Materiali e metodi

Sono stati arruolati da marzo 2016, presso l’Unità di Gastroenterologia Universitaria di Pisa, pazienti consecutivi con sintomatologia tipica di reflusso gastro-esofageo (GERD) e assenza di lesioni in esofago, che si recavano per eseguire esami di fisiopatologia esofagea.

I criteri di inclusione sono stati: pirosi con o senza rigurgito presente per almeno 3 giorni a settimana per un periodo complessivo di almeno 3 mesi negli ultimi 12. Criteri di esclusione sono stati: gravidanza (esclusa mediante test urinario), allattamento, disturbi della condotta alimentare, storia di chirurgia toracica, esofagea o gastrica, pregressa diagnosi di neoplasia, diagnosi di acalasia o sclerodermia, disturbi psichiatrici, uso cronico di antiinfiammatori non steroidei.

Tutti i pazienti hanno firmato un consenso informato.

Lo studio è stato disegnato e condotto in accordo con la dichiarazione di Helsinki (6a edizione Seoul 2008).

Tutti i pazienti avevano precedentemente eseguito endoscopia superiore, in assenza di terapia concomitante con inibitori di pompa protonica (PPI) o anti H2 per escludere la presenza di esofagite erosiva.

Tutti i pazienti sono stati valutati mediante anamnesi ed esame obbiettivo oltre che registrazione di eventuali terapie, consumo di tabacco, alcool e caffè. Oltre alla storia clinica è stato compilato un questionario specifico per i sintomi GERD correlati (GERDQ101)

Tutti i pazienti sono stati sottoposti a HRM e MII-pH delle 24 ore previa sospensione per almeno venti giorni della terapia con antisecretivi (PPI e anti H2). Durante questo periodo i pazienti potevano assumere arginato al bisogno per controllare i sintomi da reflusso102_.

Il protocollo di HRM prevedeva una registrazione basale per almeno 30 sec senza deglutizioni, 10 deglutizioni standard eseguite con 5 ml di acqua in posizione supina e a seguire 10 multiple rapid swallow (MRS).

I MRS sono stati eseguiti con un totale di 10 ml di acqua, chiedendo al paziente di eseguire 5 deglutizioni consecutive da 2 ml ciascuna, in meno di 10 sec.

Tutti i pazienti sono stati quindi sottoposti a MII-pH al termine dell’esame di HRM mediante posizionamento di un sondino naso-esofageo contenente sette sensori (sei canali) di impedenza ed un canale di pH.

Manometria ad alta risoluzione e test provocativi

Come descritto, tutti i pazienti sono stati sottoposti ad HRM dopo un periodo di digiuno di almeno 6 ore utilizzando un sondino di 4.2 mm di diametro per manometria allo stato solido contenente 36 sensori pressori separati 1 cm l’uno dall’altro (Medtronic Inc, Shoreview, MN, US).

Il protocollo HRM includeva 30 sec di registrazione basale durante la quale è stato chiesto al paziente di non deglutire per l’identificazione delle due aree ad alta pressione (UES, EGJ).

A seguire sono stati eseguite 10 deglutizioni singole (SS) con 5 ml di acqua intervallate da almeno 20-30 sec di pausa senza deglutizioni.

Il protocollo è stato eseguito in accordo con le linee guida italiane per l’HRM103. Tutti i tracciati sono stai analizzati mediante il Manoview Analisys Software V3.0 (Medtronic). Durante l’analisi sono state identificate le due zone ad alta pressione EGJ e UES ed è stata valutata l’onda di contrazione peristaltica mediante il Clouse Plot generato dal Software. Per ciascuna deglutizione sono stati valutati il DCI, la DL e l’IRP in accordo con la classificazione di Chicago.

Sono stati eseguiti un totale di 10 MRS per ciascun paziente.

Per ogni MRS registrato sono stati valutati sia la presenza di inibizione del corpo esofageo sia la presenza di risposta contrattile al termine dell’ultima di ciascuna serie di cinque deglutizioni.

