Materiali e metodi

Farmaci e reagenti

CLM 29 e CLM24 sono stati sintetizzati al Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa.218

In breve, l’alchilazione del composto, disponibile in commercio, 3-amino-4- pirazolocarbonitrile (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) con il 2-bromoetilbenzene in posizione N1 del nucleo pirazolico, seguita dalla ciclizzazione per ebollizione dell’acido formico, ha fornito l’intermedio 1-feniletil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-one. Il trattamento di questo intermedio con il cloruro di fosforile (PclO3) genera il corrispondente 4 cloro-derivato, che ha portato all’inibitore di destinazione, CLM29, attraverso la reazione con la 3-fluorobenzilamina in presenza della trietilamina.219

Per quanto riguarda CLM24 (N,1-difenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina), l’alchilazione del composto, disponibile in commercio, 3-amino-4-pirazolocarbonitrile (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) con il 2-bromoetilbenzene, seguita dalla ciclizzazione per ebollizione dell’acido formico, ha fornito l’intermedio 1-feniletil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-one. Il trattamento di questo intermedio con il cloruro di fosforile (PclO3) genera il corrispondente 4 cloro-derivato, che ha portato all’inibitore di destinazione, CLM24, attraverso la reazione con il 2-bromoetilbenzene in presenza della trietilamina.

Figura 14: Struttura del composto CLM24, N,1-difenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-

Sono stati scelti CLM29 e CLM24 perché inibiscono vari target molecolari (RET, EGFR, VEGFR) e possiedono anche un’attività anti-angiogenetica.220 Per gli studi in vitro, CLM29 e CLM24 sono stati disciolti in una soluzione madre a 10mmol/L in dimetil sulfossido (DMSO) al 100%. EGF ricombinante umano, il fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF) e VEGF provenivano da PeproTech EC LTD (London, UK). I mezzi per la cultura cellulare MCDB131 e RPMI sono stati acquistati da GibcoLife Technologies (Grand Island, NY, USA), i reagenti per la real-time PCR provenivano da Applied Biosystems-Life Technologies, supplementi e tutti gli altri prodotti chimici non elencati in questa sezione sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich.

La linea cellulare 8305C

La linea cellulare 8305C (linea cellulare di carcinoma tiroideo indifferenziato con componente papillare; DSMZ, Germania) è stata mantenuta nel mezzo di coltura RPMI integrato con il 15% di siero fetale bovino e 2mM di L-glutammina.

Il saggio di proliferazione

Il saggio di proliferazione è stato eseguito come descritto in letteratura.221 Le cellule sono state seminate ad una concentrazione di 35’000 cellule/pozzetto in un piatto di 96 pozzetti di 100 µL ciascuno e trattate per 24h con CLM29 (1, 5, 10, 30, 50 µM) o CLM24 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 µM) o lasciate nel solo mezzo di coltura. Alla fine dell’esperimento, le cellule vitali sono state contate con un emocitometro. I dati sono presentati in percentuale rispetto alle cellule trattate con il solo mezzo di coltura.

Le cellule primarie

La fonte di pazienti per il tessuto tiroideo

I tessuti tiroidei sono stati ottenuti da nove pazienti con ATC (cinque femmine, quattro maschi; range di età 54-78; range di dimensione tumorale 5-12 cm) al momento dell’atto chirurgico e la diagnosi è stata stabilita mediante criteri clinici, laboratoristici ed istologici comunemente accettati.207-209 I tessuti tiroidei normali sono stati ottenuti da cinque pazienti sottoposti a paratiroidectomia. L’immunoistochimica ha mostrato l’assenza di espressione del recettore del TSH, della tireoperossidasi (TSO), della tireoglobulina (Tg) e del simporter sodio/iodio (NIS). Sono state eseguite la micro-dissezione e l’estrazione del DNA, la ricerca delle mutazioni di BRAF e RAS mediante PCR, PCR-SSCP (polymerase

DNA.207-209, 222 I soggetti coinvolti nello studio hanno dato il loro consenso informato, che è stato approvato dal comitato etico locale.

