MATERIALI E METODI

3.3.1 Disegno dello studio e popolazione esposta

Sono stati reclutati 203 bambini di diversi distretti scolastici di cui 149 frequentanti le scuole elementari situate in prossimità della raffineria di Milazzo e 54 frequentanti la scuola di Nizza, città a basso grado di urbanizzazione e industrializzazione a 72 Km da Milazzo. In particolare i 149 bambini frequentanti le scuole di Milazzo sono stati suddivisi in due gruppi in base alla distanza della scuola frequentata dalla raffineria petrolchimica. Il gruppo dei “vicino”, costituito da 127 bambini frequentanti le scuole distanti meno di 5 Km dalla raffineria, e il gruppo

“lontano”, costituito da 22 bambini frequentanti le scuole distanti più di 5 Km dalla raffineria.

Ad ciascun bambino sono stati raccolti due campioni di urina, uno della sera e uno della mattina successiva, nei mesi di Aprile, Maggio e Giugno 2013. Inoltre, è stato somministrato a ciascun bambino un questionario, compilato dai genitori, per ottenere svariare informazioni concernenti particolarità di tipo socio-demografiche dell’area di residenza, delle attività giornaliere e l’esposizione a fumo passivo dei bambini.

3.3.2 Monitoraggio ambientale

Per la valutazione delle concentrazioni medie ponderate nel tempo (TWA) degli inquinanti ambientali sono stati utilizzati i dati registrati dalla postazione fissa di rilevamento dell’ARPA di Milazzo nei giorni in cui sono stati effettuati i campionamenti biologici.

3.3.3 Monitoraggio biologico

Per il monitoraggio biologico dell’esposizione a benzene ed altri idrocarburi aromatici, a ciascun bambino è stato chiesto di raccogliere due campioni di urine, con un volume di circa 50 ml, uno alla sera prima di andare a dormire e l’altro alla mattina del giorno successivo prima di andare a scuola. I campioni sono stati suddivisi in diverse aliquote e subito congelati.

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Inoltre, per la determinazione delle concentrazioni di BTEX e di MTBE, è stata preparata un’aliquota di 2 ml di campione immessa in vials di vetro, a tenuta, contenenti 0.5 g di NaCl, cloruro di sodio, ed una miscela di standard interni, e conservati a -20°C fino all’analisi.

3.3.4 Determinazione del MTBE

Per la determinazione delle concentrazioni urinarie di MTBE, abbiamo utilizzato la microestrazione in fase solida (SPME, solid-phase microextraction) dello spazio di testa con successiva analisi in gascromatografia accoppiato alla spettrometria di massa (GC-MS). Il campionamento è stato effettuato utilizzando una fibra Carboxen/PDMS (75 μm, Supelco, Bellefonte, PA, USA), che è stata esposta nello spazio di testa dei campioni per 35 minuti. Per favorire il passaggio degli analiti dalla fase liquida a quella gassosa ed aumentare l’efficienza dell’estrazione, i campioni sono stati riscaldati alla temperatura di 45°C e mantenuti sotto agitazione per tutta la durata del campionamento. Gli analiti sono stati desorbiti termicamente dalla fibra, che è stata posta nell’iniettore del gascromatografo, ad una temperatura di 280°C per 10 minuti.

L’analisi GC-MS è stata effettuata utilizzando un gascromatografo HP 5890 (Hewlett Packard) accoppiato ad uno spettrometro di massa modello HP 5973, con sorgente a impatto elettronico.

La separazione degli analiti è stata ottenuta con una colonna capillare siliconica universale (CP-SIL 5CB-MS, 30 m x 0.25 mm d.i., film 0.25 μm) ed utilizzando idrogeno (H2) come gas di trasporto, ad un flusso pari a 1 ml al minuto. L’acquisizione è stata realizzata in modalità SIM (Selected Ion Monitoring), per ottenere la massima sensibilità del sistema di rivelazione. Le concentrazioni dell’MTBE sono state espresse in μg/L.

