3.1 Sostanze chimiche
Il salbutamolo e un farmaco β2-agonista ad azione rilasciante sulla
muscolatura liscia bronchiale che appartiene alla categoria dei farmaci
β2-agonisti short acting, poiché produce un’azione rapida ma di breve
durata (circa tre ore). Il salbutamolo (Sigma Aldrich), è stato pesato e
disciolto in tampone fosfato (PBS; Sigma Aldrich) per formare una
soluzione madre 1 mM, che poi e stata successivamente diluita con
mezzo di coltura RPMI1640 senza fattori di crescita, per ottenere le
concentrazioni da saggiare (1 μM e 10μM).
Il composto 8-pCPT-2′-O-Me-cAMP è un attivatore selettivo della
proteina Epac. La sostituzione con il gruppo metilico in posizione 2’
dello zucchero ribosio conferisce a questa molecola un’elevata
specificità nei confronti di Epac e la rende particolarmente utile come
tool farmacologico per lo studio dei meccanismi molecolari cAMP-
mediati, indipendenti dalla proteina PKA (Grandoch et al., 2010). 8-
pCPT-2′-O-Me-cAMP è stato pesato e disciolto in tampone fosfato
(soluzione madre 10 mM). Le concentrazioni da saggiare (100 e 500
Figura 12 Struttura chimica del composto 8-pCPT-2′-O-Me-cAMP
3.2 Linea cellulare
Le cellule muscolari lisce bronchiali umane utilizzate in questa ricerca,
sono state acquistate da Lonza, (Walkersville, MD, USA). Il terreno di
coltura, ottimizzato per questa linea cellulare (SmGM™-2 BulletKit™),
era costituito da siero fetale bovino al 5% e fattori di crescita (es. FGF e
EGF), al quale veniva aggiunta una miscela 1:1 degli antibiotici
penicillina (5 UI/ml) e streptomicina (5 µg/ml) all’1%.
Questa linea cellulare è stata isolata dai bronchi principali di tessuti
normali e acquistate al secondo passaggio. È comunemente impiegata
per studi in vitro riguardanti malattie respiratorie croniche quali asma
micoplasmi, batteri o virus (HIV-1, epatite B e C). Le cellule crescono
in adesione hanno un tempo di duplicazione di circa 24 ore. Da un
punto di vista morfologico presentano forma irregolare affusolata.
Figura 13 Fotomicrografia della linea cellulare BSMC
Il mantenimento delle cellule è stato realizzato in fiasche T75 ad una
temperatura costante di 37 °C, in atmosfera controllata al 5% di CO2.
Le cellule sono state controllate quotidianamente e il mezzo di coltura
è stato sostituito quando necessario.
Per la conservazione della linea cellulare a lungo termine è stato
utilizzato un mezzo di congelamento ottenuto aggiungendo al mezzo
state poste per circa 24-48 ore a una temperatura di -80°C e in seguito
conservate in azoto liquido.
3.3 Immunocitochimica
La valutazione della RhoA è stata effettuata mediante
immunocitochimica, grazie alla peculiarità di questa proteina di
migrare da un compartimento cellulare ad un altro a seguito di una
stimolazione. In particolare, nello stato inattivo, Rho A è situata nel
citosol mentre, quando attivata, essa si localizza sulla membrana
citoplasmatica. Per l’analisi, Le cellule sono state raccolte, centrifugate
su vetrini e fissate in formalina all’1% per 1 minuti a 4°C. Allo scopo
di evidenziare i siti antigenici, i campioni sono stati successivamente
trattati per 10 minuti con Triton X-100 in tampone citrato e incubati
per 15 minuti con una soluzione di perossido di idrogeno allo 0,6% e
metanolo per bloccare l’attività delle perossidasi endogene. Dopo
trattamento per 20 minuti a 37°C in siero di suino (per saturare i siti
antigenici aspecifici), i campioni sono stati incubati overnight a 4°C con
l’anticorpo primario policlonale di coniglio diretto verso RhoA.
policlonale secondario biotinilato, un complesso streptavidina-
perossidasi e 3,3-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) contenente
H2O2, produceva una colorazione marrone. I campioni sono stati
sottoposti a controcolorazione con ematossilina e quindi disidratati in
etanolo e successivi passaggi in xilolo per il montaggio con balsamo
DPX Mountant.