L’inibizione del corpo esofageo è stata definita anormale in caso di aree di contrazioni a livello dell’EB maggiori di 3 cm utilizzando il contorno isobarico di 20 mmHg in presenza di onde contrattili con DCI >100mmHg-s-cm.

La risposta contrattile è stata descritta come la presenza di onde peristaltiche con un DCI > 100mmHg-s-cm.

Per valutare la presenza di riserva peristaltica è stato considerato il MRS/SS ratio considerando il valore medio dei dieci MRS e il valore medio dei dieci SS. E’stato inoltre valutato lo stesso MRS/SS ratio considerando il miglior MRS e il miglior SS (DCI più elevato).

E’stato quindi valutato il numero di MRS che avessero un valore tale da generare un MRS/SS ratio > 1 utilizzando come denominatore il valore medio delle SS.

Analisi de dati della MII-pH

Tutte le MII-pH sono state condotte per una durata di 23 (±1) ore di analisi. Durante il test tutti i pazienti hanno consumato solamente tre pasti (pranzo alle ore 13, cena alle ore 20 e colazione alle ore 8) sulla base di una dieta mediterranea standard104. L’analisi è stata condotta per tutti i tracciati manualmente e il periodo dei pasti è stato escluso dal tempo totale di analisi.

Sono stati definiti acidi i reflussi che presentavano una caduta di pH < 4; sono stati definiti debolmente acidi i reflussi con 4 ≤ pH < 7 e infine debolmente alcalini i reflussi con un pH ≥ 7.

I reflussi sono stati definiti da un punto di vista impedenziometrico come la caduta del valore di impedenza di almeno il 50% rispetto al valore basale con andamento retrogrado in almeno due canali successivi partendo dal canale più distale.

La correlazione sintomo-reflusso è stata definita mediante l’utilizzo del symptom index (positivo se > 50 %) ottenuto dal rapporto fra il numero di sintomi associati a reflusso e numero di sintomi totali durante le 24 ore di analisi.

I pazienti sono stati definiti come NERD quando presentavano un tempo di esposizione all’acido (AET) > di 4.2% con un pH < 4 e un numero di reflussi superiore a 54; sono stati invece definiti come HE quando presentavano un numero di reflussi nei limiti ed un AET < 4.2% ma una correlazione positiva fra sintomi e reflussi definiti sulla base del symptom index.

Analisi statistica

Tutti i valori sono stati espressi come media e deviazione standard. La comparazione fra MRS e SS è stata fatta mediante student T-test.

E’stato inoltre eseguito il test di correlazione lineare di Pearson per analizzare la variabilità degli SS e dei MRS rispettivamente.

7.3 Risultati

Sono stati arruolati un totale di 37 pazienti con età media (± ds) di 52.9 anni (± 13.7). Il rapporto maschi/femmine era 0,54 (maschi = 13, femmine = 24). Il numero di consumatori abituali di caffè (almeno 1/die) era pari a 24 (65.9%); in 16 (43.2%) riferivano un consumo di alcool regolare ai pasti (almeno 1U/die); 8 (21,6%) erano fumatori (più di 5sigarette/die).

Tutti i pazienti (100%) riferivano pirosi retrosternale, mentre solo 11 pazienti (29.7%) riferivano rigurgito e 3 (8.1%) dolore toracico. Tutti i pazienti risultavano non-responder alla terapia con PPI.

Dall’analisi dei dati della MII-pH abbiamo osservato: 17 pazienti (45.9%) erano affetti da malattia da reflusso non-erosiva (NERD) e presentavano un AET medio di 7.9±3.2% con un numero di reflussi medio di 77.3±25.8; a 12 (32.4%) pazienti è stata diagnosticata ipersensibilità esofagea (HE) dal momento che presentavano AET medio 3.1±1.2% con un numero di reflussi nei limiti (39.5± 9.7) ma una correlazione positiva (SI positivo nel 100% dei casi) fra sintomi e reflussi; 8 (21.6%) pazienti sono stati diagnosticati come pirosi funzionale (FH) in quanto non mostravano i criteri fisiopatologici di GERD sia in termini di esposizione all’acido (AET medio 1.1±0.4%) che di numero di reflussi (valore medio 19.8±11.5) con totale assenza di correlazione fra sintomi e reflussi.

