2.1 Criteri d’arruolamento dei pazienti
Nello studio sono stati inclusi due gruppi di pazienti:
• il primo costituito da pazienti non affetti da patologie ematologiche, sottoposti ad interventi ortopedici di protesi d’anca (“gruppo controllo”);
• il secondo formato da pazienti con recente diagnosi di Mieloma Multiplo, mai trattato in precedenza, o con malattia in fase di recidiva ad almeno un anno di distanza dall’ultima terapia (“gruppo pazienti”). Questi pazienti sono stati arruolati nel periodo compreso tra Ottobre 2015 e Maggio 2017.
Il gruppo controllo è costituito da undici soggetti di età media pari a 66 anni (range 45-82 anni), 6 pazienti di sesso femminile e 5 di sesso maschile.
Il gruppo pazienti comprende 17 pazienti di età compresa tra i 44 e gli 83 anni: 16 pazienti con nuova diagnosi ed una paziente già trattata ed attualmente in recidiva.
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Età media 68.2
Sesso 9 M
8 F Sottotipo immuno-chimico di Mieloma Multiplo: • IgG-k • IgA-λ • IgA-k • IgD-k • Micromolecolare : o k o λ 7 2 1 1 3 3 Stadio Durie-Salmon: • I • II • III: o IIIA o IIIB 7 4 6 5 1 Stadio ISS: • I • II • III 4 12 1 Cariotipo: • Standard risk • High risk 16 1 Terapie effettuate:
• Pazienti che hanno effettuato almeno una linea di trattamento con Bortezomib
• Pazienti pluritrattati
• Pazienti sottoposti ad ASCT • Pazienti sottoposti ad HSCT
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4 1 1
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2.2 Isolamento delle MPCs
Ogni paziente è stato sottoposto a standard work-up diagnostico che comprende le indagini midollari: mieloaspirato e BOM (biopsia osteomidollare).
Durante il mieloaspirato viene prelevato un campione di circa 5 mL di sangue midollare tramite una provetta contenente 2,5 mL di litio eparina come anticoaugulante. Le provette sono state successivamente inviate al laboratorio di Manipolazione Cellulare per lo svolgimento dell’isolamento.
Il sangue midollare di ogni campione viene diluito 1:4 con PBS (Posphate Buffered Saline), quindi stratificato su 3,5mL di Ficoll in 4 provette di tipo Falcon (15mL).
Le provette sono centrifugate a 400g per 15 minuti, processo che permette la formazione di un anello di cellule mononucleate midollari (BM-MNCs), posto all’interfaccia tra la componente plasmatica ed il Ficoll. I quattro anelli, recuperati dalle rispettive provette, sono lavati con PBS. La sospensione formata viene centrifugata a 400g per 5 minuti così da ottenere un pellet di cellule mononucleate. Il pellet è sospeso in terreno DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) arrichito con:
• 10% di un pool commerciale di sieri umani (PhABs) • 1% di L-glutammina
• 1% di penicillina e streptomicina.
Un’aliquota di questa sospensione viene prelevata e diluita 1:100 in PBS per la conta cellulare. Le cellule sono contate usando la camera di Burker dopo l’aggiunta di 10µL di Tripan Bleu a 10µL della sospensione suddetta.
Le cellule mononucleate ottenute con questo procedimento vengono piastrate alla densità di 0,8*106/cm2 in fiasche per cellule in sospensione contenenti circa 12mL di terreno DMEM/10%
PhABS; solo le MPC grazie alla loro grande capacità d’adesione potranno essere isolate in queste fiasche.
Le cellule sono incubate alla temperatura di 37°C e pCO2 pari al 5%, per 6 giorni con cambi di
terreno ogni 48-72 ore.
Al termine dei 6 giorni di coltura il terreno viene eliminato dalla fiasca e le cellule sono incubate per 5-15 minuti circa con il Tryple Select che ne permette il distacco, quindi alla fiasca vengono aggiunti 5mL di DMEM/10% PhABS, per consentire il recupero di tutte le cellule staccate. Questa sospensione cellulare è centrifugata a 400g per 5 minuti ottenendo un pellet che viene sospeso in 1-2mL di DMEM/10% PhABS per permettere la conta cellulare (effettuata con il metodo precedentemente descritto).