La coltura cellulare di ATC

Il tessuto neoplastico è stato finemente tritato in fette da 1 a 3 mm con forbici o bisturi. I frammenti sono stati lavati da tre a cinque volte nei mezzi di coltura M-199 (Sigma- Aldrich) integrati con 500’000 U/L di Penicillina (Sigma-Aldrich), 500'000 U/L di Streptomicina (Sigma-Aldrich) e 1’000'000 U/L di Nistatina (Sigma-Aldrich). Il tessuto tumorale è stato sospeso nel mezzo di coltura DMEM (Sigma-Aldrich) con siero fetale bovino al 10% ed incubato a 37 °C con CO2 al 5%. Le colture primarie hanno raggiunto la confluenza. In seguito, le cellule sono state staccate con una soluzione di tripsina e trasferite in beute per coltura dei tessuti primari (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, USA). Al terzo passaggio, le cellule sono state piastrate in Methocel per valutare l’efficienza di formazione delle colonie. Le colonie più grandi sono raccolte ed espanse in beaute per la coltura dei tessuti. Le cellule sono state utilizzate per i test al quarto passaggio. L’immunoistochimica ha dimostrato l’assenza di espressione del recettore del TSH, della TPO, della Tg e del NIS, mentre è stata ottenuta una positività parziale e focale alle citocheratine. La tecnica del DNA fingerprinting ha mostrato un pattern identico a quello del tessuto neoplastico originale.207-209

La coltura cellulare delle cellule follicolari tiroidee normali (TFC)

I tireociti sono state preparati come precedentemente riportato (Garcià-Lòpez et al. 2001, Antonelli et al. 2006). I campioni sono stati tritati con forbici e digeriti dalla collagenasi (1mg/mL; Roche) nel mezzo di coltura RPMI 1640 (Whittaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD, USA) per un’ora a 37 °C. I follicoli semi-digeriti sono stati rimossi, sedimentati per 2 minuti, lavati e coltivati nel mezzo RPMI 1640 integrato con FBS (siero fetale bovino; Seromed, Biochrom, Berlino, Germania) al 10% v/v, Glutammina 2 mM e 50 mg/mL di Penicillina/Streptomicina a 37 °C e CO2 al 5% in beute di plastica di 75 cm2 Sarstedt, Verona, Italia).222 L’immunoistochimica ha dimostrato l’espressione del recettore del TSH, della TPO, della Tg e del NIS.

La vitalità cellulare ed il saggio di proliferazione

Per determinare la proliferazione cellulare è stato utilizzato il saggio WST-1 (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands), un bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-

difeniltetrazolio usato nel saggio MTT.207, 208, 222 Sono stati aggiunti ai pozzetti (in quadruplice copia) CLM29 e CLM24 in un certo range di concentrazione per 24 ore ed è stata determinata la IC50 utilizzando l’interpolazione lineare. L’assorbanza è stata misurata dopo 2 ore dall’inizio della reazione del tetrazolo. Tutti gli esperimenti sono stati svolti tre volte per ogni preparazione cellulare.

Il saggio di proliferazione: la conta cellulare

La proliferazione è stata valutata anche utilizzando la conta del numero di cellule.207, 208, 222

La determinazione dell’apoptosi: l’assorbimento della soluzione di Hoechst

Le cellule di ATC sono state seminate (35’000 cellule/mL in un volume finale di 100 µL) in ogni pozzetto in un piatto di 96 pozzetti totali. Successivamente, le colture sono state incubate per 48 ore con CLM29 e CLM24 in un’atmosfera umidificata (37 °C, 5 % CO2) e colorate con la soluzione di Hoechst 33342.222 _{E’ stato calcolato l’indice apoptotico} (rapporto tra cellule apoptotiche e totali) x 100.

