4.1 Popolazione studiata
Il protocollo, che è conforme con la Dichiarazione di Helsinki, è stato approvato dal Comitato Etico locale (Codice EUDRACT: 2008-00202136) e tutti i partecipanti hanno dato il loro scritto consenso per lo studio.
Lo studio ha incluso 7 pazienti ipertesi essenziali (IA) (50.3±6.1 anni) con ipertensione essenziale lieve-moderata, mai trattati per l'ipertensione o che non avevano ricevuto alcun farmaco per almeno 1 mese prima dell'iscrizione nello studio e 7 pazienti normotesi di controllo (NT) (53.1±4.5 anni).
4.2 Preparazione delle piccole arterie ed esperimenti funzionali
Tutti i pazienti sono stati sottoposti durante intervento chirurgico in laparoscopia a biopsia del grasso sottocutaneo dalla parete anteriore della regione addominale. Lo studio della reattività vascolare è stato eseguito tramite la tecnica micromiografia a pressione. Il tessuto prelevato dalla biopsia è immerso immediatamente in una soluzione di Krebs ( mM: NaHCO3 25.0; Glucosio 5.5; NaCl 120.0; KCL 4.7; CaCl2 2.5; EDTA 0.026; KH2PO4 1.18) a 4°C per mantenerlo vitale. Successivamente è posizionato su una piastra Petri e tramite l’utilizzo del
microscopio ottico bifocale le piccole arterie (2 mm lunghezza/150-300 m diametro)
grazie a pinzette molto sottili, sono isolate dal grasso periavventiziale e posizionate in una apposita camera riscaldata a 37 °C contenente Krebs, dove vengono inserite e legate tramite un filo di seta alle due estremità di due micro cannule di vetro. La
posizione del vaso è quindi ottimizzata mediante piccoli movimenti di una delle due micro cannule fino ad ottenere le due pareti del vaso parallele [68, 69].
All’interno della camera il vaso è mantenuto vitale durante tutto l’esperimento perchè al suo interno viene fatta passare la soluzione di Krebs saturata di carbogeno a un PH di 7.4 e a una temperatura fisiologica di 37 °C. Gli studi sono stati eseguiti mantenendo il vaso ad una pressione costante di 60mmHg. Con l’ausilio di un microscopio ottico e di una telecamera collegata al monitor del computer è stato possibile vedere ad occhio nudo e in diretta nel monitor la vasodilatazione o vasocostrizione dell’arteria isolata. L’entità del movimento del vaso è stata calcolata direttamente dal programma Myoview ed espressa in micron. Le/a sostanze/a da testare sono state infuse nel lato extraluminare dell’arteria tramite una pompa peristaltica. Questa pompa lavora a flusso costante (circa 4ml/min). Prima di iniziare il trattamento con la/e sostanze in esame, una volta finito l’allestimento è stata valutata la vitalità dell’arteria. A tale fine, l’arteria è stata trattata, tramite infusione extraluminale, con una soluzione contenente una elevata concentrazione di KCl (125mmol/L).
Le arterie vengono considerate vitali se mostrano una riduzione del lume maggiore del 40%. Una volta appurato che l’arteria allestita è vitale, è stata lavata per 30 min con Krebs e successivamente sono state effettuate misurazioni basali del lume e delle parete del vaso.
4.2.1 Test di reattività vascolare
Per valutare la disponibilità di NO e la produzione dei ROS, nei piccoli vasi dei pazienti con ipertensione essenziale e dei soggetti normotesi di controllo, sono state
incubazione per 30 minuti con un inibitore di NOS, l’L-NAME (100 M) e
successivamente con l'acido ascorbico utilizzato come antiossidante (100 M), ed
anche dopo incubazione simultanea dei due farmaci. Il protocollo intero è stato
ripetuto in presenza dell’infusione della grelina (1 µM, 30' pre-incubazione).
