Popolazione studiata
Per questo studio sono stati utilizzati 8 esemplari di topi SAMP8 e 5 di controlli negativi SAMR1.
Sono stati divisi in 3 gruppi:
Gruppo 1: 5 esemplari di SAMR1 come controllo non patologico Gruppo 2: 4 esemplari di SAMP8 come controllo patologico Gruppo 3: 4 esemplari di SAMP8 trattati con Donepezil
Trattamento
Il trattamento con Donepezil nel gruppo 3 è durato 8 settimane (da 4 fino ai 6 mesi di età) ed è stato effettuato tramite sonda intragastrica (gavage) in dosi di 5mg/kg/ die.
Gli esemplari di tutti i gruppi sono stati sacrificati all’età di 6 mesi.
Preparazione delle piccole arterie ed esperimenti funzionali
Sono stati prelevati gli intestini dei soggetti e conservati per breve tempo in una soluzione di Krebs (mM: NaHCO3 25.0; Glucosio 5.5; NaCl 120.0; KCL 4.7; CaCl2 2.5; EDTA 0.026; KH2PO4 1.18) a 4°C per mantenerne la vitalità.
Sono stati posizionati in una piastra di Petri all’interno della quale, tramite ausilio di microscopio ottico bifocale e pinzette molto sottili, sono state isolate le arterie mesenteriche, liberandole anche dal grasso periavventiziale.
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Queste arterie sono state quindi posizionate in una apposita camera riscaldata a 37 °C contenente Krebs ed inserite e legate tramite un filo di seta alle due estremità di due microcannule di vetro.
Le microcannule devono essere posizionate in modo da risultare parallele al lume del vaso.
Il vaso è mantenuto vitale durante tutto l’esperimento da una soluzione di Krebs saturata di carbogeno (miscela contenente ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%) a un PH di 7.4 e a una temperatura fisiologica di 37 °C e che viene fatta passare all’interno del suo lume.
Per tutta la durata dell’esperimento viene mantenuta una pressione di 45mmHg. Con l’ausilio di un microscopio ottico e di una telecamera collegata al monitor del computer è stato possibile vedere ad occhio nudo e in diretta nel monitor la vasodilatazione o vasocostrizione dell’arteria isolata.
L’entità del movimento del vaso è stata calcolata direttamente dal programma Myoview ed espressa in micron.
Le sostanze da testare sono state infuse nel lato extraluminale dell’arteria tramite una pompa peristaltica a flusso costante (circa 4ml/min).
Prima di iniziare il trattamento con le sostanze in esame, una volta finito l’allestimento, è stata valutata la vitalità dell’arteria. A tale fine, l’arteria è stata trattata, tramite infusione extraluminale, con una soluzione contenente una elevata concentrazione di KCl (125mmol/L). Le arterie vengono considerate vitali se mostrano una riduzione del lume maggiore del 40%.
Una volta appurato che l’arteria allestita è vitale, è stata lavata per 30 minuti con Krebs e successivamente sono state effettuate misurazioni basali del lume e della parete del vaso.
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Attraverso l’incubazione con norepinefrina (1 μM per 4 minuti) viene indotta la vasocostrizione e viene di nuovo misurato il lume.
A questo punto vengono somministrate concentrazioni progressivamente crescenti di Ach (da 10-8 a 10-4 M) e per ogni step è stata valutata la risposta vasodilatatoria
mediante misurazione del lume.
Oltre a ciò, la risposta vasodilatante a concentrazioni crescenti di Ach è stata valutata anche dopo incubazione di 30’ con L-NAME (10-8mol/L).
In seguito a 30’ di lavaggio con il Krebs è stata utilizzata l’incubazione di 30’ con Acido Ascorbico (100mMol/L).
Come ultimo step, sempre previo lavaggio tramite Krebs, sono state incubate 30’ con una miscela di L-NAME e Acido Ascorbico.
L-NAME è un inibitore di eNOS e quindi va ad impedire la formazione di ossido nitrico e perciò dovrebbe indurre una riduzione della risposta vasodilatante all’Ach. L’Acido Ascorbico invece è un composto con proprietà antiossidanti e che dovrebbe in questo modo ridurre la quantità di stress ossidativo e quindi migliorare la risposta vasodilatante all’Ach.