3.3.5 Determinazione dei metaboliti urinari del benzene

La determinazione dei metaboliti urinari del benzene, quali l’acido t,t-muconico (t,t-MA) e l’acido S-fenilmercapturico (S-PMA), è stata eseguita mediante cromatografia liquida accoppiata

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alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e diluizione isotopica. Le analisi sono state effettuate utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo modello API 4000 (AB-Sciex, Framingham, MA, USA), dotato di una interfaccia Turboionspray per la ionizzazione electrospray (ESI) assistita pneumaticamente. I metaboliti del benzene sono stati separati utilizzando una colonna Atlantis®dC18 (100 x 3.0 mm i.d., 3 μm, Waters) ed una fase mobile composta da acido formico acquoso (10 mM, pH=3,75 per aggiunta di idrossido d’ammonio) e metanolo in proporzioni variabili (gradiente di eluizione). Prima dell’iniezione in colonna di un volume di 10 μl, i campioni di urina sono stati centrifugati a 10.000 rpm per 5 minuti, acidificati con acido formico (0.1 M), ed addizionati di una miscela di standard interni marcati con deuterio.

L’acquisizione in MS/MS è stata ottenuta in modalità SRM (Selected Reaction Monitoring), una modalità che consente di ottenere la massima sensibilità e selettività della spettrometria di massa tandem. Per i metaboliti del benzene e per gli omologhi marcati isotopicamente (utilizzati come SI) sono state monitorate le transizioni caratteristiche di ciascun composto, ovvero m/z 141→97 per t,t-MA; m/z 238→109 per S-PMA; m/z 145→101 per t,t-MA-d4; ed m/z 243→114 S-PMA-d5.

Le concentrazioni dei metaboliti urinari sono state espresse in funzione della concentrazione della creatinina urinaria (μg/g creatinina), determinate con il metodo di Jaffè.

3.3.6 Determinazione della cotinina urinaria

Per caratterizzare l’esposizione passiva a fumo di tabacco, il principale interferente nel monitoraggio biologico dell’esposizione a benzene, è stata determinata la concentrazione della cotinina urinaria, metabolita della nicotina. La determinazione della cotinina in campioni di urina è stata effettuata mediante LC-MS/MS utilizzando uno spettrometro di massa ABSciex a triplo quadrupolo modello API 4000 dotato di sorgente TurboIonspray. La separazione della cotinina è stata ottenuta utilizzando una colonna Atlantis®dC18 (100 x 3.0 mm i.d., 3 μm, Waters) ed una

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fase mobile costituita da acido formico 10 mM (pH 3.75) e metanolo in gradiente di eluizione.

Prima dell’analisi i campioni di urina sono stati centrifugati a 10.000 rpm per 5 minuti e addizionati con una soluzione di acido formico acquoso contenente lo standard interno. La ionizzazione degli analiti è stata ottenuta in ioni positivi e la rivelazione in MS/MS, in modalità SRM, monitorando le transizioni caratteristiche: m/z 177→80 per cotinina e m/z 180→101 per d3- cotinina. Il metodo sviluppato è stato validato mediante lo studio dell’intervallo di linearità, la determinazione dei limiti di rivelazione e della precisione (intra-day e inter-day). Le concentrazioni della cotinina determinata nelle urine sono state espresse in funzione della creatinina, misurata secondo il metodo di Jaffe.

3.3.7 Determinazione degli indicatori di stress ossidativo

Le concentrazioni di Guanina (Gua), 8-idrossi-7,8-diidroguanina (8-oxoGua), Guanosina (Guo), 8-idrossi-7,8-diidroguanosina (8-oxoGuo), 2’deossiguanosina (dGuo) e 8-idrossi-2’deossiguanosina (8-oxodGuo), escrete nelle urine in forma libera, sono state determinate mediante LC-MS/MS utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo dotato di interfaccia TurboIonspray. La separazione degli analiti è stata ottenuta utilizzando una colonna Atlantis®dC18 (100 x 3,0 mm i.d., 3 μm, Waters) ed una fase mobile costituita da acido formico 10 mM (pH 3,75) e metanolo in gradiente di eluizione.

