MATERIALI E METODI

La sperimentazione è stata condotta tra i mesi di Gennaio e Giugno 2014 su un campione randomizzato di 112 ovini adulti, che da un’analisi retrospettiva sono risultati appartenere a 14 allevamenti distribuiti in otto diversi Comuni della Sardegna (Fonni, Oschiri, Ozieri, Padria, Samassi, Semestene, Serramanna e Villamassargia). Gli animali sono stati regolarmente macellati presso due mattatoi dell’isola siti rispettivamente nella provincia di Cagliari (Mattatoio Comunale di Carbonia) e di Sassari (Cooperativa 27 Febbraio di Samassi). Durante le operazioni di campionamento, che con la collaborazione dei Veterinari Ispettori delle Aziende Sanitarie Locali (ASL), si sono svolte in catena di macellazione presso i mattatoi sopra citati, è stato possibile reperire il sangue e gli organi necessari per lo svolgimento delle successive indagini in laboratorio. In particolare, per ogni singolo capo, all’atto della iugulazione è stato raccolto in provette sterili prive di anticoagulante (tappo rosso) un campione di sangue. Mentre il prelievo del tronco encefalico è stato effettuato subito dopo la separazione della testa dell’animale dalla carcassa e infine durante le procedure di eviscerazione, con l’aiuto degli operatori, dalla corata son stati separati miocardio e muscolo diaframmatico.

Tutti i campioni sono stati confezionati singolarmente in sacchetti di plastica precedentemente contrassegnati, e trasportati in adeguate condizioni di refrigerazione (4 °C), al laboratorio di Parassitologia dell’Ospedale Didattico Veterinario del Dipartimento di Medicina Veterinaria di Sassari. Per una maggiore accuratezza, su un’apposita scheda sono stati registrati tutti i codici identificativi di ciascun animale e delle aziende in modo da poter risalire con precisione alla provenienza dei campioni.

Il protocollo da noi studiato prevedeva lo svolgimento di un’indagine, sierologica e biomolecolare condotte in parallelo, mediante l’utilizzo di due differenti tecniche diagnostiche: ELISA e PCR. L’ELISA è stata eseguita su differenti matrici, ovvero siero e succo di carne, ottenuti dal tessuto muscolare cardiaco e diaframmatico degli ovini campionati. Mentre per l’indagine biomolecolare è stata realizzata una Nested PCR, sui campioni di DNA provenienti dal tronco encefalico e dal miocardio degli stessi animali, seguendo il protocollo descritto da Halovà D. et al. (2013).

3.3.1. Indagine sierologica

In laboratorio, il siero è stato ottenuto per centrifugazione delle provette di sangue a 2000 rpm per 10 minuti (Centrifuge 5804 R, Eppendorf) e successiva separazione dalla parte corpuscolata. Il siero è stato opportunamente aliquotato in provette Eppendorf da 1,5 ml, congelato e stoccato a -20 °C fino all’esecuzione delle analisi.

Nel frattempo il tessuto muscolare cardiaco e diaframmatico sono stati congelati singolarmente in sacchetti di plastica, a -20 °C e scongelati overnight a temperatura ambiente per l’ottenimento del “succo di carne” secondo la tecnica descritta da Glor S.B. et al. (2013). Il “succo di carne” costituito dal liquido plasmatico rilasciato dalla carne durante il processo di scongelamento è stato aliquotato in provette Eppendorf da 1,5 ml e stoccato a -20 °C sino all’esecuzione delle analisi mediante test ELISA.

ELISA

Tutti i campioni raccolti sono stati testati tramite reazione ELISA indiretta. Per l’analisi è stato utilizzato un kit commerciale PrioCHECK® Toxoplasma Ab SR (Prionics, Schlieren-Zurich, Switzerland) per la ricerca di anticorpi di classe IgG specifici nei confronti di T. gondii.