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Dopo la conta, la sospensione cellulare è nuovamente centrifugata a 350g per 5 minuti per ottenere un nuovo pellet dal quale ricavare gli sferoidi con il metodo della goccia pendente.
2.3 Metodo della goccia pendente per la formazione degli sferoidi
Il metodo della goccia pendente, molto usato in microbiologia, garantisce un’appropriata visualizzazione dei preparati cellulari ponendo una goccia di tale sospensione tra un vetrino coprioggetti ed un vetrino portaoggetti.
In questo caso, ogni goccia pendente è composta da 150000 cellule sospese in 20 µL di DMEM/10% PhABS; con una pipetta si depositano le gocce sulla superficie interna del tappo di una piastra Petri.
Il tappo è delicatamente capovolto sulla base della piastra contenente acqua, per prevenire la disidratazione delle gocce. A questo punto la piastra è posta nell’incubatore a 37°C e pCO2 pari
al 5% per 24 ore.
Il giorno seguente vengono preparati sei pozzetti (in una piastra 24well) contenenti 300 µL di BD Matrigel™ (Basement Membrane Matrix Phenol Red Free), posti ad incubare per circa 30 minuti per garantire la polimerizzazione del supporto.
Ad ogni pozzetto vengono aggiunti circa 700 µL di terreno EGM2 (Lonza) per cellule endoteliali, quindi gli sferoidi ricavati dalle gocce pendenti vengono delicatamente posizionati sullo strato di BD Matrigel™ fatto gelificare precedentemente.
Infine, il Bortezomib viene aggiunto in quattro pozzetti così da ottenere: • 2 pozzetti di controllo;
• 2 pozzetti cui è stato aggiunto il bortezomib alla concentrazione di 2nM; • 2 pozzetti con bortezomib alla concentrazione di 3nM.
2.4 Valutazione dello sprouting angiogenico delle MPCs
Lo sprouting costituisce una fase del processo angiogenico durante il quale le cellule endoteliali migrano e proliferano grazie alla presenza di un terreno adeguato (EGM2 Lonza) per dare successivamente inizio alla formazione di strutture vascolari.
La valutazione dello sprouting è svolta grazie all’acquisizione di immagini digitali tramite il microscopio LEICA DMIRB equipaggiato con software d’analisi LEICA QWIN.
Le immagini sono acquisite per ogni sferoide a 24 ore e, successivamente, a 7 giorni dalla deposizione nel pozzetto.
Su ogni immagine tre operatori in cieco hanno effettuato 20 misurazioni della distanza radiale, ovvero dal centro dello sferoide alla sua regione più esterna.
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Calcolata la media delle misure ottenute per ciascun campione a 24 ore ed a 7 giorni, è stato possibile analizzare le differenze dello sprouting tra i campioni controlli ed i campioni trattati con bortezomib alle due differenti concentrazioni.
Le misurazioni sono state normalizzate grazie al calcolo dell’indice d’inibizione, ricavato dalla formula: - ( (DTR- DCTRL) / DCTRL).
DTR è la distanza media radiale dell’ultima cellula significativa (ascrittibile al fenomeno di sprouting) rispetto al margine esterno dello sferoide trattato, mentre DCTRL indica la stessa distanza, calcolata con le stesse modalità, sullo sferoide controllo.
L’analisi statistica è stata condotta con test parametrico ANOVA (Analysis Of VAriance) e post-test Dunnett’s Multiple Comparison Test, utilizzando il software GraphPad Prism 4.0.
2.5 Differenziamento delle MPCs
Nella seconda fase dell’esperimento le MPCs, isolate con la metodica precedentemente descritta, sono state differenziate in “early MSCs” P1.
Le MPCs isolate dopo 6 giorni di coltura, vengono staccate mediante l’utilizzo del Tryple Select.
Le cellule staccate sono piastrate in fiasca TC con il terreno StemMACS™ MSC Expansion Media Kit XF, privo di siero umano ed utile al differenziamento mesenchimale.
Le MPCs sono mantenute in coltura per 6 giorni in questo terreno differenziante mesenchimale, con cambi di terreno ogni 48-72 ore.
Trascorso questo tempo, le cellule vengono staccate quindi si procede alla preparazione degli sferoidi ed alla valutazione dello sprouting come precedentemente descritto.
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