La determinazione dell’apoptosi: il saggio con annessina V

Le cellule sono state seminate nel Lab-Tek II Chamber Slide System (Nalge Nunc International), trattate per 48 ore con CLM29 o CLM24 e processate come descritto nella precedente letteratura.222

I saggi di migrazione ed invasione cellulare

La migrazione e l’invasione cellulare sono state determinate grazie ai Transwell Permeable Supports (Corning Life Sciences, Corning, NY, USA), in base alle istruzioni del produttore, con piccole modificazioni. Le cellule sono state lasciate per 5 ore in un mezzo di coltura privo di siero a 37 °C, 5 % CO2, raccolte utilizzando un tampone fosfato salino (PBS), una soluzione 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), ed è stato determinato il numero totale delle cellule. Le cellule sono state centrifugate e seminate (0,5 x 105 cellule/pozzetto) in un mezzo di coltura privo di siero.

Per il saggio di invasione cellulare, è stata utilizzata una soluzione con un estratto di membrana basale (BME; Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) per ricoprire gli inserti durante la notte (37 °C, 5 % CO2) prima della semina delle cellule. Successivamente, è stato aggiunto siero di vitello fetale 10 % v/v o un mezzo privo di siero ai pozzetti di ricezione e, dove indicato, sono state aggiunte concentrazioni crescenti di CLM29 e

CLM24 ad entrambe le camere Transwell. I mezzi di coltura sono stati rimossi ed è stata aggiunta una soluzione di Calceina AM (2 µg/mL; Sigma-Aldrich) per un’ora ai compartimenti inferiori. La fluorescenza intracellulare è stata misurata tramite un lettore di micropiastre a 96 pozzetti (ELISA reader) con filtri impostati a 485 nm per l’eccitazione e 520 nm per l’emissione. Per il saggio di migrazione ed invasione sono state usate rispettivamente 12 e 24 ore di incubazione.221

Al fine di convertire i valori della fluorescenza nel numero delle cellule migrate o invasive, è stata utilizzata una curva standard con differenti concentrazioni cellulari per ogni saggio.

Analisi dell’espressione del gene VEGF-A tramite Real-time PCR

Per valutare l’espressione del gene VEGF-A , sono state coltivate 2 x 104 cellule di ATC nei loro mezzi di coltura e trattate con CLM29 o CLM24 a differenti concentrazioni (50, 30, 10 µM) oppure lasciate solo con il mezzo di coltura stesso per 72 ore. E’ stata effettuata la trascrizione inversa dell’RNA e l’amplificazione del cDNA da parte della QRT-PCR mediante il sistema di rivelazione delle sequenze Applied Biosystems 7900HT. Il primer convalidato di VEGF-A proveniva da Applied Biosystems (Assay ID Hs00170236_m1).223 Le amplificazioni sono state normalizzate dalla gliceraldeide 3- fosfato deidrogenasi (GAPDH) e la quantificazione dell’espressione genica è stata eseguita utilizzando il calcolo del ΔΔCt ; la quantità del bersaglio è stata espressa come 2-ΔΔC_{t .}

Statistica

I dati sono riportati come media ± deviazione standard per variabili normalmente distribuite, altrimenti come mediana e range dell’interquartile. Gli esperimenti sono stati ripetuti 3 volte con le cellule di ciascun donatore. E’ riportata la media degli esperimenti nei 14 campioni provenienti da diversi donatori, sia per campioni normali che di ATC. I valori medi del gruppo sono stati comparati mediante ANOVA ad una via per variabili normalmente distribuite, altrimenti con i test di Mann- Whitney U o Kruskal-Wallis. Le proporzioni sono state comparate mediante test del Chi Square. I confronti post-hoc sulle variabili normalmente distribuite sono stati effettuati utilizzando il test di Bonferroni- Dunn. I dati relativi all’apoptosi sono stati analizzati con ANOVA ad una via con il test dei confronti multipli di Newman-Keuls.