Dai risultati della HRM in 31 casi l’esame è risultato nei limiti della norma ed in 6 casi è stata posta diagnosi di ineffective esophageal motility (IEM).

La pressione media ed espiratoria della giunzione esofago-gastrica è risultata nei limiti della norma in 35/37 (94.6%) pazienti (P basale media 27.4±11.9 e P espiratoria media 13.5±9.3 mmHg). Il rilasciamento post deglutitorio è risultato coordinato e completo in tutti i pazienti (IRP medio 11.6 mmHg). La latenza distale è risultata nei limiti (DL media 5.9 sec) e non sono stati descritti casi di contrazione esofagea precoce.

Tutti i pazienti sono riusciti a completare il test del MRS per 10 volte. I valori ottenuti durante i MRS sono risultati statisticamente superiori a quelli ottenuti durante le SS sia come valore medio (p=0.005) che come valore mediano (p=0.013). In 31/37 (83.8%) pazienti il valore del MRS/SS ratio risultava superiore a 1. Tutti i pazienti che presentavano un MRS/SS ratio < 1 era stata effettuata la diagnosi di

ineffective esophageal motility. I risultati dei valori medi di confronto delle SS e dei MRS sono riportati in tabella 1.

SS MRS P Media (± ds) 1502.9±1131.1 2475.3±1731.3 0.005 Mediana 1446.4 1888.6 0.013 Range interquartile 1155.7-1768.3 1459.7-2231.5 Deboli 55/370 (14.9%) 33/370 (8.9%) 0.012 Fallite 9/370 (2.4%) 3/370 (0.8%) 0.081

Tabella 2: valori di media, deviazione standard, mediana, ed interquartile range delle SS e delle MRS  

Dal confronto diretto delle singole deglutizioni (da SS1 ad SS10) con i MRS (da MRS1 a MRS10) questi ultimi sono risultati in tutti i casi superiori per valore di DCI (mmHg-s-cm) (p=0.003). In Figura 1 è stata riportata la rappresentazione grafica del confronto diretto delle SS con i MRS.

  Figura 14: rappresentazione grafica delle singole SS e delle successive MRS nella serie dei 37

Inoltre mediante il test di Pearson è stata dimostrata una relazione diretta fra le SS e le MRS (p< 0.001) a seguito riportato in Figura 2.

Figura 15: correlazione lineare di Pearson fra le single swallow e le multiple rapid swallow.  

Come ultima analisi abbiamo valutato quante volte il valore di DCI ottenuto con le MRS superava quello delle SS tale da dare un MRS/SS ratio >1. A conferma della capacità delle MRS di evocare la riserva contrattile dell’esofago abbiamo osservato che complessivamente nel 89.3% dei casi la MRS risultavano superiori per valore di DCI alle SS. Da una ulteriore stratificazione abbiamo osservato che nei soggetti con FH il valore di riproducibilità era del 99%, nei soggetti con HE era del 91% e nei soggetti con GERD non-erosiva era del 78%.

A conseguenza di questo è stato valutato statisticamente per ogni singolo paziente quale fosse il numero minimo di MRS da eseguire per ottenere delle contrazioni adeguate e studiare con efficacia la riserva contrattile dell’esofago. Il valore ottenuto è stato matematicamente di 3.88±0.8. Per tale ragione è stato possibile concludere che il numero raccomandabile di MRS da eseguire per ottenere un valido studio della

7.4 Discussione

I MRS rappresentano un test provocativo per valutare la riserva esofagea residua2, 105. La contrazione peristaltica evocata dalla deglutizione consiste in un'onda di inibizione seguita da un'onda di contrazione muscolare. L'onda di inibizione che precede la contrazione peristaltica è chiamata “inibizione deglutitoria”. La durata dell'inibizione deglutitoria associata alla deglutizione aumenta distalmente lungo tutta l’estensione dell’esofago ed è regolata da meccanismi centrali e periferici. Il meccanismo centrale coinvolge istantaneamente l’attivazione delle fibre vagali inibitorie e viene trasmesso a tutti i livelli dell'esofago in modo che l'esofago in tutta la sua lunghezza venga inibito prontamente all’inizio dell’atto deglutitorio. Il meccanismo periferico, che coinvolge i neuroni inibitori mioenterici, si realizza mediante il rilascio di ossido nitrico (NO).