3.4 ELISA
Per l’analisi quantitativa dell’attivazione della proteina RhoA è stato
impiegato il kit “G-LISA TM RhoA activation Assay” (Cytoskeleton).
Le cellule sono state lisate e il campione risultante è stato utilizzato, in
parte, per effettuare la quantificazione proteica con saggio Bradford.
La parte restante è stata congelata in azoto liquido e mantenuta in
frigo a -80°C fino al momento dell’analisi. I lisati sono stati scongelati e
diluiti con buffer di lisi, ad una concentrazione proteica nell’intervallo
0,4-2 mg/ml. Venticinque µl di tali lisati sono stati successivamente
incubati per 30 minuti a 4°C in una piastra da 96 pozzetti ad alta
affinità per RhoA attivo (RhoA-GTP). Per ogni esperimento sono stati
proteina in grado di legare RhoA nella sua forma attiva, ed un
controllo negativo, contenente soltanto buffer di lisi. Dopo 2 passaggi
in tampone di lavaggio i campioni sono stati incubati per 2 minuti con
uno smascherante antigenico e per 45 minuti a temperatura ambiente
con una soluzione contenente l’anticorpo primario anti-RhoA. Sono
stati poi effettuati 2 lavaggi consecutivi e i campioni sono stati incubati
per altri 45 minuti a temperatura ambiente con una soluzione
contenente l’anticorpo secondario marcato con perossidasi. Dopo altri
3 lavaggi, i campioni sono stati trattati per 15 minuti a 37°C con la
soluzione di rivelazione. Immediatamente dopo il blocco della
reazione con tampone specifico, il grado di reattività è stato valutato
misurando l’assorbanza a 490 nm con uno spettrofotometro per
micropiastre (VICTOR, Wallack).
3.5 Analisi dei risultati e statistica
I risultati sono stati espressi come valori medi ± errore standard della
media (S.E.M.) e graficati mediante GraphPad Software. L’analisi
statistica è stata realizzata mediante analisi della varianza (ANOVA)
4. RISULTATI
La finalità di questo lavoro di tesi era indagare il ruolo della proteina
RhoA nel meccanismo d’azione del farmaco salbutamolo in cellule
della muscolatura liscia bronchiale umana. A tale scopo sono stati
effettuati esperimenti utilizzando due diversi metodi di analisi,
immunocitochimica e immunoenzimatica, con i quali abbiamo
valutato il grado di attivazione della proteina RhoA, in presenza o
assenza di salbutamolo o dell’ attivatore selettivo Epac, 8-pCPT-2ˈ-O-
Me-cAMP.
L’analisi immunocitochimica utilizza anticorpi anti-RhoA e
l’attivazione della proteina viene valutata in termini di traslocazione
dal citosol alla membrana cellulare. Infatti, RhoA, per essere attivata,
deve necessariamente ancorarsi al doppio strato fosfolipidico della
plasmacellula tramite gruppi isoprenoidi: in questa posizione, grazie
alla sua attività GTPasica, RhoA riesce ad attivare segnali a valle che
modulano i suoi effetti biologici sulla muscolatura liscia delle vie
respiratorie, che consistono nell’aumento della sensibilità a stimoli
Come possiamo osservare nella figura 14a, le cellule di controllo sono
caratterizzate da un’alta espressione della proteina RhoA, che si trova
localizzata quasi esclusivamente nel citoplasma (come evidenziato
meglio nel riquadro piccolo). L’abbondanza di RhoA nelle cellule
muscolari lisce bronchiali umane, sottolinea l’importanza funzionale
di questa proteina in questo tessuto e la necessità di capire meglio il
suo ruolo nel meccanismo d’azione di farmaci comunemente impiegati
nel trattamento delle malattie respiratorie croniche.