Il siero ed il succo di carne sono stati testati con differenti diluizioni, rispettivamente con una diluizione finale di 1:100 il siero e di 1:10 il succo di carne. Ciascuna piastra fornita dal kit era composta da 96 pozzetti, sulle cui pareti vi era adsorbito l’antigene, derivato da lisati di tachizoiti di T. gondii. Secondo il nostro protocollo in ogni pozzetto sono stati dispensati 90 µl di diluente, a cui sono stati aggiunti 10 µl di standard (controllo positivo, controllo debolmente positivo e controllo negativo) nei primi sei pozzetti (C1-C6), mentre nei restanti pozzetti sono stati addizionati 10 µl dei campioni di siero/succo di carne in esame. Dopo un periodo di incubazione di circa 1 ora a temperatura ambiente (22 ± 3 °C), l’eccesso di siero veniva allontanato tramite lavaggi. A questo punto venivano aggiunti 100 µl di coniugato costituito da un anticorpo secondario anti-ovino marcato con perossidasi in grado di legarsi al complesso antigene-anticorpo, eventualmente formatosi ed adeso in fase solida, la cui presenza, dopo opportuna incubazione (1 ora), veniva rivelata mediante l’aggiunta di 100 µl di substrato cromogenico (tetrametil benzidina, TMB). Una

volta stabilizzata la reazione con l’aggiunta di una soluzione di arresto, entro 15 minuti veniva fatta la lettura allo spettrofotometro.

La densità ottica (DO) è stata misurata a 450 nm (filtro di riferimento 620 nm). I risultati sono stati interpretati calcolando, per ciascun campione, una Percentuale di Positività (PP) relativa al valore della DO del controllo positivo [PP campione = (DO 450 nm campione/DO 450 nm controllo positivo) x 100]. Un valore PP ≥ 20 è stato considerato positivo (come suggerito dal produttore), mentre i valori PP < 20 sono stati considerati negativi.

3.3.2. Indagine biomolecolare Estrazione del DNA

Per l’indagine biomolecolare sono state preparate delle aliquote costituite da 50 gr di tessuto omogenato ottenute rispettivamente da encefalo e miocardio. Da ciascun aliquota sono stati successivamente prelevati 0,05 gr di campione che sono stati raccolti in provette Eppendorf da 1,5 ml e congelati a -20 °C fino alla successiva fase di estrazione del DNA.

Per l’estrazione è stato utilizzato il kit commerciale, Pure Link Genomic Dna Mini Kit (Invitrogen). Ogni aliquota, precedentemente preparata, è stata sottoposta ad una prima fase di lisi con un buffer e Proteinasi K a 55 °C per circa 1 ora in modo da avere una completa disgregazione del tessuto. Successivamente è stato aggiunto il Binding buffer lasciato a incubare a temperatura ambiente per favorire il legame con il DNA. In seguito è stato aggiunto isopropanolo e il DNA è stato fissato su colonnine dotate di un filtro di natura silicica. A questo punto, sono stati effettuati una serie di lavaggi con un buffer apposito per eliminare le impurità e ottenere un DNA pulito. Il DNA estratto è stato stoccato a -80 °C.

Le provette contenenti i diversi campioni di DNA sono state contrassegnate con numeri progressivi, ed i riferimenti riportati sia sul diario di laboratorio, che su un foglio di lavoro elettronico di Excel, per l’archiviazione dei dati in un apposito database.

Nested PCR

Sui campioni di DNA estratti si è proceduto alla rilevazione di T. gondii mediante una Nested PCR il cui target è un frammento di 302 paia di basi (bp) della regione Internal Transcribed Spacers- 1 (ITS1) dell’rRNA 18S-5,8S secondo il metodo descritto da Halovà D. et al. (2013). Ciascuna reazione di PCR è stata condotta in un volume finale di 25 μl contenente PCR buffer (1X), MgCl2 (1,5 mM),

dNTPs (0,2 mM di ognuno), primer FOR (0,2 µM), primer REV (0,2 µM), 1 U di Taq polimerasi (Invitrogen), DNA, H2O milliq.