4.3 Ruolo della grelina sulla produzione intravascolare di ROS e sulla NAD(P)H ossidasi
4.3.2 Rilevazione della produzione di anione superossido vascolare
La produzione in situ dell'anione superossido è stata valutata mediante la
tecnica a fluorescenza del diidroetidio (1 mM DHE) [69]. In presenza di anione
superossido il DHE viene ossidato, si trasforma in etidio e intrecalandosi nel DNA, colora i nuclei esibendo fluorescenze nel rosso, valutabile grazie a microscopio confocale a scansione laser (561 nm di eccitazione). I vasi isolati dal grasso sono stati incubati con grelina (1 µM), con l’inibitore dell’ NAD(P)H ossidasi gp91ds-tat (1 µM) o soluzione di Krebs. Le concentrazioni dei due inibitori sono stati selezionati in base a esperimenti preliminari dose di titolazione (da 0,1 a 10 µM) per ottenere un
effetto inibitorio massimo con la dose più bassa. Successivamente i vasi sono
congelati a -70° C in apposite cuvette mediante mezzo di inclusione per criostato (OCT), le sezioni dei vasi sono state eseguite mediante criostato, ottenendo in questo modo delle fettine dello spessore di 8 µm che vengono disposte su vetrino (Super Frost plus).
La tecnica prevede diverse fasi di lavoro:
-incubare i vetrini con una soluzione contenente liquido di Krebs-HEPES per 30 minuti a 37°C in un bagnetto termostatico;
-disporre i vetrini su carta bagnata ed aggiungere il tampone contenente 2 mmol/L di DHE;
-lasciare incubare in camera oscura umidificata per 30 minuti a 37°C; -rilevazione tramite microscopio confocale;
Tre diapositive per segmento sono state analizzate contemporaneamente. La percentuale di area di parete arteriosa colorata con segnale rosso è stata analizzata con un software di imaging (MKcBiophotonics Image J; National Institutea of Health, Bethesda, MD).
4.3.1 Analisi western blot di anti-phospho-p47phox (PSER359)
L’analisi western blot è stata eseguita nei piccoli vasi isolati dai pazienti AI e
dai NT per valutare una specifica sub unità dell’enzima NAD(P)H ossidasi, la p47phox fosforilata a livello della serotonina in posizione 359, come indice diretto dell’enzima. Alcune arteriole sono state incubate con grelina (1 µM), fino ad avere tre gruppi di studio: arteriole di soggetti normotesi, di ipertesi essenziali, di ipertesi essenziali preincubate con grelina.
A questo punto le arteriole sono state pesate e omogeneizzate in tampone di lisi contenente 10 mM acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico (HEPES), 30 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 2 mM fenilmetilsulfonil fluoruro, 10 μg/ml leupeptina, 10 μg/ml aprotinina, 1 mM fluoruro di sodio, 1 mM ortovanadato di sodio, 2% glicerina, 0,3 mM MgCl2 e 1% Triton X-100. Gli omogenati sono stati centrifugati a 15.000 g per 15 min a 4°C e i sovranatanti sono stati conservati a -80°C. Il sovranatante è stato quindi utilizzato per misurare la concentrazione proteica totale tramite il metodo di Bradford (Protein Assay Kit; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Trenta mg di lisato totale sono stati sottoposti a denaturazione tramite bollitura, separati mediante
elettroforesi su gel di poliacrilammide all’8% contenente sodio dodecilsolfato e trasferiti su membrana Immobilon-P. Le proteine sono state quindi bloccate e marcate
con anticorpo primario diretto contro la sub unità p47phox fosforilata a livello della
serotonina in posizione 359 e β-actina. Le bande sono state sottoposte a rivelazione con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano. Le bande immunoreattive sono state visualizzate tramite incubazione con reagenti chemiluminescenti ed esposte a scansione con Codak Image Station 440 (Carestream Health, Rochester, NY) per l’acquisizione e l’analisi densitometrica delle immagini.
4.4 Analisi dei dati
L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, USA). I risultati sono presentati come media deviazione standard e sono stati analizzati mediante ANOVA per misure ripetute, seguito dal test di Student-Newman-Keuls, o dal t test di Student per dati non appaiati. È stato considerato statisticamente significativo il valore di p < 0.05.