con un micropestello avendo cura che il tessuto rimanga completamente sotto la tripsina, e lasciare il tutto in termostato a 37°C fino alla completa digestione del tessuto (in genere lasciamo i campioni in termostato overnight);
- Aggiungere 200 µl di Buffer FSTG1 e omogeneizzare ulteriormente il campione di tessuto con un micropestello.
Step 2: lisi
- Aggiungere 20 µl di Proteinasi K e passare il campione al vortex finché non si ottiene una buona omogeneizzazione;
- Lasciare incubare a 60°C finché il tessuto risulta completamente lisato. Generalmente 1 ora è sufficiente ma il tempo è variabile a seconda del tipo di tessuto del campione;
- Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce eventualmente presenti sul coperchio;
- Aggiungere 200 µl di Buffer FSTG2 e mescolare con l’uso del vortex. Lasciare incubare a 70°C per 10 minuti;
- Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce eventualmente presenti sul coperchio;
- In caso di presenza di materiale insolubile centrifugare a velocità massima per 2 minuti e trasferire il supernatante in una nuova provetta.
Step 3 : binding DNA
- Aggiungere 200 µl di etanolo al 100% e mescolare con il vortex;
- Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce eventualmente presenti sul coperchio;
- Porre una FSTG Mini Column in un Collection Tube e trasferire con cura tutto il lisato nella FSTG Mini Column. Centrifugare per 1 minuto a fondo scala;
- Smontare le FSTG Mini Column e porle su nuovi Collection Tube eliminando il centrifugato in appositi contenitori di raccolta.
Step 4 : lavaggio
- Lavare le FSTG Mini Column con 500 µl di Buffer W1 e centrifugare per 1 minuto;
- Smontare le FSTG Mini Column e porle su nuovi Collection Tube eliminando il centrifugato in appositi contenitori di raccolta;
- Lavare le FSTG Mini Column con 750 µl di Wash Buffer e centrifugare per 1 minuto;
- Smontare le FSTG Mini Column e porle su nuovi Collection Tube eliminando il centrifugato in appositi contenitori di raccolta;
- Centrifugare per ulteriori 3 minuti per asciugare le colonne ed eliminare residui di etanolo eventualmente rimasti.
Step 5: elution DNA
- Smontare le FSTG Mini Column e porle in Eppendorf da 1,5 ml;
- Aggiungere 100µl di Elution Buffer al centro della membrana della FSTG Mini Column e lasciare per 3 minuti;
- Centrifugare per 2 minuti;
- Conservare le provette in conlùògelatore a -20°C o al massimo a +4°C.
AMPLIFICAZIONE DEL DNA
Per l’amplificazione del DNA dell’agente eziologico che intendiamo identificare devono essere aggiunti oligonucleotidi, Taq-polimerasi e primers specifici per T. gondii.
Nel nostro caso procediamo con una PCR-NESTED, ovvero procediamo in due fasi e dopo un primo ciclo di amplificazione ne viene effettuato un altro, utilizzando un secondo set di primers all’interno del segmento genomico amplificato dal primo set di primers con il fine di aumentare sensibilità e specificità della nostra analisi e utile soprattutto quando le quantità di copie di genoma da amplificare nei campioni sono scarse.
I primers che ci saranno necessari sono quindi 4 :
- B1 out F (GGA ACT GCA TCC GTT CAT GAG) e B1 out R (TCT TTA AAG CGT TCG TGG TC) costituiti da 193pb e usati nel primo ciclo di amplificazione.
- B1 in F (TGC ATA GGT TGC AGT CAC TG) e B1 in R ( GGC GAC CAA TCT GCG AAT ACA CC) costituiti da 96pb e usati nel secondo ciclo di amplificazione.
Tutte le operazioni connesse con l’amplificazione del DNA devono essere effettuate sotto cappa a flusso laminare al fine di evitare fonti di contaminazione che potrebbero falsare i risultati ottenuti.
Il primo passo consiste nella preparazione dei reagenti :
- 10 µl di Master Mix (costituita da Taq-polimerasi e da basi nucleotidiche ad una concentrazione standard);
- 3 µl di acqua sterile;
- 1,5 µl di primer B1 out F;
- 1,5 µl di primer B1 out R.