L'inibizione deglutitoria è immediatamente seguita da una fase eccitatoria che si manifesta con la contrazione del corpo esofageo. Studi sperimentali hanno dimostrato che la stimolazione diretta dei nervi inibitori provoca l'inibizione della muscolatura liscia del corpo esofageo che a sua volta è seguita da una contrazione. Il meccanismo di contrazione è sempre mediato da vie efferenti vagali e si realizza mediante un’attivazione colinergica29.

Quando le deglutizioni avvengono in rapida successione, non si attiva alcun tipo di attività contrattile di tipo peristaltico fino a quanto non è stata completata l’ultima deglutizione. Questo in dettaglio avviene perché ogni atto deglutitorio genera un’onda inibitoria che blocca l’attivazione peristaltica propulsiva dell’onda precedente. Lo sfintere esofageo inferiore si inibisce (rilasciamento) dall’attivazione della prima deglutizione e rimane inibito durante tutta la serie di deglutizioni indipendentemente dal loro numero. Vantrappen e Hellemans2 sono stati i primi a analizzare ampiamente il fenomeno dell'inibizione deglutitoria sia su cavia che in umano.

Il MRS provoca una profonda inibizione neurale sia centrale che periferica con conseguente assenza di contrazioni nella porzione muscolatura liscia dell'esofago accompagnata da una prolungata e completa inibizione del LES. L'ultima deglutizione della serie (durante MRS) è seguita da una potente contrazione del corpo esofageo che in valore assoluto risulta più ampia (mmHg) delle singole deglutizioni isolate2, 105-108_.

Lo scopo dello studio di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare, in un gruppo di soggetti con sintomatologia GERD correlata, la riproducibilità dei MRS durante la manometria ad alta risoluzione. Per ottenere questo risultato abbiamo eseguito un numero di MRS pari al numero di SS che devono essere eseguite durante una manometria esofagea sia standard che HRM. I nostri risultati hanno evidenziato che complessivamente i valori della contrazione peristaltica (DCI) ottenuti durante gli MRS erano nettamente superiori ai valori delle SS. Inoltre i nostri dati hanno dimostrato una correlazione lineare diretta (r=0.893; p<0.001) fra i MRS e le SS. Un lavoro precedente del gruppo di Prakash Gyawali, dell’Università di St. Luis in Minnesota, ha dimostrato che nei soggetti sani asintomatici gli MRS nel 97% dei casi generavano delle onde peristaltiche di ampiezza superiore a quella delle SS107.

Lo stesso gruppo di lavoro ha evidenziato che i soggetti che presentavano un MRS scarso o inefficace sviluppavano precocemente disfagia se sottoposti ad intervento chirurgico di plastica anti-reflusso105.

Un lavoro precedente del gruppo del Prof. Marchi ha dimostrato che nei soggetti affetti da GERD erosiva e non-erosiva, il valore degli MRS (3 MRS per ogni paziente) era inferiore ad un gruppo di pazienti con sintomi da GERD ma assenza di esposizione patologica all’acido nelle 24-h108.

Recentemente il gruppo di Chicago del Prof. John Pandolfino, ha dimostrato la possibilità di studiare la riserva di contrazione esofagea nei soggetti con sclerodermia mediante l’utilizzo dei MRS (2 MRS per paziente)109_.

Nonostante i dati acquisiti sulla metodica, tutti gli studi differiscono fra di loro per il numero di MRS eseguiti dopo lo studio delle 10 SS previste per completare un esame di manometria esofagea.

Questo è il primo lavoro che studia su un gruppo di soggetti con sintomi GERD correlati il numero più adatto di MRS da eseguire per ottenere una risposta contrattile efficiente e riproducibile.