SFM +Calpeptina +Sal 1 µM for 24 h +Calpeptina +Calpeptina +Sal 10 µM for 15’ a b c d
La stimolazione delle cellule muscolari lisce umane da parte della
calpeptina, promuove la traslocazione di RhoA dal citosol alla
membrana cellulare: tale spostamento è evidenziato dalla più netta
demarcazione dei contorni cellulari rispetto alle cellule di controllo
(Figura 14b). Il trattamento acuto delle cellule muscolari lisce stimolate
con calpeptina, con salbutamolo alla concentrazione 10 µM per 15
minuti, bloccando la delocalizzazione di RhoA verso la membrana
cellulare, ne impedisce l’attivazione, come dimostra l’immagine della
Figura 14c (simile a quella osservata per le cellule di controllo).
Il trattamento cronico con salbutamolo 1 µM per 24 ore, invece ha un
effetto minore rispetto al trattamento acuto con lo stesso farmaco.
Questa differenza tra le due modalità di trattamento è verosimilmente
ascrivibile alla desensibilizzazione omologa del recettore β2
adrenergico indotta nelle cellule muscolari liscie dall’esposizione
prolungata al β2 agonista che attenua l’azione inibitoria del
salbutamolo sull’attivazione di RhoA (Figura 14d).
Dai risultati ottenuti, possiamo inoltre constatare che la
completamente l’effetto indotto dal trattamento acuto con
salbutamolo. Questo risultato, probabilmente si spiega considerando
che le cellule muscolari lisce umane delle vie respiratorie presentano
un’ampia riserva di recettori β2 adrenergici che le protegge, almeno in
parte, dall’azione desensibilizzante indotta dal farmaco [20].
Allo scopo di quantificare l’effetto del salbutamolo sull’attivazione
della proteina RhoA è stato eseguito un saggio ELISA. Come possiamo
vedere nella figura 15,la presenza di calpeptina determina un aumento
marcato dell’attivazione di RhoA ( circa 5 volte rispetto alle cellule di
controllo). SFM CALP +SA L 10 mM 1 5' +SA L 1 mM 2 4h 0 100 200 300 400 500 600 *
Figura 2. Analisi ELISA dell'attivazione della proteina RhoA in presenza o in assenza di salbutamolo in cellule muscolari lisce bronchiali umane. SFM: serum-free medium; Sal: salbutamolo. *p<0,05.
R h o A a c ti v it y (% , o v e r u n s ti m u la te d c e ll s )
Figura 15 Analisi ELiSA dell’attivazione della proteina RhoA in presenza o in assenza di salbutamolo in cellule muscolari lisce bronchiali umane. SFM: serum free medium ; Sal: salbutamolo ;* p<0,05 .
Il trattamento acuto con salbutamolo 10 µM per 15 minuti determina
una riduzione significativa (p< , 5) dell’attivazione di RhoA indotta
dalla calpeptina, di circa il 30% (Figura 15).
Come precedentemente osservato in immunoistochimica, il
trattamento cronico con salbutamolo (1µM per 24 ore), riduce
parzialmente l’effetto inibitorio dello stesso farmaco sull’attivazione di
RhoA.
Per indagare meglio il meccanismo d’azione molecolare del
salbutamolo, sono stati effettuati esperimenti utilizzando un attivatore
selettivo della proteina Epac, una proteina coinvolta nei meccanismi di
trasduzione delle vie mediate dal cAMP. La figura 16 mostra i risultati
di esperimenti effettuati in immunocitochimica che evidenziano come
il composto 8-pCPT-2ˈ-O-Me-cAMP sia in grado di riprodurre gli
Anche in questo esperimento si evidenzia la delocalizzazione di RhoA
indotta dalla calpeptina (Figura 16b). Le cellule stesse sono state poi
incubate per 15 minuti con l’attivatore Epac alle concentrazioni 500 µM
e 100 µM, rispettivamente (figura 16c e 16d). Questo trattamento ha
prodotto una marcata inibizione dell’attivazione della proteina RhoA,
in modo indipendente dalla concentrazione saggiata.
SFM +Calpeptin
+Calpeptin
+EPAC 500 µM +Calpeptina +EPAC 100 µM
Figura 3. Analisi immunocitochimica dell’attivazione della proteina RhoA in presenza o in assenza di 8-pCPT-2'-O- Me-cAMP (attivatore Epac) in cellule muscolari lisce bronchiali umane. SFM: serum-free medium.
a b
c d
Figura 16 Analisi immunocitochimica dell'attivazione della proteina RhoA in presenza o in assenza del composto 8-pCPT-2'-O-Me- cAMP(attivatore Epac) in cellule muscolari liscie bronchiali umane. SFM:serum free medium.