Analisi dei dati
I dati ricavati per ogni gruppo sono stati analizzati tramite test ANOVA per misure ripetute. P < 0.05 è stata considerata statisticamente significativa.
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5. RISULTATI
Per tutte le 8 settimane di durata del trattamento con Donepezil i topi non hanno presentato alcun tipo di effetto collaterale, inoltre il gruppo trattato ha mostrato miglioramenti nel comportamento visibili alla semplice osservazione (dati non disponibili).
Il gruppo degli esemplari SAMR 1 presenta una normale risposta vasodilatante alla somministrazione di concentrazioni crescenti di Ach, con il diametro del vaso che progressivamente ritorna a valori prossimi al basale (98%). La co-incubazione con L-NAME induce una significativa inibizione della risposta vasodilatatoria all’Ach. La incubazione con Acido Ascorbico non induce alcuna modificazione della risposta vasodilatatoria all’Ach. Inoltre, la presenza di Acido Ascorbico non modifica in alcun modo l’effetto inibitorio della L-NAME sulla vasodilatazione endotelio-dipendente. (Fig.3).
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Il gruppo di topi SAMP8 non trattati mostra una significativa riduzione della risposta vasodilatante all’Ach rispetto al gruppo di controllo SAMR1. La concomitante incubazione con L-NAME induce una inibizione della vasodilatazione Ach-mediata che tuttavia risulta significativamente minore rispetto a quella ottenuta nel gruppo di controllo.
In presenza di Acido Ascorbico si osserva un significativo potenziamento della vasodilatazione Ach-mediata che risulta quindi sovrapponibile alla risposta vascolare del gruppo SAMR1. In presenza dell’antiossidante, l’effetto inibitorio della L-NAME sulla vasodilatazione endotelio-dipendente risulta potenziato e simile a quello riscontrato nel gruppo di controllo (Fig.4).
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Il gruppo dei topi SAMP8 trattati con Donepezil mostra una risposta vasodilatante all’Ach pari al 98%, quindi decisamente maggiore rispetto agli esemplari non trattati e del tutto sovrapponibile al gruppo SAMR1.
Dopo incubazione con L-NAME si ha una riduzione della vasodilatazione Ach-mediata (65%), ma in misura maggiore rispetto al gruppo degli animali non trattati (SAMP8) e simile a quella osservata nei controlli negativi.
L’Acido Ascorbico non modifica la vasodilatazione endotelio-dipendente né l’effetto inibitorio della L-NAME sulla risposta vascolare all’Ach (Fig.5).
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7. DISCUSSIONE
I risultati ottenuti nello studio della funzionalità vascolare possono essere ritenuti molto interessanti poiché, per quanto riguarda il modello SAMP8, evidenziano come sia sicuramente presente disfunzione endoteliale a livello del microcircolo periferico.
Questo è dimostrato dal fatto che la risposta ad Acetilcolina in questi esemplari è ridotta (83%) rispetto al controllo negativo SAMR1 (98%).
Il dato che l’incubazione con L-NAME induca una ridotta inibizione della risposta vasodilatante all’Ach denota la presenza di una ridotta biodisponibilità di NO. Infine, è da osservare che la incubazione di queste arteriole con Acido Ascorbico induce la normalizzazione della vasodilatazione endotelio-dipendente ed inoltre determina un significativo aumento dell’effetto inibitorio di L-NAME sulla vasodilatazione Ach-mediata.
Tutto questo porta ad indicare che in questo modello animale di degenerazione cognitiva a livello del microcircolo periferico si determina la presenza di una alterata funzione endoteliale, legata ad una ridotta biodisponibilità di NO conseguente ad un aumentato stress ossidativo intravascolare.
Altro dato interessante emerso durante questo studio è stato il fatto che gli esemplari SAMP8 trattati con Donepezil abbiano una risposta vasodilatante all’Ach (95%) vicina a quella dei controlli sani SAMR1 (98%).