1.4 Risultati

Studi in vitro sulla linea cellulare umana 8305C

CLM29 ha mostrato un effetto anti-proliferativo concentrazione-dipendente sulla linea cellulare immortalizzata 8305C con un IC50 di 19.63 ± 6.78 µM (fig. 15a). Anche CLM24 ha dimostrato un lieve, ma significativo, effetto anti-proliferativo sulla linea cellulare 8305C (IC50 di 80.32 ± 10.28 µM) (fig. 15b).

Figura 15: Saggio WST-1 (a 2 ore dall’inizio della reazione del tetrazolo; media ±

deviazione standard di tutti i campioni) nella cellule 8305C trattate con CLM29 (a) o CLM24 (b) per 24 ore. Le barre indicano la media ± deviazione standard. *P < 0.05 o minore versus controllo tramite test Bonferroni-Dunn.

Studi in vitro sulle cellule primarie

I saggi di proliferazione cellulare

I risultati del saggio WST-1 nelle cellule di ATC con (fig. 16a) o senza (fig. 16b) mutazione BRAFV600E hanno mostrato una significativa riduzione della proliferazione con CLM29 a 2 ore rispetto al controllo (P < 0.01, per entrambi, ANOVA). La conta cellulare ha confermato i risultati sopra menzionati a 2 ore. Il numero di cellule di ATC era di 19,830 ± 845/100 µL, per pozzetto; 15,666 ± 1120 (79%) con CLM29 5 µM; 9122 ± 923 (46%) con CLM29 10 µM; 7535 ± 960 (38%) con CLM29 30 µM; 4958 ± 1040 (25%) con CLM29 50 µM; (P < 0.01, ANOVA). Il valore di IC50 di CLM29, ottenuto utilizzando l’interpolazione lineare, è stato di 9 µM.

I risultati del saggio WST-1 con CLM29 nelle cellule follicolari tiroidee normali ha dimostrato una lieve, ma significativa, riduzione della proliferazione a 2 ore rispetto al controllo (P < 0.01, per entrambi, ANOVA) con CLM29 30 e 50 µM (dati non mostrati). La conta cellulare ha confermato i risultati sopra menzionati (dati non mostrati).

I risultati del saggio WST-1 nelle cellule di ATC senza mutazione BRAFV600E (fig. 17a) hanno mostrato una significativa riduzione della proliferazione con CLM24 rispetto al controllo a 2 ore (P < 0.01, per entrambi, ANOVA). La conta cellulare ha confermato i risultati sopra menzionati a 2 ore. Il numero di cellule di ATC era di 19,798 ± 920/100 µL, per pozzetto; 18,806 ± 978 (95%) con CLM24 10 µM; 16,123 ± 930 (81%) con CLM24 30 µM; 12,100 ± 985 (61%) con CLM24 50 µM; (P < 0.01, ANOVA). Il valore di IC50 di CLM24, ottenuto utilizzando l’interpolazione lineare, è stato di 74 µM.

I risultati relativi all’inibizione della proliferazione mediata da CLM24, ottenuta in cellule di ATC con la mutazione BRAFV600E_{, sono stati simili a quelli dei tumori senza BRAF}V600E (dati non mostrati). La conta cellulare ha confermato i risultati sopra menzionati (dati non mostrati).

Figura 16: Saggio WST-1 (a 2 ore dall’inizio della reazione del tetrazolo; media ±

deviazione standard di tutti i campioni) nella cellule primarie di ATC con (a) o senza (c) mutazione BRAFV600E trattate con CLM29 per 24 ore. Le barre indicano la media ± deviazione standard. *P < 0.05 o minore versus controllo tramite test Bonferroni-Dunn. Apoptosi nelle cellule primarie di ATC con (b) o senza (d) mutazione BRAFV600E trattate con CLM29 per 48 ore (media ± deviazione standard di tutti i campioni).