I campioni di urina sono stati centrifugati a 10.000 rpm per 5 minuti e addizionati con una soluzione di acido formico acquoso contenente la miscela degli SI. La ionizzazione degli analiti è stata ottenuta in ioni positivi e la rivelazione in MS/MS, in modalità denominata SRM, monitorando le transizioni caratteristiche di ciascun analita: m/z per Gua 152→135, per oxoGua 168→140, per Guo 284→152, per oxoGuo 300→168, per dGuo 268→152, per 8-oxodGuo 284→168

Il metodo sviluppato è stato validato mediante lo studio dell’intervallo di linearità, la determinazione dei limiti di rivelazione e della precisione (intra-day e inter-day). Le

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concentrazioni di tutti gli analiti determinati sono state espresse in funzione della creatinina urinaria, determinata secondo il metodo di Jaffè.

3.3.8 Determinazione degli indicatori di metilazione degli acidi nucleici

Le concentrazioni di 1-MetilGuanina (1-MeGua), 7-MetilGuanina (7MeGua), O6-MetilGuanina (O6-MeGua), 7-metilGuanosina (7MeGuo), Citosina (Cyto), 5-MetilCitosina (5MeCyto), Citidina (Cyt), 5-MetilCitidina (5MeCyt), 2’deossiCitidina (dCyt), 5-Metil-2’deossiCitidina (5MedCyt), emesse nelle urine in forma libera, sono state determinate mediante LC-MS/MS utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo dotato di interfaccia TurboIonspray.

La separazione degli analiti è stata ottenuta utilizzando una colonna Atlantis®dC18 (100 x 3,0 mm i.d., 3nμm, Waters) ed una fase mobile costituita da acido formico 10 mM (pH 3,75) e metanolo in gradiente di eluizione. Prima dell’analisi i campioni di urina sono stati centrifugati a 10.000 rpm per 5 minuti e addizionati con una soluzione di acido formico acquoso contenente la miscela degli SI. La ionizzazione degli analiti è stata ottenuta in ioni positivi e la rivelazione in MS/MS, in modalità denominata SRM, monitorando le transizioni caratteristiche di ciascun analita: m/z per 1-MeGua 166→135, per 7-MeGua 166→149, per O⁶-MeGua 166→134, per 7-MeGuo 166→134, per Cyto 112→69, per 5-MeCyto 126→83, per Cyt 244→112, per 5-MeCyt 258→126, per dCyt 228→112 e per 5-MedCyt 242→126.

Il metodo sviluppato è stato validato mediante lo studio dell’intervallo di linearità, la determinazione dei limiti di rivelazione e della precisione (intra-day e inter-day). Le concentrazioni di tutti gli analiti determinati sono state espresse in funzione della creatinina urinaria, determinata secondo il metodo di Jaffè.

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3.3.9 Analisi statistiche

L’analisi statistica è stata condotta utilizzando SPSS per Windows ®, Versione 21.0 (Statistical Package for Social Sciences, Chicago, IL, USA). La normalità o log-normalità della distribuzione è stata valutata mediante il test di Kolmogorov-Smirnov; tutte le variabili presentavano una distribuzione log-normale per cui è stata applicata una statistica parametrica dopo la trasformazione logaritmica delle stesse.

Le differenze tra i gruppi sono state valutate utilizzando il test t di Student per campioni indipendenti, mentre l’analisi della varianza ad una via (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Bonferroni per confronti multipli è stata utilizzata nel caso di confronti tra più gruppi. Per il confronto dello stesso indicatore in campioni diversi dello stesso soggetto (mattina e sera) è stato utilizzato il test t di Student per dati appaiati.

Le correlazioni tra variabili sono state valutate tramite il coefficiente di correlazione r di Pearson.

Valori di p<0,05 sono stati considerati significativi. Modelli di regressione lineare multipla sono stati applicati per studiare l’influenza di sesso, di esposizione a fumo passivo, di esposizione a benzene e della distanza dalla raffineria sull’escrezione urinaria degli indicatori di danno da ossidazione e da metilazione agli acidi nucleici.

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