4.1 Popolazione studiata
La popolazione oggetto dello studio si componeva di due gruppi: pazienti obesi sottoposti a chirurgia bariatrica e pazienti di controllo che non presentavano fattori di rischio cardiovascolari ma dovevano essere sottoposti a chirurgia in elezione per patologie non acute (principalmente colecistectomia o riparazione di ernia inguinale).
Il gruppo dei soggetti obesi è costituito da pazienti afferenti agli ambulatori “Obesità” della Medicina Interna III del presidio Santa Chiara di Pisa, nel percorso “Chirurgia bariatrica”. Solo coloro che hanno eseguito l’intervento chirurgico nel periodo di Marzo 2017 – Settembre 2017 sono stati inclusi nello studio.
Sono stati esclusi i pazienti che presentavano:
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Età > 60 anni;-
Storia clinica di ipertensione (definite da valori pressori > 140/90 mmHg);-
Storia clinica o evidenza dagli esami ematochimici di malattie endocrine (ad eccezione del diabete);-
Eccessivo consumo di alcol (> 60 g/giorno);-
Dislipidemia (definite come valori espressi in mmol/L: Colesterolo totale > 240; HDL < 40; LDL > 160; Trigliceridi > 200);-
Fumatori;-
Storia di alterata funzione renale o epatica o elevazione dei livelli di creatinina o transaminasi;-
Menopausa;-
Storia di pregressa o concomitante malattia aterosclerotica o cardiovascolare;Il gruppo di controllo, invece, è stato reclutato tra i pazienti che afferivano al Dipartimento di “Chirurgia Generale” dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa per procedure elettive di colecistectomia o ernia inguinale. I criteri di esclusione erano gli stessi assunti per il gruppo obesi, ad eccezione di un BMI > 30 Kg/m2.
4.2 Prelievo materiale bioptico
Durante la procedura chirurgica di elezione, una porzione di tessuto sottocutaneo, corrispondente alla sede di inserzione del trocar per procedura laparoscopica, è stato rimosso, non utilizzando bisturi laser per evitare di danneggiare le arterie. Subito dopo la rimozione, il tessuto è stato immerso in provetta in una soluzione di Krebs (mmol/L: NaHCO3 25.0; Glucosio 5.5; NaCl 120.0; KCL 4.7; CaCl2 2.5; EDTA 0.026; KH2PO4 1.18) a 4°C per mantenerlo vitale e trasferito presso i laboratori della Medicina Interna I per l’ulteriore processamento.
4.3 Isolamento delle arterie e conferma della vitalità
A partire dalla biopsia, le piccole arterie sono state isolate al microscopio dal tessuto adiposo e montate su di un miografo a pressione per gli studi funzionali.
40 Nel dettaglio, il pezzo bioptico è stato posizionato su una piastra Petri e, tramite l’utilizzo del microscopio ottico bifocale e di pinzette, le piccole arterie sono isolate dal grasso periavventiziale e posizionate in una apposita camera, dove sono state inserite e legate tramite un filo di seta alle due estremità delle microcannule di vetro. La posizione del vaso è stata quindi ottimizzata mediante piccoli movimenti di una delle due microcannule fino a posizionare parallele fra loro le due pareti del vaso (Figura 5).
Figura 5. A) Camera micromiografica con valvola di ingresso e valvola di uscita. B) Arteriola fissata alle due microcannule.
All’interno della camera il vaso è stato mantenuto vitale durante tutto l’esperimento grazie all’infusione continua di soluzione di Krebs saturata di carbogeno a un PH di 7.4 e a una temperatura fisiologica di 37 °C. Gli studi sono stati eseguiti mantenendo il vaso ad una pressione costante di 60 mmHg. Con l’ausilio di un microscopio ottico e di una telecamera collegata al monitor del computer è stato possibile vedere ad occhio nudo e in diretta nel monitor la vasodilatazione o vasocostrizione dell’arteria isolata. L’entità del cambiamento di lume del vaso è stata calcolata direttamente dal programma Myoview ed espressa in micron.
Prima di iniziare lo studio funzionale, la vitalità dell’arteriola è stata valutata infondendo una soluzione contenente un’elevata concentrazione di KCl 125 mM/L e, se la riduzione del lume risultava > 40% rispetto il valore iniziale, l’arteriola è stata considerata vitale e quindi utile per lo studio. Successivamente l’arteriola è stata lavata con Krebs per togliere qualsiasi residuo di KCl e sono iniziate le misurazioni basali e sperimentali.