Figura 17: Saggio WST-1 (a 2 ore dall’inizio della reazione del tetrazolo; media ±

deviazione standard di tutti i campioni) nella cellule primarie di ATC senza mutazione BRAFV600E trattate con CLM24 per 24 ore (a). *P < 0.05 o minore versus controllo tramite test Bonferroni-Dunn. Apoptosi nelle cellule primarie di ATC senza mutazione BRAFV600E trattate con CLM24 per 48 ore (media ± deviazione standard di tutti i campioni) (b).

BRAF e la proliferazione

La mutazione BRAFV600E è stata osservata in tre campioni di ATC; RET/PTC1 e RET/PTC3 non sono stati rilevati dalla real-time PCR nelle cellule primarie di ATC. I risultati relativi all’inibizione della proliferazione mediata da CLM29 e CLM24, ottenuta nelle cellule di ATC provenienti da tumori con mutazione BRAFV600E, erano simili ai campioni provenienti da tumori senza mutazioni di BRAF (dati non mostrati). Non si sono osservate mutazioni di RAS.

Determinazione dell’apoptosi

La percentuale di cellule apoptotiche nelle colture primarie di ATC con mutazione BRAFV600E _{è aumentata in maniera dose dipendente (fig. 16b): dopo trattamento con} CLM29 10 µM, il 13% delle cellule erano in apoptosi e questa percentuale è aumentata al 18 e al 32% rispettivamente con CLM29 30 o 50 µM (P < 0.001; ANOVA). E’ stato usato il saggio con annessina V per confermare l’induzione dell’apoptosi cellulare (dati non mostrati).

La percentuale di cellule apoptotiche nelle colture primarie di ATC senza mutazione BRAFV600E è aumentata in maniera dose dipendente (fig. 16d): dopo trattamento con CLM29 10 µM, il 17.5% delle cellule erano in apoptosi e questa percentuale è aumentata al 27.6 e al 38.8% rispettivamente con CLM29 30 o 50 µM (P < 0.001; ANOVA). E’ stato usato il saggio con annessina V per confermare l’induzione dell’apoptosi cellulare (dati non mostrati).

La percentuale di cellule apoptotiche nelle colture primarie di ATC senza mutazione BRAFV600E è aumentata in maniera dose dipendente (fig. 17b): dopo trattamento con CLM24 10 µM, il 10% delle cellule erano in apoptosi e questa percentuale è aumentata al 16.2 e al 18.7% rispettivamente con CLM24 30 o 50 µM (P < 0.001; ANOVA). E’ stato usato il saggio con annessina V per confermare l’induzione dell’apoptosi cellulare (dati non mostrati).

I saggi di migrazione ed invasione cellulare

Le cellule di carcinoma anaplastico sono state coltivate in maniera subconfluente e trattate a concentrazioni crescenti di CLM29. La migrazione e l’invasione cellulare sono state testate nelle Transwell chambers (Corning Life Sciences) dimostrando un’inibizione della

migrazione (fig. 18a) e dell’invasione (fig. 18b) con CLM29 (P < 0.01), mentre CLM24 non ha mostrato alcun effetto significativo (dati non mostrati).

Figura 18: Migrazione (a) ed invasione (b) (testate con Transwell Permeable Supports;

Corning Life Science) nelle colture di cellule primarie di ATC trattate con concentrazioni crescenti di CLM29. Per testare la migrazione e l’invasione cellulare sono state necessarie rispettivamente 12 e 24 ore di incubazione. E’ stata osservata un’inibizione della migrazione e dell’invasione con CLM29 10 µM e 30 µM. Le barre rappresentano la media ± deviazione standard. *P < 0.05 per CLM29 rispetto al siero di vitello fetale (=controllo) con test di Newman-Keuls. CLM29 1 µM = 10 % siero di vitello fetale + CLM29 1 µM; CLM29 5 µM = 10 % siero di vitello fetale + CLM29 5 µM; CLM29 10 µM = 10 % siero di vitello fetale + CLM29 10 µM; CLM29 30 µM = 10 % siero di vitello fetale + CLM29 30 µM.