Tenendo in considerazione che i soggetti con GERD possono avere una parziale riduzione della forza contrattile dovuta all’esposizione cronica all’acido108, abbiamo potuto osservare che i soggetti con un valore di DCI più basso necessitano di un numero più elevato di MRS per osservare almeno un MRS con valore superiore alla media delle SS. Questo dato ci ha permesso di evidenziare che se nei soggetti FH la riproducibilità dell’esame è del 99%, nei soggetti con HE del 91%, questa può

una riproducibilità del 89.3%. Pertanto, se nei soggetti che non presentano alterazioni primarie della peristalsi e/o non hanno alterazioni dell’esposizione cronica all’acido la riproducibilità è del test è elevatissima, questa si riduce lievemente nei soggetti con GERD non-erosiva.

Sulla base dei nostri dati riteniamo che un numero di MRS pari a 3-4 a completamento di ogni esame di manometria esofagea HR sia raccomandabile per meglio valutare la riserva contrattile esofagea residua.

8 BIBLIOGRAFIA

1.   Gyawali  CP,  Bredenoord  AJ,  Conklin  JL,  Fox  M,  Pandolfino  JE,  Peters  JH,  et   al.   Evaluation   of   esophageal   motor   function   in   clinical   practice.   Neurogastroenterology   and   motility   :   the   official   journal   of   the   European   Gastrointestinal  Motility  Society.  2013;  25(2):  99-­‐133.  

2.   Fornari  F,  Bravi  I,  Penagini  R,  Tack  J,  Sifrim  D.  Multiple  rapid  swallowing:   a   complementary   test   during   standard   oesophageal   manometry.   Neurogastroenterology   and   motility   :   the   official   journal   of   the   European   Gastrointestinal  Motility  Society.  2009;  21(7):  718-­‐e41.  

3.   Anastasi  G.  Trattato  di  anatomia  umana.  4.a  ed.  Milano:  Edi.  Ermes;  2006.   4.   Miller   L,   Clave   P,   Farre   R,   Lecea   B,   Ruggieri   MR,   Ouyang   A,   et   al.   Physiology   of   the   upper   segment,   body,   and   lower   segment   of   the   esophagus.   Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences.  2013;  1300:  261-­‐77.  

5.   Crist   J,   Gidda   JS,   Goyal   RK.   Intramural   mechanism   of   esophageal   peristalsis:   roles   of   cholinergic   and   noncholinergic   nerves.   Proceedings   of   the   National   Academy   of   Sciences   of   the   United   States   of   America.   1984;   81(11):   3595-­‐9.  

6.   Gidda   JS,   Goyal   RK.   Regional   gradient   of   initial   inhibition   and   refractoriness   in   esophageal   smooth   muscle.   Gastroenterology.   1985;   89(4):   843-­‐51.  

7.   Yazaki   E,   Sifrim   D.   Anatomy   and   physiology   of   the   esophageal   body.   Diseases   of   the   esophagus   :   official   journal   of   the   International   Society   for   Diseases  of  the  Esophagus  /  ISDE.  2012;  25(4):  292-­‐8.  

8.   Mittal  RK.  Motor  Function  of  the  Pharynx,  Esophagus,  and  its  Sphincters.   San  Rafael  (CA);  2011.  

9.   Yuan  S,  Costa  M,  Brookes  SJ.  Neuronal  pathways  and  transmission  to  the   lower  esophageal  sphincter  of  the  guinea  Pig.  Gastroenterology.  1998;  115(3):   661-­‐71.  

10.   Aziz   Q,   Rothwell   JC,   Barlow   J,   Hobson   A,   Alani   S,   Bancewicz   J,   et   al.   Esophageal  myoelectric  responses  to  magnetic  stimulation  of  the  human  cortex   and   the   extracranial   vagus   nerve.   The   American   journal   of   physiology.   1994;   267(5  Pt  1):  G827-­‐35.  

11.   Christensen   J,   Stiles   MJ,   Rick   GA,   Sutherland   J.   Comparative   anatomy   of   the   myenteric   plexus   of   the   distal   colon   in   eight   mammals.   Gastroenterology.   1984;  86(4):  706-­‐13.  