Calcoliamo la quantità totale di reagenti che ci è necessaria per saggiare tutti i nostri campioni, considerando anche i campioni di controllo positivo e negativo.
Poniamo quindi in ogni Eppendorf 16 µl di soluzione alla quale si aggiungono 4 µl di DNA che avevamo in precedenza estratto (per un totale di 20 µl in ogni Eppendorf).
Nel campione di controllo positivo aggiungiamo il DNA di un campione già testato e risultato positivo, mentre per il campione di controllo negativo viene aggiunta acqua senza nucleasi.
Una volta pronti tutti i campioni viene eseguito il programma nel termociclatore, dove viene eseguita una sequenza di passaggi termici per 25 volte in successione.
Le temperature e i cicli sono variabili a seconda del DNA con cui stiamo lavorando.
- Passaggio 1: Denaturazione del DNA, ovvero separazione delle due eliche del DNA bersaglio, ottenuta alla temperatura di 94°C (temperatura di denaturazione o denaturation);
- Passaggio 2: il termociclatore scende alla temperatura di 57°C, alla quale avviene l’appaiamento o annealing, ovvero si rende possibile l’appaiamento dei primers di T. gondii con una delle due eliche del DNA bersaglio;
- Passaggio 3: il termociclatore risale alla temperatura di 72°C, alla quale avviene l’estensione o elongation, ovvero a tale temperatura la Taq-polimerasi è in grado di attaccarsi, dando l’avvio alla reazione, che avviene in contemporanea su entrambe le eliche.
Il processo ha una durata di circa due ore e porta alla produzione di numerose copie di DNA bersaglio.
A questo punto, dopo il primo ciclo di amplificazione, procediamo con il secondo, usando il DNA amplificato del primo ciclo, con il fine di aumentare la sensibilità e la specificità della nostra analisi.
Procediamo come nello step precedente preparando i reagenti :
- 10 µl di Master Mix (costituita da Taq-polimerasi e da basi nucleotidiche ad una concentrazione standard);
- 1,5 µl di primer B1 in F;
- 1,5 µl di primer B1 in R.
Poniamo quindi in ogni Eppendorf 18 µl di soluzione alla quale si aggiungono 2 µl di DNA che avevamo in precedenza amplificato (per un totale di 20 µl in ogni Eppendorf).
Una volta pronti tutti i campioni viene eseguito il programma nel termociclatore, dove viene eseguita una sequenza di passaggi termici per 40 volte in successione.
- Passaggio 1: Denaturazione del DNA, ovvero separazione delle due eliche del DNA bersaglio, ottenuta alla temperatura di 94°C (temperatura di denaturazione o denaturation);
- Passaggio 2: il termociclatore scende alla temperatura di 62,5°C, alla quale avviene l’appaiamento o annealing, ovvero si rende possibile l’appaiamento dei primers di T. gondii con una delle due eliche del DNA bersaglio;
- Passaggio 3: il termociclatore risale alla temperatura di 72°C,alla quale avviene l’estensione o elongation, ovvero a tale temperatura la Taq-polimerasi è in grado di attaccarsi, dando l’avvio alla reazione che avviene in contemporanea su entrambe le eliche.
ELETTROFORESI
Il prodotto della nostra amplificazione viene infine messo in evidenza mediante elettroforesi.
In primo luogo dobbiamo preparare il gel di agarosio di dimensioni adeguate al numero di campioni da saggiare. Nel nostro caso utilizziamo solo metà del lettino, in quanto usiamo solo un numero esiguo di campioni per volta.
Utilizziamo un gel al 3% di agarosio, perciò pesiamo 1,5g di agarosio da sciogliere in 50 ml di tampone. La soluzione ricavata è posta in una beuta e passata per 2 minuti nel forno a microonde, in modo tale da raggiungere il completo scioglimento dell’agarosio ed ottenere una soluzione perfettamente omogenea.
Quando il gel è ben sciolto, sotto cappa chimica, si aggiungono 15 µl di GelRed® per ogni 100ml di gel. Il GelRed® è un chelante del DNA che permette la reazione luminosa alla luce ultravioletta, quando si visiona il tracciato elettroforetico al trans- illuminatore.
