Capitolo 5 – Materiali e Metodi
5.3 Metodi biologici
5.3.1 Inibizione enzima lattato deidrogenasi
I composti A, D-G sono stati saggiati nei confronti dell’isoforma 5 purificata dell’enzima lattato deidrogenasi umana (hLDH5) (Lee Biosolution, Inc.) secondo il procedimento di seguito riportato. La reazione condotta è stata piruvato→lattato, catalizzata dalla LDH (che richiede NADH come cofattore) ed i parametri cinetici sono stati misurati tramite fluorescenza, per monitorare la quantità di NADH consumata e poter di conseguenza calcolare le IC50. I campioni sono stati testati all’interno di
pozzetti in presenza di 200 µM di piruvato e 40 µΜ di NADH, sciolti in una soluzione tampone di fosfato 100 mM (pH = 7.4) e per calcolare i valori di IC50, sono state usate
sette diverse concentrazioni (in duplicato per ogni concentrazione) al fine di ottenere una curva concentrazione-risposta; in parallelo sono state eseguite delle prove in bianco. Dopo 15 minuti di incubazione è stata calcolata la concentrazione di NADH presente tramite fluorescenza (lunghezza d’onda d’emissione a 460 nm, lunghezza d’onda di eccitazione a 340 nm) usando un lettore di micropiastre Victor X3 (PerkinElmer®) (Fig. 5.8). Un’elevata fluorescenza a 340 nm significa che il NADH non è stato utilizzato come cofattore dall’LDH e quindi l’enzima è stato in qualche modo inibito. I valori di IC50 sono stati ottenuti tramite il software GraphPadPrism (GraphPad – USA).
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CONCLUSIONI
La ricerca di metaboliti secondari sulle parti aeree di Polygala flavescens subsp. flavescens, pianta erbacea appartenente alla famiglia delle Polygalaceae, raccolta in Italia sulle colline delle Cerbaie, provincia di Pisa, ha portato all’isolamento e alla caratterizzazione di 7 composti appartenenti a diverse classi di costituenti secondari.
Nello specifico sono stati isolati: 2 flavonoidi (composto A, F)
3 saponine triterpeniche (composto B, C, D) 2 oligosaccaridi ( composto E, G)
Tra questi, le tre saponine triterpeniche B, C e D risultano essere derivati naturali, mai isolati prima, mentre i flavonoidi A ed F e gli oligosaccaridi E e G erano già noti in letteratura.
I composti A ed F sono stati identificati rispettivamente come rutina e come quercetina-3-O-β-D- apiofuranosil-(1→2)-O-[α-L-ramnopiranosil-(1→6)]-β-D-glucopiranoside. Si tratta di due flavonoidi glicosidici, già isolati in natura, la cui porzione agliconica è costituita da quercetina e la porzione zuccherina si trova legata in pozione 3.
I composti B, C e D sono saponine triterpeniche. La porzione agliconica della sostanza B è costituita da presenegenina, mentre in C e D è presente l’acido medicagenico. Tutti e tre gli agliconi hanno legata in posizione C-3 una molecola di glucosio; mentre in C-28, tramite legame estereo, si trova una porzione glicosidica più complessa. Nei composti B e C essa presenta la stessa sequenza zuccherina: galactopiranosil - (1→4) - xilopiranosil - (1→4) - ramnopiranosil - (1→2) - [glucopiranosil-(1→3)]-fucopiranoside; unica differenza è la presenza di un gruppo acetilico in posizione 4 del fucopiranosio, che nel composto C è assente. La porzione glicosidica del composto
D presenta invece la seguente sequenza: ramnopiranosil-(1→2)-apiofuranosil-(1→3)- fucopiranoside.
I composti E e G sono due oligosaccaridi identificati rispettivamente come reinosio F e 3,6'- disinapoil saccarosio e caratterizzati dalla presenza di gruppi acilici disposti in varie posizioni. In collaborazione con il gruppo del Prof. Minutolo del Dipartimento di Farmacia, Università di Pisa, i composti A, D, E, F, G sono stati sottoposti a studi di attività biologica nei confronti dell’enzima lattato deidrogenasi (hLDH5), nuovo possibile marker terapeutico nel trattamento dei tumori. Lo studio ha riportato che i due oligosaccaridi E e G presentano una discreta attività
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inibitoria. In particolare il 3,6'-disinapoil saccarosio (composto G) ha dimostrato avere
IC
50 90.4 ± 4.4µM,
un valore addirittura migliore di quello della galloflavina (IC
50 102.4 ± 15.0µM
), composto di riferimento. Presso il Dipartimento di Farmacia, dell’Università di Pisa, sono state successivamente effettuate indagini di docking, tecnica computazionale che permette lo studio dell’interazione tra due molecole, per approfondire il meccanismo d’interazione molecola- enzima. La letteratura non riporta saggi di attività simili, per cui i risultati ottenuti sull’inibizione dell’enzima hLDH5 da parte dell’oligosaccaride 3,6'-disinapoil saccarosio può rappresentare un punto di partenza per lo sviluppo di una nuova classe di agenti terapeutici nella cura dei tumori. Nel complesso, si può affermare che il lavoro di ricerca svolto su Polygala flavescens subsp. flavescens, specie endemica italiana appartenente al gruppo italiano Polygala DC., ha portato all’isolamento di varie classi di metaboliti secondari, tra cui alcuni composti mai caratterizzati prima; tuttavia le classi di composti isolate sono perfettamente coerenti con quelle già riportate in letteratura.103
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