La valutazione quantitativa dell’effetto dell’attivatore Epac, effettuata
mediante saggio ELISA, ha confermato i dati prodotti in
immunocitochimica.
Il composto 8-pCPT-2ˈ-O-Me-cAMP è in grado, quindi, di inibire
l’attivazione di RhoA indotta dalla calpeptina, a livelli paragonabili a
quelli prodotti dal trattamento con salbutamolo.
SFM CALP +Epa c 10 0 m M +Epa c 50 0 m M 0 100 200 300 400 500 * *
Figura 4. Analisi ELISA dell'attivazione della proteina RhoA in presenza o in assenza del composto 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP (attivatore Epac) in cellule muscolari lisce umane. SFM: serum-free medium. *p<0,05 R h o A a c tiv ity (% , o v e r u n s tim u la te d c e lls )
Figura 17 Analisi ELiSA dell’attivazione della proteina RhoA in presenza o in assenza del composto 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP in cellule muscolari lisce bronchiali umane. SFM: serum free medium;* p<0,05 .
5. CONCLUSIONI
I risultati di questa tesi di laurea dimostrano che:
(i) il salbutamolo inibisce l’attivazione della proteina RhoA in
cellule muscolari lisce bronchiali umane mediante la via β2-
AR/Epac;
(ii) la desensibilizzazione omologa del recettore β2 adrenergico
può attenuare tale effetto.
Nonostante la natura preliminare di questi esperimenti, i risultati di
questo studio hanno importanti implicazioni farmacologiche
indicando il possibile ruolo di RhoA nel meccanismo molecolare
responsabile degli effetti del salbutamolo sul controllo della
6.
BIBLIOGRAFIA
1. Ministero della Salute ,direzione generale del sistema informativo:"Relazione sullo stato sanitario del Paese 2005- 2006",www.salute.gov.it, 2008;
2. Janssen L. J. e Killian K. : "Airway smooth muscle as a target of asthma therapy : history and new directions", Respiratory Research 7:123-135, 2006;
3. Matsui T., Amano M., Yamamoto T., Chihara K., Nakafuku M., Nakano T., Okawa K., Iwamatsu A., Kaibuchi K. : "Rho- associated kinase, a novel serine/threonine kinase as a putative target for small GTP binding protein Rho". EMBO J. 15(9): 2208- 16, 1996;
4. Schaafsma D. , Gosen R., Zaagsma J., Halayko A.J., Meurs H. :"Rho kinase inhibitors : A novel therapeutical intervention in asthma?" European Journal of Pharmacology 585, 398-406, 2008; 5. Chiba Y. e Misawa M. : "The role of RhoA-mediated Ca2+
sensitization of bronchial smooth muscle contraction in airway hyperresponsiveness". J. Smooth Muscle Res. 40, 155-167, 2004; 6. Pasqualino A., Panattoni G.L. "Anatomia
Umana,citologia,istologia,embriologia ,anatomia sistematica" UTET , Torino, 2002;
7. Chiba Y., Arima J., Sakai H., Misawa M. :"Lovastatin inhibits bronchial hyperresponsiveness by reducing RhoA signaling in rat allergic asthma". Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:705-713, 2008 ;
8. Kume H. : "RhoA/Rho-kinasi as a Therapeutic Target in Asthma". Current Medicinal Chemistry, 15: 2876-2885, 2008;
9. De Godoy M., Rattan S. : "Role of Rho-kinase in the functional and dysfunctional tonic smooth muscles" , Trends in Pharmacological Sciences 32, 384-392, 2011;
10. Katzung ;" Farmacologia generale e clinica " 6° edizione in lingua italiana sulla 9° in lingua inglese a cura di Paolo Preziosi, PICCIN Ed., Padova, 2006;
11. Grandoch M., Roscioni S.S., Schmidt M. : "The role of Epac proteins, novel cAMP mediators, in the regulation of immune, lung and neuronal function". British Journal of Pharmacology 159,265-284, 2010;