Mescoliamo delicatamente il gel per amalgamare il chelante e sistemiamo il pettine sul lettino per creare i pozzetti una volta versato il gel. Aspettiamo quindi circa 15 minuti che il gel sia del tutto solidificato, rimuoviamo il pettine e possiamo porre il lettino immerso nel tampone nella vasca dell’elettroforesi.
Dobbiamo quindi inserire il nostro DNA amplificato all’interno di ciascun pozzetto. In prima posizione viene collocato il Ladder che al momento dell’osservazione al trans- illuminatore ci indica il numero di paia basi del DNA che stiamo analizzando, così da poter identificare quali sono i campioni positivi. Nel secondo e terzo pozzetto inseriremo i campioni di controllo positivo e negativo.
Una volta caricati tutti i DNA nei rispettivi pozzetti, lasciamo che avvenga la corsa nella cella elettroforetica applicando un voltaggio di 100V per 30 minuti.
Ultimata la corsa, togliamo il lettino dalla cella elettroforetica e lo esaminiamo sotto il trans-illuminatore, che grazie alla luce ultravioletta, ci permette di vedere le bande del DNA. I valori positivi sono solamente quelli che si illuminano alla stessa altezza del Ladder, mentre i valori sia più alti che più bassi sono da considerarsi negativi.
ANALISI STATISTICHE
Tutte le analisi statistiche sono state fatte comparando i dati tramite il test del Chi- quadro (Χ2). A questo proposito è stato usato QuickCalcs della GraphPad Software.
7 RISULTATI
All’esame coprologico complessivamente 39 soggetti su 50 (78%) sono risultati positivi per parassiti. L’endoparassita registrato con maggiore frequenza è stato Metastrongylus spp. con uova riscontrate in 28 dei 50 campioni (56% sul totale; 71,8% sui soggetti parassitati). Seguono gli strongili intestinali (dal nostro esame non siamo stati in grado di distinguere la specie cui appartenevano le uova denominate genericamente di strongili intestinali) con 11 casi (22%; 28,2%), Ascaris suum con 6 casi (12% ; 15,4%), coccidi, apparentemente appartenenti al genere Eimeria, con 5 casi (10%; 12,8%) e Trichuris suis in 3 casi (6%; 7,7% ).
Tabella 1 ‐ Prevalenza di infezione parassitaria all'esame coprologico, relativa al sesso e all'età dell'ospite Parassita Prevalenza totale n=50 Prevalenza maschi n=32 Prevalenza femmine n=18 Prevalenza <1 anno n=17 Prevalenza >1 anno n=33 Metastrongylus spp. 56% ( n.28) 56,25% (n.18) 55,6% (n.10) 82,35% (n.14) 33,3% (n.11) Strongili 22% (n.11) 25% (n.8) 16,7% (n.3) 5,9% (n.1) 30,3% (n.10) Ascaris suum 12% (n.6) 18,7% (n.6) 0% (n.0) 11,8% (n.2) 12,1% (n.4) Coccidi 10% (n.5) 9,4% (n.3) 11,1% (n.2) 0% (n.0) 15,5% (n.5) Trichuris suis 6% (n.3) 9,4% (n.3) 0% (n.0) 0% (n.0) 6% (n.3)
Tabella 2 ‐ Comparazione delle prevalenze tra maschi e femmine e tra soggetti adulti e giovani
Parassita Maschi / Femmine < 1 anno / > 1 anno
Metastrongylus spp. X 2 = 0,0020 p-value = 0,9621 X2 = 10,7840 p-value = 0,0010 Strongili X2 = 0,4660 p-value = 0,4947 X2 = 3,8990 p-value = 0,0486 Ascaris suum X 2 = 3,8350 p-value = 0,0502 X2 = 0,0010 p-value = 0,9707 Coccidi X 2 = 0,0390 p-value = 0,8443 X2 = 2,8620 p-value = 0,0907 Trichuris suis X2 = 1,7950 p-value = 0,183 X2 = 1,6440 p-value = 0,1998
In alcuni casi è stata osservata l’associazione di due parassitosi: in 4 casi (8%) si è rilevata l’associazione Metastrongylus spp./strongili intestinali; in 3 casi (6%) Metastrongylus spp./coccidi, in due casi Metastrongylus spp./A. suum (4%) e in un caso ciascuno T. suis/A. suum, A. suum/strongili intestinali, coccidi/strongili intestinali (2 % ciascuno).