CLM29 inibisce l’espressione di VEGF-A nelle cellule di ATC

Dopo 72 ore di esposizione, CLM29 ha ridotto significativamente l’espressione di VEGF- A nelle cellule di ATC; in particolare, CLM29 ad alte concentrazioni ha ridotto significativamente l’espressione di VEGF-A (P < 0.05; fig. 19), mentre CLM24 non ha mostrato alcun effetto significativo (dati non mostrati).

Figura 19: Espressione del gene VEGF-A dopo trattamento per 72 ore con CLM29 (50,

30, 10 µM) nelle cellule di ATC (media ± deviazione standard di tutti i campioni). Le barre rappresentano la media ± deviazione standard. *P < 0.05 versus controllo.

1.5 Discussione

I derivati delle pirazolo[3,4-d]pirimidine, CLM29 ed, in maniera minore, CLM24, sono nuovi composti inibitori multi-target delle tirosin-chinasi, che si sono rivelati capaci di inibire in vitro la proliferazione della linea cellulare 8305C e delle cellule primarie di ATC e di aumentare il numero di cellule apoptotiche. L’effetto inibitorio di CLM29 e CLM24 nelle colture primarie di ATC è stato indipendente dalla presenza della mutazione di BRAF.

I primi studi sull’efficacia delle pirazolo[3,4-d]pirimidine nel carcinoma tiroideo sono stati effettuati su PP1,224 PP2225 e Si34.226 Sono stati descritti potenti effetti inibitori di PP1 sulla chinasi RET.224 PP2 si è dimostrata capace di ridurre il signaling della via delle MAP chinasi mediato da RET/PTC1. Inoltre, PP2 è in grado di inibire la proliferazione e l’invasività del fenotipo di cellule di carcinoma tiroideo mediato da riarrangiamenti di RET/PTC1.225 Tuttavia, PP2 si è rivelata non selettiva per RET, essendo un buon inibitore di c-Src e delle relative chinasi.227 Quindi, non è stato possibile escludere effetti addizionali indiretti di PP2 in vivo mediati dall’inibizione di altre chinasi. Lo stesso vale anche per Si34,226 i cui effetti inibitori su due linee cellulari tumorali umane derivate dal carcinoma midollare della tiroide, chiamate TT e MZ-CRC-1, sono dovuti all’inibizione della tirosin-chinasi c-Src.

In seguito a questi studi, Antonelli et al. hanno prospettato l’utilizzo di nuovi derivati delle pirazolo[3,4-d]pirimidine (CLM3 e CLM29) nel trattamento del cancro tiroideo.218 CLM3 e CLM29 si sono rivelati capaci di ridurre significativamente la proliferazione di cellule di carcinoma papillare sdifferenziato (DePTC) in vitro aumentandone l’apoptosi, e di inibire la migrazione delle stesse cellule, indipendentemente dalla presenza della mutazione di BRAF.218 Inoltre, CLM3 ha dimostrato di ridurre la crescita tumorale in modelli murini xenotrapiantati con cellule di PTC sdifferenziato.218 Questi risultati hanno prospettato l’utilizzo di CLM3 e CLM29 nel trattamento dell’ATC. CLM3 si è mostrato attivo contro l’ATC riducendone la proliferazione cellulare ed aumentandone l’apoptosi delle cellule primarie in vitro, inibendo la migrazione e l’invasione cellulare e riducendo la crescita tumorale in modelli murini xenotrapiantati con cellule di ATC.221 L’azione di CLM29, e di CLM24, nei confronti dell’ATC è l’oggetto di studio di questa tesi.