Da ciò sembrerebbe che l’utilizzo di questo farmaco sintomatico migliori anche la funzione dell’endotelio nell’animale da esperimento.
In particolare, si è osservato che in questi esemplari l’effetto inibitorio della L-NAME sulla risposta vascolare all’Ach è decisamente migliorata.
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Inoltre, in questo gruppo di animali la concomitante incubazione con Acido Ascorbico non esercita alcun effetto vascolare, né sulla risposta all’Ach né sull’effetto inibitorio di L-NAME.
Tutto questo ci consente di concludere che la terapia cronica con Donepezil induce un importante beneficio in termini di funzione vascolare.
In particolare, induce la normalizzazione della vasodilatazione endotelio- dipendente, un effetto legato ad un miglioramento della biodisponibilità di NO. Il dato che in presenza di Donepezil l’infusione acuta di Acido Ascorbico non eserciti in alcun modo alcun effetto vascolare induce a suggerire che l’effetto protettivo di questo farmaco sulla funzione endoteliale possa essere mediata da una proprietà antiossidante di Donepezil, che in qualche modo mimi l’effetto antiossidante di Acido Ascorbico.
Questo dato è completamente in accordo con quanto postulato in recenti studi che sono andati a valutare se il Donepezil avesse un qualche effetto antiossidante oltre all’effetto noto di aumento dei livelli di Ach a livello centrale.
In particolare è stato dimostrato che in un modello murino con demenza streptozocina-indotta il trattamento con Donepezil modifica i livelli di markers biochimici di stress ossidativo come glutatione (che aumenta) e malondialdeide (che diminuisce). Tutto ciò conferma quanto postulato nel nostro studio[40]. In considerazione dei risultati ottenuti nella presente tesi, sarebbe auspicabile, tenuto conto delle numerose evidenze che pongono all’origine della malattia di Alzheimer una disfunzione di tipo vascolare, che ulteriori studi futuri andassero a valutare se gli effetti protettivi che abbiamo evidenziato a livello del microcircolo periferico esistano anche a livello centrale.
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Inoltre sarebbe opportuno indagare anche se, il miglioramento sintomatico dato dal Donepezil, possa essere in qualche modo collegato alla sua presunta funzione antiossidante. Ach L-NAME AC. ASCORBICO AC. ASC+ LNAME SAMR 1 98% 62% 98% 57% SAMP 8 83% 55% 95% 55% SAMP 8+DONEPEZIL 95% 65% 98% 60%
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7. RINGRAZIAMENTI
Desidero innanzitutto ringraziare il prof. Agostino Virdis per avermi permesso di partecipare attivamente a questo studio, per la sua grande pazienza e disponibilità nel guidarmi nella stesura di questa tesi. Lo ringrazio per aver messo a mia disposizione la sua enorme esperienza e capacità in campo medico.
Spero vivamente che abbia apprezzato la nostra collaborazione e auspico che questa possa continuare anche dopo il termine del lavoro di tesi.
Ringrazio Emiliano per l’immenso lavoro svolto “dietro le quinte”, per avermi sopportato e supportato nella parte sperimentale e per avermi dato un esempio lampante di cosa significhi essere entusiasti del proprio lavoro.
Voglio ringraziare tutta la mia famiglia, i miei genitori Claudio e Ida per avermi permesso di studiare sempre senza mai preoccuparmi di nient’altro, mia nonna Lilia, mia sorella Linda e tutte le persone che in un modo o nell’altro mi sono state vicine.
Ringrazio Francesca per essermi stata accanto ogni giorno durante questo percorso e per avermi dato la forza e la tranquillità per affrontare tutte le difficoltà che si sono messe tra me e il raggiungimento di questo traguardo, sei stata veramente fondamentale.
Ringrazio Chiara, Claudio, Filippo, Gaia, Matteo, Pamela, Riccardo, Rosa e tutti gli altri colleghi con i quali ho condiviso le ansie e le gioie che questo corso di Laurea ci ha dato.
Infine, voglio ringraziare Alessandro per avermi insegnato cosa significhi essere veramente un medico sia professionalmente che eticamente e per avermi trasmesso l’immensa passione che dedica nel suo lavoro.
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