12. Berne R. M.,Levy M.N. :"Principi di fisiologia ". Terza edizione, Casa Editrice Ambrosiana,Milano,2002 ;
13. Sapientemente.blogspot.com "biosintesi del colesterolo: le Quattro tappe del processo e la sua regolazione";
14. Williams e Lemke "Foye’s principi di chimica farmaceutica", IV Edizione italiana condotta sulla V americana a cura di : Dall’Acqua ,Caffieri.,PICCIN Ed., Padova, 2 5;
15. Pontieri G.M.,Russo M.A., Frati L. : "Patologia generale "Tomo II , III edizione, PICCIN Ed., Padova,2005 ;
16. Niiro N., Nishimura j., Sakihara C., Nakano H., Kanaide H: "Up regulation of RhoA and Rho-kinase mRNAs in the rat myometrium during prenancy". Biochem. Biophys Res. Commun. 230:356-359, 1997;
17. Wjocialk-Stothard B. : "New drug targets for pulmonary hypertension : Rho GTPases in pulmonary vascular remodelling". Postgrad Med J. 84: 348-53, 2008;
18. Beavo J.A., Brunton LL., "Cyclic nucleotide research—still expanding after half a century". Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3:710-8, 2002;
19. Cario-Toumaniantz C., Reillaudoux G., Sauzeau V., Heutte F., Vaillant N., Finet M., Chardin P., Loirand G., Pacaud P.: "Modulation of RhoA-Rho kinase-mediated Ca2+ sensitization of rabbit myometrium during pregnancy-role of Rnd3" . J.Physiol. (Lond.) 552:403-413, 2003;
20. Giembycz MA: "An estimation of beta 2-adrenoceptor reserve on human bronchial smooth muscle for some symphatomimetic bronchodilators". Br. J. Pharmacol. 159: 287-99, 2009;
Glossario
MLCK : kinasi della catena leggera della miosina Ca2+/Calmudulina dipendente;
IP3:inositolo trifosfato; DAG : diacilglicerolo;
GAPS:proteina attivante l’enzima GTPasi;
GEFs: fattore di scambio del nucleotide guanilico;
GDIs:inibitore della dissociazione del nucleotide della guanidina; MYPT1:myosin phosphatase targeting subunit 1;
IAS:sfintere anale interno;
LES: sfintere esofageo inferiore;
VSMC: cellule della muscolatura liscia vascolare; ROCK: Rho kinasi;
MLCP:fosfatasi della catena leggera della miosina; PKA:proteina kinasi A;
Epac:fattore di scambio del nucleotide guanilinico per piccole GTPasi Ras-like;
cAMP:adenosina monofosfato ciclica; PDEs: cAMP fosfodiesterasi;
AC: adenilato ciclasi; PLC: fosfolipasi C; PLD: fosfolipasi D;
Ringraziamenti
Ringrazio tutti coloro che mi hanno sostenuta e sopportata in questi anni.
Ringrazio la Prof.ssa Breschi e il dott. Fogli per avermi fatto da guida in questo ultimo passo finale.
Ringrazio la mia Famiglia per avermi permesso di studiare e per non avermi mai fatto mancare il suo sostegno.
Ringrazio Fabio e Barbara per i loro preziosi consigli e la loro amicizia,senza di loro non sarebbe stato lo stesso.
Ringrazio Alessia,Elena ,Francesca,Sara e Rosi ,splendide compagne di viaggio,per il meraviglioso tempo trascorso insieme .
Ringrazio tutti coloro che ruotano intorno al "nostro" laboratorio,per avermi aperto le porte di un mondo eccezionale : la ricerca.
Ringrazio Deborah,che mi sopporta da anni ed ha vissuto con me quest’avventura dall’inizio nei momenti belli e in quelli meno piacevoli.
Ringrazio Lucia che da Parigi non mi ha mai fatto mancare il suo supporto.
Ringrazio Serena per avermi sostenuta sempre.
Ringrazio tutti gli amici ,in particolare Sara e Rossella, che hanno condiviso con me le mie gioie e le mie preoccupazioni.