4.1 MATERIALI
I prodotti ortofrutticoli utilizzati per le prove sperimentali sono stati scelti tenendo conto dei dati riportati in letteratura ed acquistati presso diversi rivenditori locali. Tre campioni per ogni alimento sono stati analizzati a seconda delle esigenze e della disponibilità. Gli alimenti analizzati sono stati i seguenti:
• Prezzemolo (Petroselinum crispum L); • Lattuga Romana (Lactuca sativa L.);
• Broccoli (Brassica oleracea L. var. italica); • Sedano (Apium graveolens L. var. dulce); • Piselli (Pisum sativum var. sativum) • Spinaci (Spinacia oleracea L.);
• Zucchine (Cucurbita pepo subsp. pepo) • Mela (Malus domestica).
I campioni considerati sono stati trattati immediatamente dopo l’acquisto.
Per ogni campione è stata effettuata una selezione eliminando le parti più esterne e quelle danneggiate o che presentavano una colorazione brunastra. Si è proceduto al lavaggio e all’asciugatura delle parti considerate. I campioni, singolarmente, sono stati prima triturati con le forbici, poi pestati in mortaio con aggiunta di azoto liquido e, se necessario, è stata eseguita anche una veloce triturazione al macinino. Le procedure di preparazione sono state effettuate al riparo dalla luce al fine di prevenire l’isomerizzazione e la fotodegradazione dei carotenoidi.
I campioni triturati sono stati conservati in congelatore e sottoposti alla determinazione della luteina. Ogni determinazione è stata eseguita in triplo.
4.2 METODI
4.2.1 Procedure di estrazione e determinazione della luteina
Estrazione della luteina da vegetali secondo il metodo di Panfili et al., (2004)
Determinazione della luteina totale: la luteina totale è stata estratta mediante saponificazione a caldo ed estrazione con solvente secondo la metodica riportata da Panfili et al., (2004). Si pesano esattamente 2,0g di campione in provette Pyrex con tappo a vite. Nel caso di campioni di spinaci, si pesa esattamente 1g. A quest’aliquota si aggiungono:
• 10 palline di vetro, per evitare un’ebollizione tumultuosa;
• 5ml di pirogallolo etanolico al 6%, per evitare l’ossidazione dei carotenoidi; • 3ml di etanolo al 95%,
• 1ml di NaCl all’1%;
• 2ml di KOH al 60%, per la saponificazione;
• si insuffla azoto per 45 secondi, per eliminare l’ossigeno presente; • si agitano i tubi tappati su vortex;
• si pongono i tubi tappati a bagnomaria a 70°C per 45 minuti, per favorire la saponificazione del campione; i tubi vengono agitati ogni 5-10 minuti;
• dopo la saponificazione si fanno raffreddare i tubi in un bagno di ghiaccio;
• si procede aggiungendo 15ml di NaCl all’1%, per prevenire la formazione di emulsioni e favorire la separazione delle fasi nel sistema di estrazione;
• la sospensione è estratta con diverse porzioni di 15ml di una soluzione di n- esano:etilacetato (9:1), fino ad assenza di colore;
• l’estratto è solubilizzato con 2ml di una soluzione di alcool isopropilico al 10% in esano per HPLC; se necessario è possibile recuperare con più ml di fase mobile, fino a che il pallone di raccolta risulta incolore.
Il campione limpido o eventualmente filtrato, è pronto per essere iniettato in HPLC.
Per la determinazione delle diverse forme di luteina sono state apportate alcune modifiche al protocollo.
Determinazione della luteina libera: la luteina libera è stata estratta mediante la procedura senza saponificazione seguita da estrazione con solventi. Tale metodica è uguale a quella dell’estrazione con saponificazione, eccetto che per i 2ml di idrossido di potassio (KOH) al 60%, addizionati alla miscela estraente, che sono invece sostituiti con 2 ml di acqua distillata. Un’aliquota di quest’estratto (pari a circa 0,2g di campione) è stata portata a secco tramite evaporatore rotante e solubilizzata con 2ml di una soluzione di alcool isopropilico al 10% in esano per HPLC; o se necessario con più ml di soluzione, fino a che il pallone di raccolta risulta incolore.