4.4 Test di reattività vascolare
Le sostanze da testare sono state infuse nel lato extraluminare dell’arteria tramite una pompa peristaltica. Questa pompa lavora a flusso costante (circa 4 ml/min). Per valutare la vasodilatazione endotelio-dipendente, la proporzione di tale dilatazione dovuta all’attività di NO e l’effetto su di essa di un agonista selettivo di Sirt-1 (SRT1720), i piccoli vasi dei pazienti obesi e dei soggetti normopeso di controllo sono stati studiati utilizzando i seguenti stimoli:
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Curva dose-risposta all’ACh (0.001– 100 µmol/L): questo dato permette di valutare l’entità della vasodilatazione endotelio-dipendente e di avere una stima attendibile del grado di disfunzione endoteliale.-
Curva dose-risposta all’Ach dopo incubazione per 30 minuti con l’N-nitro-L-arginina metilestere (L- NAME) (100 µmol/L), inibitore selettivo della NO-sintetasi: questo consente di definire l’entità della vasodilatazione endotelio-dipendente attribuibile alla produzione di NO dovuta all’attività della eNOS;-
Curva dose-risposta all’Ach dopo incubazione per 30 minuti con SRT1720 (1 µmol/L), attivatore dell’enzima Sirt-1: questo consente di definire l’entità della disfunzione endoteliale dipendente da una ridotta funzione di Sirt-1 a livello delle cellule endoteliali;-
Curva dose-risposta all’Ach dopo incubazione per 30 minuti con L-NAME (100 µmol/L) e con SRT1720 (1 µmol/L), attivatore dell’enzima Sirt-1: questo consente di definire la proporzione del miglioramento della funzione endoteliale indotta da Sirt-1 dipendente da una maggiorproduzione di NO da parte della eNOS;
In ogni esperimento, curve che non presentavano un regolare incremento del diametro vascolare dopo l’aumento della concentrazione di Ach sono state ripetute utilizzando nuove arteriole isolate dal tessuto sottocutaneo e montate sul micromiografo a pressione.
4.5 Rilevazione della produzione di anione superossido vascolare
Alcuni vasi isolati dalla biopsia di tessuto sottocutaneo sono stati utilizzati per studi di immunoflorescenza volti a definire la produzione in situ dell'O2- da parte della NADPH ossidasi tramite
l’utilizzo di diidroetidio (DHE) e microscopia confocale. Sono stati sottoposti a questo studio i vasi provenienti da 5 pazienti obesi e 5 pazienti di controllo.
Rilevazione dell’anione superossido tramite DHE
In condizioni inerti, il DHE non presenta fluorescenza. Quando però viene ossidato dall’O2-, il DHE si
trasforma in etidio (HE), esibendo fluorescenza nel rosso ad una lunghezza d’onda di 605 nm e, intercalandosi nella molecola di DNA, si concentra a livello del nucleo cellulare. L’entità della reazione fluorescente è direttamente proporzionale alla quantità di O2- presente nella cellula. La fluorescenza
del DHE è inibita da enzimi ad attività riducente i ROS (quali la SOD), mentre tende ad aumentare in seguito alla stimolazione della NADPH ossidasi. L’acquisizione delle immagini fluorescenti viene quindi eseguita al microscopio a scansione laser (come quello confocale), utilizzando lunghezze d’onda di 561 nm per l’eccitazione.
Protocollo
Piccoli vasi di resistenza isolati dai pezzi bioptici sono stati posti in apposite cuvette mediante mezzo di inclusione per criostato (OCT) e conservate a -70°C. Il giorno dell’esperimento, le cuvette sono state recuperate dal congelatore e sezionate mediante criostato, ottenendo in questo modo delle fettine di tessuto dello spessore di 8 µm contenenti sezioni trasversali del vaso che sono state successivamente disposte su vetrino (Super FrostR plus). I vetrini sono quindi stati trattati secondo il seguente protocollo:
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incubazione con una soluzione contenente liquido di Krebs-HEPES (mmol/L: NaCl 118; KCl 4.8; MgSO4 1.2; KH2PO4 1.2; CaCl 1.0; Glucosio 11.0; HEPES 25) per 30 minuti a 37°C in un bagno termostatico;-
è stato quindi aggiunto un tampone contenente DHE alla concentrazione 2 µmol/L;-
i vetrini sono stati incubati per 30 minuti in una camera umidificata e protetta dalla luce alla temperatura di 37°C;-
dopo ulteriore lavaggio, la fluorescenza è stata quantificata tramite lettura del vetrino al microscopio confocale.Il protocollo è stato eseguito anche su vasi pre-incubati con un inibitore specifico della NADPH ossidasi (gp91ds-tat, alla concentrazione 1 µM/L) per poter valutare la quantità di O2- prodotto dalla NADPH
ossidasi.
Sono state analizzate contemporaneamente tre diapositive per segmento. La percentuale di area di parete arteriosa colorata con segnale rosso è stata analizzata con un software di imaging (MKcBiophotonics Image J; NIH, Bethesda, MD), ottenendo perciò una valutazione quantitativa della presenza dell’O2- all’interno della parete vasale.
4.6 Analisi statistica dei dati
I risultati sono calcolati come incremento o decremento percentuale massimo del diametro del lume rispetto la baseline, in vasi o in condizioni basali o precontratti con noradrenalina. I dati sono presentati come media ± deviazione standard e analizzati mediante ANOVA per misurazioni ripetute seguito da test Student–Newman–Keuls, o dal t test di Student per dati non appaiati. Le associazioni tra diversi parametri sono state valutate tramite correlazione di Spearman. È stato considerato statisticamente significativo il valore di p<0.05. Tutte le analisi sono state eseguite con SPSS ver 24 software.
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