12.   Meyer  GW,  Austin  RM,  Brady  CE,  3rd,  Castell  DO.  Muscle  anatomy  of  the   human  esophagus.  Journal  of  clinical  gastroenterology.  1986;  8(2):  131-­‐4.  

13.   Kronecker   H,   Meltzer   SJ.   Der   Schluckmechanismus,   seine   Erreggnung   und  seine  Hemmung.  Arch  Anat  Physiol  Physiol  Abt.  1883:  328-­‐60.  

14.   Ingelfinger   FJ.   Esophageal   motility.   Physiological   reviews.   1958;   38(4):   533-­‐84.  

15.   Cohen  BR,  Wolf  BS.  Cineradiographic  and  intraluminal  correlations  in  the   pharynx  and  esophagus.  In:  Code  CF,  editor.  Handbook  of  Physiology  Section  6   Alimentary   Canal   Vol   IV   Motility.   Washington,   DC:   American   Physiological   Society;  1968.  p.  1841–60.  

16.   Dodds  WJ,  Christensen  J,  Dent  J,  Arndorfer  RC,  Wood  JD.  Pharmacologic   investigation   of   primary   peristalsis   in   smooth   muscle   portion   of   opossum  

17.   Richter   JE,   Wu   WC,   Johns   DN,   Blackwell   JN,   Nelson   JL,   Castell   JA,   et   al.   ESOPHAGEAL   MANOMETRY   IN   95   HEALTHY   ADULT   VOLUNTEERS   -­‐   VARIABILITY   OF   PRESSURES   WITH   AGE   AND   FREQUENCY   OF   ABNORMAL   CONTRACTIONS.  Digestive  diseases  and  sciences.  1987;  32(6):  583-­‐92.  

18.   Bardan  E,  Xie  P,  Aslam  M,  Kern  M,  Shaker  R.  Disruption  of  primary  and   secondary   esophageal   peristalsis   by   afferent   stimulation.   American   journal   of   physiology  Gastrointestinal  and  liver  physiology.  2000;  279(2):  G255-­‐61.  

19.   Christensen   J.   Mechanisms   of   secondary   esophageal   peristalsis.   The   American  journal  of  medicine.  1997;  103(5A):  44S-­‐6S.  

20.   Goyal  RK,  Gidda  JS.  Relation  between  electrical  and  mechanical  activity  in   esophageal  smooth  muscle.  The  American  journal  of  physiology.  1981;  240(4):   G305-­‐11.  

21.   Rattan   S,   Gidda   JS,   Goyal   RK.   Membrane   potential   and   mechanical   responses   of   the   opossum   esophagus   to   vagal   stimulation   and   swallowing.   Gastroenterology.  1983;  85(4):  922-­‐8.  

22.   Sugarbaker   DJ,   Rattan   S,   Goyal   RK.   Mechanical   and   electrical   activity   of   esophageal   smooth   muscle   during   peristalsis.   The   American   journal   of   physiology.  1984;  246(2  Pt  1):  G145-­‐50.  

23.   Peterson   DK,   Stellato   T,   Nochomovitz   ML,   DiMarco   AF,   Abelson   T,   Mortimer  JT.  Electrical  activation  of  respiratory  muscles  by  methods  other  than   phrenic   nerve   cuff   electrodes.   Pacing   and   clinical   electrophysiology   :   PACE.   1989;  12(5):  854-­‐60.  

24.   Meyer  GW,  Gerhardt  DC,  Castell  DO.  Human  esophageal  response  to  rapid   swallowing:   muscle   refractory   period   or   neural   inhibition?   The   American   journal  of  physiology.  1981;  241(2):  G129-­‐36.  

25.   Vanek   AW,   Diamant   NE.   Responses   of   the   human   esophagus   to   paired   swallows.  Gastroenterology.  1987;  92(3):  643-­‐50.  

26.   Sifrim  D,  Janssens  J,  Vantrappen  G.  A  wave  of  inhibition  precedes  primary   peristaltic   contractions   in   the   human   esophagus.   Gastroenterology.   1992;   103(3):  876-­‐82.  