Determinazione della luteina esterificata: sul rimanente estratto (pari a circa 1,8g di campione) di cui al paragrafo precedente, viene effettuata una procedura di estrazione a freddo, eseguita allo stesso modo di quella della saponificazione a caldo, tranne che per il passaggio in bagnomaria a 70°C, che è stato eliminato lasciando i tubi a temperatura ambiente per lo stesso periodo di tempo (45min). In questo modo otterremo un estratto che è la somma della luteina libera ed esterificata (indicata con il termine di luteina lipidica). La differenza tra tale somma e la luteina libera dà il contenuto in luteina esterificata.
Determinazione della luteina legata: la differenza tra il valore della luteina totale e luteina lipidica dà il valore di luteina legata presente nel campione ortofrutticolo.
Estrazione della luteina in vegetali secondo il metodo di Updike and Schwartz (2003) Il metodo di confronto considerato per l’estrazione dei carotenoidi, con particolare attenzione alla luteina, è stato quello di Updike and Schwartz (2003) che prevede una estrazione con
solventi e successiva saponificazione seguita dall’analisi cromatografica. Il protocollo originario è stato modificato aggiungendo il pirogallolo come antiossidante, nella stessa concentrazione aggiunta nel Panfili et al. (2004), per rendere i due metodi confrontabili. Il protocollo adottato è il seguente:
• si pesano 2g di campione in tubi da idrolisi alcalina; • si aggiungono: - 1g di Carbonato di Calcio
- 4g di Celite - 50ml di Acetone
- 5,4ml di Pirogallolo al 55% in Etanolo;
• si miscela per 1min all’agitatore, si omogeneizza con Ultraturrax in ghiaccio per un altro minuto e si attende la separazione delle fasi;
• si recupera la fase superiore e si filtra con filtri di carta Whatman n.1 e successivamente con filtri Whatman n.42;
• si riestrae il residuo con altri 50mL di acetone, si miscela per 1min e si omogeneizza per un altro minuto, si recupera e si filtra come sopra. L’estrazione con acetone è ripetuta fino a quando il residuo è incolore. Generalmente sono sufficienti due estrazioni;
• si aggiungono altri 5,4ml di Pirogallolo al 55% in etanolo agli estratti filtrati;
• si aggiungono 75ml di una soluzione di idrossido di potassio metanolica (KOH) al 30% (w/v) a temperatura ambiente per 30min sotto agitazione costante al fine di saponificare e allontanare la clorofilla;
• si addizionano 50mL di una soluzione di esano:dietiletere (70:30 v/v) dopo lavaggio con acqua deionizzata fino a separazione delle fasi;
• si raccoglie la fase organica contenente i carotenoidi. Questa procedura di estrazione è ripetuta fino a che la fase organica è incolore;
• si filtra la fase organica separata attraverso sodio solfato anidro per rimuovere l’acqua e si raccoglie in un pallone;
• si porta a secco e si recupera con 2ml di alcool isopropilico al 10% in esano per HPLC. Anche in questo caso sono stati utilizzati più ml di fase mobile.
Determinazione dei carotenoidi mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
Per la determinazione cromatografica del contenuto in carotenoidi è stato utilizzato un HPLC Dionex, costituito da una pompa P680, un loop da 25 µL e un rilevatore UVD 170U, utilizzando una colonna in silice Kromasil Phenomenex (5µm I.D., 4,6 * 250 mm), in condizioni isocratiche, con un flusso di 1,5 mL/min, utilizzando come fase mobile una soluzione di n-esano-isopropilico al 5% (v/v) per una durata di 20 minuti, impostando allo spettrofotometro una lunghezza d’onda pari a 450nm (Panfili et al., 2004). L’elaborazione dei dati è stata effettuata tramite software Chromeleon versione 6.6 della Dionex. L’analisi qualitativa e quantitativa è stata effettuata tramite standard esterni.
4.2.2 Prove di recupero
Per verificare la validità del metodo di estrazione della luteina (Panfili et al., 2004) è stata effettuata una prova di recupero aggiungendo 40µg di una soluzione standard di luteina (100µg/ml) su un campione di sedano. Il campione è stato sottoposto in triplo all’intera procedura di saponificazione, estrazione e determinazione cromatografica.
4.2.3 Analisi statistica
Sui risultati ottenuti è stata applicata un’analisi della varianza con il test di Student-Newman- Keuls (p<0,05) al fine di valutare la significatività dei dati.