E’ interessante osservare che l’azione anti-proliferativa di CLM29 e CLM24 sulle cellule primarie di ATC da noi utilizzate è indipendente dalla presenza delle mutazioni di BRAF. Questi risultati sono in accordo con il principio per cui CLM29 e CLM24 sono proposte come inibitori di varie vie di trasduzione del segnale (comprese la tirosin-chinasi RET, EGFR, VEGFR) e come inibitori dell’angiogenesi.220 E’ stato riportato come gli effetti delle molecole inibitori delle tirosin-chinasi potrebbero essere superati dall’attivazione compensatoria di altre chinasi.228 Un possibile vantaggio degli inibitori multi-chinasici è l’abilità di bloccare più di una singola chinasi e quindi aggirare questo meccanismo di resistenza.229, 230

L’attività anti-neoplastica di CLM29 potrebbe essere il risultato della combinazione dell’effetto anti-proliferativo associato con l’aumento dell’apoptosi nelle cellule tumorali,

processo che include la capacità di inibire la fosforilazione di ERK 1/2 e la neo- vascolarizzazione neoplastica. Questi effetti sono stati dimostrati in vivo.218 Inoltre, è stata osservata una significativa diminuzione dell’espressione genica di VEGF nelle cellule di ATC in seguito al trattamento con CLM29.

I valori di IC50 di CLM29 per la proliferazione cellulare (19.63 ± 6.78 e 9 µM rispettivamente della linea cellulare 8305C e delle cellule primarie di ATC) erano simili a quelli dei derivati dal 2-indolinone, che ha circa 30 µmol/L,231 _{e più alti di quelli di} ZD6474 (1 µmol/L)232, o di PP1224 e PP2225 (< 5 µmol/L) (valutato in linee cellulari umane di carcinoma tiroideo). Tuttavia, CLM29219 è completamente equipotente a Cabozantinib233 in altre linee cellulari di carcinoma tiroideo. In aggiunta, quando CLM29 è stato testato su HMVEC-d, ha inibito la proliferazione cellulare manifestando un’efficacia funzionale (IC50 10.2 ± 3.3 nM) significativamente più alta219 di quella mostrata da Vandetanib (7.1 µM),234 rinforzando la convinzione che possieda una forte attività anti- angiogenetica.

L’oggetto della tesi è il primo studio, a nostra conoscenza, che ha valutato l’effetto anti- neoplastico di CLM29 e CLM24 nelle cellule primarie umane di ATC.

Ci sono ancora alcune limitazioni nell’utilizzo selettivo di nuovi composti. Tuttavia, la possibilità di testare la sensibilità delle cellule primarie di ATC, ottenute da ciascun soggetto, ai differenti inibitori delle tirosin-chinasi potrebbe migliorare l’efficacia dei trattamenti.207, 235 Infatti, attraverso le cellule tumorali umane, si può effettuare uno screening dell’efficacia dei farmaci in vitro nei confronti della malattia con un valore predittivo per l’atttività delle risposte cliniche236, 237 e probabilmente utile per prevenire la somministrazione di chemioterapici inattivi ai pazienti.238 I test di chemiosensibilità in vitro hanno dato una previsione dell’efficacia in vivo nel 60% dei casi,208 mentre c’è un’associazione nel 90% dei casi tra test di chemiosensibilità in vitro negativo ed inefficacia della chemioterapia in vivo;237 questo potrebbe permettere di evitare la somministrazione di farmaci inattivi ai pazienti. Fino ad oggi, le colture primarie di cellule di carcinoma tiroideo sono state ottenute mediante biopsie chirurgiche eseguite per procedure terapeutiche o diagnostiche. Recentemente, è stata dimostrata la possibilità di superare questo problema utilizzando la citologia dell’agoaspirato (FNA) ottenendo così colture cellulari primarie da campioni di FNA di ATC (FNA-ANA); questo apre la strada all’uso di FNA-ANA per testare la sensibilità a diversi farmaci in ogni paziente, evitando

inutili procedure chirurgiche e la somministrazione di terapie inattive.205-209, 218, 219, 221, 239- 242

In conclusione, i risultati mostrati in questa tesi mostrano un interessante effetto anti- tumorale di CLM29 e CLM24, non su linee di cellule continue, che sono abbastanza