In ciascuna reazione di PCR sono stati inclusi un controllo positivo e un controllo negativo per verificare la correttezza del procedimento.

Per l’amplificazione sono stati utilizzati due set di primers: una coppia di primers esterni per la prima reazione, NN1 (5'-CCT TTG AAT CCC AAG CAA AAC ATG AG-3') e NN2 (5'-GCG AGC CAA GAC ATC CAT TGC TGA-3'); ed una coppia di primers interni per la seconda reazione, ITSfw (5'-GAT TTG CAT TCA AGA AGC GTG ATA GTA T-3') e ITSrev (5'-AGT TTA GGA AGC AAT CTG AAA GCA CAT C-3').

Le amplificazioni sono state effettuate utilizzando il termociclatore GeneAmp PCR System 9700 (Applied Byosistems, USA).

Le condizioni termiche per la prima reazione sono state le seguenti: 94 °C per 3'; 40 cicli dei tre step di denaturazione a 94 °C per 30'', annealing a 65°C per 45'' e allungamento a 72 °C per 1'; seguiti da un’estensione finale a 72 °C per 5'.

La seconda reazione di PCR è stata preparata con 1 µl di amplificato ottenuto nella prima reazione e le condizioni termiche sono state le seguenti: 95 °C per 5'; 50 cicli di 94 °C per 40'', 60 °C per 40'' e 72 °C per 1' e un’estensione finale a 72 °C per 7'.

Al fine di valutarne specificità e resa, un’aliquota dell’amplimero è stata sottoposta a elettroforesi in gel di agarosio all’1,5% in tampone TAE (Tris-Acetato 40 mM, Na2EDTA 0,1 Mm, pH 8) e Syber Safe

DNA gel stain (Invitrogen). La visualizzazione dei risultati e l’acquisizione dell’immagine veniva effettuata mediante lo strumento UVITEC (Cambridge). La stima della lunghezza del frammento è stata effettuata mediante l’utilizzo dello standard di pesi molecolari Thermo Scientific GeneRuler (100 bp DNA ladder).

Per confermare i risultati ottenuti attraverso la Nested PCR alcuni degli amplificati con le caratteristiche migliori, sono stati selezionati per la purificazione ed il successivo sequenziamento. I prodotti di PCR venivano purificati mediante il kit commerciale ChargeSwitch® PCR Clean-Up Kit (Invitrogen), un sistema basato sull’utilizzo di biglie magnetiche alle quali si lega il DNA e che permette di separarlo dai vari inquinanti presenti nella mix di reazione. Il sequenziamento dei campioni purificati veniva effettuato presso un laboratorio esterno mediante un sequenziatore capillare (Applied Bio-systems).

Le sequenze ottenute, sono state appaiate ed analizzate mediante il software Mega 6 e online mediante il software BLAST per confrontarle con le sequenze dell’NCBI depositate in rete.

3.3.3. Analisi dei dati

I risultati ottenuti sono stati registrati su un foglio di calcolo elettronico Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) e successivamente analizzati al fine di stabilire le performances delle metodiche diagnostiche da noi utilizzate.

Per il confronto tra le prevalenze è stato effettuato il test del Chi-quadro attraverso il software Epi-Info (version 7.0, CDC/WHO, Atlanta, GA, USA). Dal momento che la maggior parte dei dati esaminati non è risultata distribuita normalmente, per il confronto delle Percentuali di Positività (PP) ottenute con la metodica ELISA è stata eseguita una valutazione con il test di Kruskal-Wallis, con l’utilizzo del software Minitab

®

Al fine di valutare sensibilità, specificità e concordanza della metodica ELISA nelle matrici da noi esaminate, abbiamo utilizzato una tabella di contingenza 2X2 (Bottarelli, http://www.quadernodiepidemiologia.it/) assumendo come Gold Standard la positività alla PCR per almeno una dei due organi analizzati (encefalo e/o miocardio).