27.   Pandolfino   JE,   Shi   G,   Zhang   Q,   Kahrilas   PJ.   Absence   of   a   deglutitive   inhibition  equivalent  with  secondary  peristalsis.  American  journal  of  physiology   Gastrointestinal  and  liver  physiology.  2005;  288(4):  G671-­‐6.  

28.   Cook   IJ,   Dodds   WJ,   Dantas   RO,   Massey   B,   Kern   MK,   Lang   IM,   et   al.   OPENING   MECHANISMS   OF   THE   HUMAN   UPPER   ESOPHAGEAL   SPHINCTER.   American  Journal  of  Physiology.  1989;  257(5):  G748-­‐G59.  

29.   Goyal   RK,   Chaudhury   A.   Physiology   of   normal   esophageal   motility.   Journal  of  clinical  gastroenterology.  2008;  42(5):  610-­‐9.  

30.   Christensen  J,  Lund  GF.  Esophageal  responses  to  distension  and  electrical   stimulation.  The  Journal  of  clinical  investigation.  1969;  48(2):  408-­‐19.  

31.   Weisbrodt  NW,  Christensen  J.  Gradients  of  contractions  in  the  opossum   esophagus.  Gastroenterology.  1972;  62(6):  1159-­‐66.  

32.   Crist  J,  Gidda  JS,  Goyal  RK.  Characteristics  of  "on"  and  "off"  contractions   in   esophageal   circular   muscle   in   vitro.   The   American   journal   of   physiology.   1984;  246(2  Pt  1):  G137-­‐44.  

33.   Mukhopadhyay   AK,   Weisbrodt   NW.   Neural   organization   of   esophageal   peristalsis:  role  of  vagus  nerve.  Gastroenterology.  1975;  68(3):  444-­‐7.  

34.   Gidda   JS,   Cobb   BW,   Goyal   RK.   Modulation   of   esophageal   peristalsis   by   vagal   efferent   stimulation   in   opossum.   The   Journal   of   clinical   investigation.   1981;  68(6):  1411-­‐9.  

35.   Gidda   JS,   Goyal   RK.   Influence   of   successive   vagal   stimulations   on   contractions   in   esophageal   smooth   muscle   of   opossum.   The   Journal   of   clinical   investigation.  1983;  71(5):  1095-­‐103.  

36.   Goyal   RK.   Letter:   Does   gastrin   act   via   cholinergic   neurons   to   maintain   basal   lower   esophageal   sphincter   pressure?   The   New   England   journal   of   medicine.  1974;  291(16):  849-­‐50.  

37.   Christensen   J,   Conklin   JL,   Freeman   BW.   Physiologic   specialization   at   esophagogastric  junction  in  three  species.  The  American  journal  of  physiology.   1973;  225(6):  1265-­‐70.  

38.   Goyal   RK,   Rattan   S.   Genesis   of   basal   sphincter   pressure:   effect   of   tetrodotoxin   on   lower   esophageal   sphincter   pressure   in   opossum   in   vivo.   Gastroenterology.  1976;  71(1):  62-­‐7.  

39.   Asoh   R,   Goyal   RK.   Electrical   activity   of   the   opossum   lower   esophageal   sphincter   in   vivo.   Its   role   in   the   basal   sphincter   pressure.   Gastroenterology.   1978;  74(5  Pt  1):  835-­‐40.  

40.   Szymanski   PT,   Szymanska   G,   Goyal   RK.   Differences   in   calmodulin   and   calmodulin-­‐binding   proteins   in   phasic   and   tonic   smooth   muscles.   American   journal  of  physiology  Cell  physiology.  2002;  282(1):  C94-­‐C104.  

41.   Goyal   RK,   Rattan   S.   Nature   of   the   vagal   inhibitory   innervation   to   the   lower   esophageal   sphincter.   The   Journal   of   clinical   investigation.   1975;   55(5):   1119-­‐26.  

42.   Tottrup   A,   Knudsen   MA,   Gregersen   H.   The   role   of   the   L-­‐arginine-­‐nitric