In un solo caso, in un soggetto di giovane età, si è osservata l’associazione di tre parassiti: Metastrongylus spp./coccidi /strongili intestinali (2%).
Tabella 3 ‐ Occorrenza di infezioni multiple rilevate all'esame coprologico
Parassiti N/n %
Metastrongylus spp. / Strongili intestinali 4/50 8%
Metastrongylus spp . / Coccidi 3/50 6%
Metastrongylus spp. / A. suum 2/50 4%
T. suis / A. suum 1/50 2%
A. suum / Strongili intestinali 1/50 2%
Coccidi / Strongili intestinali 1/50 2%
Metastrongylus spp . / Coccidi / Strongili intestinali 1/50 2%
Delle 18 femmine prese in esame, 13 (72,2%) sono risultate positive al test coprologico, mentre per quanto riguarda i soggetti di sesso maschile, dei 32 soggetti presi in esame, 28 (87,5%) sono risultati positivi per la presenza di endoparassiti.
Dei 33 soggetti di età superiore ad un anno, 24 (72,2%) sono risultati positivi, mentre dei 17 soggetti sotto l’anno di età, sono risultati positivi in 15 (88,2%).
All’esame per la ricerca macroscopica di parassiti nell’intestino tenue, 3 soggetti su 32 (9,37%) sono risultati positivi per Macracanthorynchus hirudinaceus e 2 soggetti su 32 (6,25%) per Ascaris suum.
Gli A. suum sono stati ritrovati nell’intestino di due soggetti di sesso maschile adulti, mentre M. hirudinaceus sono stati ritrovati in due maschi sotto l’ anno di età e in una femmina adulta
Tabella 4 ‐ Prevalenza dei parassiti reperiti nell'intestino tenue Parassita Prevalenza totale n=32 Prevalenza maschi n=20 Prevalenza femmine n=12 Prevalenza <1 anno n=10 Prevalenza >1 anno n=22 Macracanthorynchus hirudinaceus 9,37% (n.3) 10% (n.2) 8,3% (n.1) 20% (n.2) 4,5% (n.1) Ascaris suum. 6,25 % (n.2) 10% (n.2) 0% (n.0) 0% (n.0) 9,1% (n.2) Tabella 5 ‐ Comparazione delle prevalenze tra maschi e femmine e tra giovani e adulti
Parassita Maschi / Femmine < 1 anno / > 1 anno
Macracanthorynchus hirudinaceus X2 = 0,0250 p-value = 0,8756 X2 =1,0820 p-value = 0,2982 Ascaris suum. Χ2= 1,2800 p-value = 0,2579 X2 = 0,4040 p-value = 0,5251
Figgura 1 ‐ Uov Figura 2 ‐ vo di Metas Uovo di As strongylus s caris suum, spp., x 100. , x 100. Dim Dimension mensioni uo ni uovo: 45‐ ovo: 50‐75 x ‐57 x 38‐41 x 45‐50 µm µm
Figgura 3 ‐ Uov Figura 4 ‐ vo di Strong Uovo di Tri gilo intestin ichuris suis, nale, x 100. , x 100. Dim Dimension mensioni uo i uovo: 73‐8 ovo: 50‐60 x 89 x 34‐45 x 21‐25 µm µm
Figu Figura 5 ‐ O ura 6 ‐ Sogg Oocisti di Co getti adulti d occidi, x 100 di Ascaris su 0 uum
Figura Figu 8 ‐ Particol munita ra 7 ‐ Sogge lare dell'est a di uncini r etto adulto tremità cefa ricurvi. Imm di Macraca alica di M. magine ripre anthorynch hirudinaceu esa con lo s hus hirudina us: si ricono stereomicro aceus osce la prob oscopio boscide
Figura probo Per qu (12,2%) s avevano u Tabella 6 G Maschi Femmine < 1 anno > 1 anno 9 ‐ Altro pa oscide mun uanto conce sono risulta un titolo di