In condizioni di stress, all’interno delle cellule si possono formare composti tossici che vanno ad attaccare le molecole più sensibili (bersagli) e ne impediscono il corretto funzionamento. Per limitare e/o eliminare tali composti tossici, le cellule hanno sviluppato alcuni meccanismi di difesa endogeni. Le molecole bersaglio danneggiate possono essere inoltre recuperate o tramite la loro ricostruzione o tramite la biosintesi ex novo. Quando, invece, lo stress è troppo intenso le molecole bersaglio danneggiate portano la cellula alla morte.
Per poter sopravvivere, le cellule devono essere capaci di tollerare lo stress fino a quando non si sarà instaurato un processo metabolico capace di eliminare le sostanze tossiche. La tolleranza allo stress da parte delle piante è determinata dalla loro capacità di protezione, oltre che dall’intensità e durata dello stress.
E’ noto che le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono prodotte costantemente all’interno dei compartimenti cellulari durante il normale metabolismo della cellula vegetale (processi ossidativi, difesa cellulare contro l’invasione da parte di patogeni, comunicazione intra- e inter-cellulare, ecc.). L’azione delle ROS è quindi indispensabile per molte funzioni cellulari, ma può risultare tossica se supera una certa soglia. Le ROS, infatti, giocano un ruolo cruciale negli stress ambientali di tipo ossidativo.
Tutte le forme di vita con metabolismo aerobio hanno sviluppato molteplici linee di difesa in risposta alle ROS che comprendono sia enzimi detossificanti sia antiossidanti di natura non enzimatica. I molteplici sistemi di difesa sono necessari proprio per il fatto che le ROS sono prodotte in differenti compartimenti cellulari ed extracellulari e per il fatto che esse hanno caratteristiche chimico-fisiche differenti tra loro come la solubilità, la diffusione e la tendenza a reagire con le molecole biologiche. E’ quindi necessario un discreto numero di molecole con funzioni di difesa per agire sia in fase liquida nel citosol che nelle membrane biologiche in tutti i compartimenti cellulari al fine di inattivare tempestivamente i radicali appena formatisi. Nel caso in cui tali sistemi di difesa e di detossificazione siano carenti o funzionino male, si possono avere dei problemi soprattutto se subentra una condizione di forte stress la quale, se persiste per lungo tempo, può portare la cellula alla morte. La maggior parte delle ROS nelle cellule vegetali è prodotta durante il giorno, nei cloroplasti ricchi di pigmenti e che sviluppano O2, (Asada e Takahashi, 1987). Questi compartimenti rappresentano quindi i siti cellulari più intensamente interessati dallo stress ossidativo, anche se non sono i soli a formare ROS.
I meccanismi di difesa antiossidanti si possono suddividere in due gruppi: uno di natura enzimatica e l’altro di natura non enzimatica.
Per quanto riguarda gli enzimi possiamo annotare la superossido dismutasi (SOD), la catalasi e la perossidasi.
La SOD trasforma il radicale superossido in perossido di idrogeno ed è presente in varie forme all’interno dei cloroplasti ma anche nei mitocondri.
O2•- + O2•- + 2 H+ → H2O2 + O2
Invece, le catalasi si trovano nei perossisomi e sono specializzate nella detossificazione dell’acqua ossigenata che è un composto tossico per la cellula
Le perossidasi si trovano nel citosol, nei cloroplasti e nei mitocondri; possono essere di due tipi - ascorbato perossidasi e glutatione ossidasi - e hanno anch’esse la funzione di eliminare l’acqua ossigenata.
La più importante perossidasi del cloroplasto è l’ascorbato perossidasi (APX) che utilizza in maniera specifica l’ascorbato (AsA) come donatore di elettroni con la produzione del radicale monodeidroascorbato (MDHA•), come mostrato in Figura:
H2O2 + 2 AsA → 2 H2O + 2 MDHA•
Vi sono poi dei composti di natura non enzimatica che svolgono un’azione antiossidante, fra questi troviamo:
1) l’ascorbato, conosciuto anche come vitamina C, è un importante antiossidante nei sistemi biologici, dove reagisce non solo con il perossido d’idrogeno, ma anche con O2•-, HO• ed i lipidi idroperossidi. L’ascorbato è solubile in acqua ed ha un ruolo importante nella rigenerazione o nella protezione dei tocoferoli e dei caroteni ossidati presenti nelle membrane dei tilacoidi. Il pool di ascorbato è importante anche a livello del citosol (Foier e Harbinson, 1994). Tappel (1977) ha suggerito che il sinergismo antiossidante fra vitamina C ed E sia dovuto alla riduzione dei radicali tocoferolo da parte dell’ascorbato. D’altra parte, un contenuto troppo alto di ascorbato (maggiore di 1 mM) può ridurre lo ione ferrico a ferroso (da Fe3+ a Fe2+) e
può aumentare la velocità della reazione di Haber-Weiss (Girotti,1987). Ciò indica come nella difesa ossidativa, livelli eccessivi di agenti detossificanti possano portare ad un esito negativo.
2) Il tocoferolo (vitamina E) - ed in modo particolare l’alfa tocoferolo- che, essendo una molecola liposolubile, è molto importante come terminatore (accettore finale) delle reazioni a catena dei radicali liberi che causano la perossidazione dei lipidi. La vitamina E, inoltre, agisce come una sorta di ”spazzino” nei confronti di altre specie reattive dell’ossigeno, dell’azoto ed altri radicali attivi.
3) I carotenoidi (fra cui il β-carotene), composti stabili che nelle cellule fotosintetizzanti attenuano sia lo stadio eccitato della clorofilla (tripletto) sia quello dell’ossigeno singoletto, impedendo loro di iniziare la perossidazione dei lipidi. Infatti, la molecola di carotene eccitata è in grado di ritornare al suo stadio
fondamentale tramite il trasferimento di energia ad altri pigmenti nel sistema antenna tramite la dissipazione di energia. Inoltre, difendono le membrane in sinergia con la vitamina E.
4) Il glutatione, che è il substrato riducente della glutatione perossidasi, l’enzima che rimuove l’acqua ossigenata ed altri perossidi attraverso l’ossidazione del glutatione. Il glutatione, un γ-tripeptide (Glu-Cys-Ala) ubiquitario, riduce e detossifica molte specie ossidanti. Il glutatione è importante per il riciclaggio di tutte le vitamine sopra elencate, mentre la sua rigenerazione dipende dal consumo di NADPH. La diminuzione del pool di glutatione ridotto causa condizioni di sofferenza per la pianta, ma non è sempre chiaro se una tale riduzione sia direttamente la causa di stress o piuttosto riflette una maggior domanda di glutatione.
All’interno delle cellule il glutatione è mantenuto nella sua forma ridotta dalla glutatione reduttasi, un enzima che catalizza la riduzione del glutatione ossidato utilizzando NADPH. Inoltre, esso è il substrato riducente della glutatione perossidasi, l’enzima che rimuove l’acqua ossigenata ed altri perossidi attraverso l’ossidazione del glutatione. Quest’ultimo è anche il substrato riducente della deidroascorbato reduttasi, che riduce il radicale monodeidroascorbato ad ascorbato con la contemporanea ossidazione di NADH.
4) Infine, vi sono i flavonoidi, un gruppo di composti fenolici che hanno un’alta attività antiossidante. I polifenoli rappresentano una delle principali classi di metaboliti secondari, classe molto eterogenea caratterizzata da anelli aromatici con uno o più sostituenti ossidrilici.