Metaboliti secondari da Polygala flavescens subsp. flavescens e loro attivita inibitoria sull'enzima lattato deidrogenasi

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

TESI DI LAUREA

Metaboliti secondari da Polygala flavescens subsp. flavescens e

loro attività inibitoria sull’enzima lattato deidrogenasi

Relatore:

Alessandra Braca

Candidato:

Giulia Tofanelli

I

SOMMARIO

Oggetto del presente lavoro di tesi è l’isolamento e la caratterizzazione di metaboliti secondari da Polygala flavescens subsp. flavescens, appartenente al gruppo endemico italiano Polygala flavescens DC., genere Polygala L.

Polygala L. è il genere più importante all’interno delle Polygalaceae, sia perché comprende circa 500 specie, sia per la diffusione cosmopolita. L’ampia distribuzione l’ha reso un genere molto vario sia da un punto di vista botanico che fitochimico. Precedenti studi fitochimici sul genere hanno riportato la presenza di xantoni, saponine e oligosaccaridi tra i principali metaboliti secondari e in misura minore anche benzofenoni e flavonoidi. Nella tradizione il genere Polygala L. è conosciuto per le proprietà sedative, antinfiammatorie ed espettoranti ed è usato nel trattamento della depressione e dell’insonnia; tutti effetti riconducibili ai principali costituenti del genere.

L’interesse verso il sottotipo Polygala flavescens subsp. flavescens, nasce da un precedente lavoro di tesi, durante il quale erano stati isolati diversi metaboliti secondari da Polygala flavescens subsp. flavescens; con il seguente lavoro di tesi si vuole continuare e concludere l’isolamento e la caratterizzazione di tali costituenti.

Il materiale vegetale è stato raccolto sulle colline delle Cerbaie, nella Valdarno inferiore, essiccato, macinato e sottoposto ad estrazione per macerazione con due solventi: n-esano e metanolo. L’estratto metanolico è stato sottoposto a ripartizione tra AcOEt/H2O e

n-BuOH/H2O. Durante l’operazione si è verificata la precipitazione di un flavonoide puro,

rutina (composto A). L’estratto n-butanolico è stato separato tramite cromatografia ad esclusione molecolare Sephadex® LH-20, ottenendo 18 frazioni principali (1-18). In base al profilo cromatografico su TLC (Thin Layer Chromatography) sono state prese in considerazione le frazioni 2, 3, 4, 10, 12. Le frazioni 2, 3, 4, sono state sottoposte a HPCPC (High Performance Centrifugal Partition Chromatography) e dopo opportune riunioni le frazioni 2/10, 3/2 e 4/5 sono state separate mediante cromatografia liquida ad alta pressione in fase inversa (RP-HPLC), giungendo alla purificazione dei composti B, C e D, nuove saponine triterpeniche. Le frazioni 10 e 12 sono state sottoposte ad HPLC portando alla separazione di due oligosaccaridi già noti in letteratura, reinosio F (composto

E) e 3,6ꞌ-disinapoil saccarosio (composto G) e un flavonoide noto, quercetina-3-O-β-D -apiofuranosil-(1→2)-O-[α-L-ramnopiranosil-(1→6)]-β-D-glucopiranoside (composto F).

II

La determinazione strutturale dei composti è stata effettuata tramite spettrometria di massa HR-ESI-MS ed ESI-MS, oltre che spettroscopia 1D e 2D NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DFQ-COSY, 1D-TOCSY, HSQC, HMBC).

Nel complesso lo studio ha portato all’isolamento di 2 flavonoidi noti (composto A e F), 3 nuove saponine triterpeniche (composti B, C, D) e 2 oligosaccaridi noti in letteratura (composti E e G).

I composti A, D, E, F, G sono stati infine sottoposti a saggi di attività biologica, al fine di valutare una possibile interazione con l’enzima lattato deidrogenasi, sistema enzimatico coinvolto in processi tumorali. Soltanto i composti E e G hanno dimostrato una discreta attività inibitoria; in particolare il composto G ha dimostrato avere

IC

µM,

IC

µM

III

INDICE

1.1 La famiglia delle Polygalaceae 4

1.1.1 Caratteristiche botaniche 4

1.2 Il genere Polygala L. in Italia 6

1.2.1 Caratteristiche botaniche 6

1.3 Polygala flavescens subsp. flavescens 8

1.4 Il genere Polygala L. nella tradizione popolare 10

Capitolo 2 – Fitochimica 11

2.1 Precedenti studi fitochimici 12

2.1.1 Saponine triterpeniche 12

2.1.2 Oligosaccaridi 22

2.1.3 Flavonoidi 27

2.1.4 Altri metaboliti secondati 29

2.2 Precedenti studi biologici 31

2.2.1 Saponine 31

2.2.2 Oligosaccaridi 34

Capitolo 3 – Risultati e discussione 36

3.1 Isolamento e identificazione dei composti 37

3.2 Composti isolati 40

3.2.1 Composto A 40

3.2.1 Composto B, nuova saponina triterpenica 42

3.2.3 Composto C, nuova saponina triterpenica 46

3.2.4 Composto D, nuova saponina triterpenica 50

3.2.5 Composto E 57

3.2.6 Composto F 60

3.2.7 Composto G 63

III

Capitolo 4 – Parte sperimentale 71

4.1 Materiale vegetale 72

4.2 Estrazione, ripartizione, separazione 72

4.2.1 Estrazione 72

4.2.2 Ripartizione estratto metanolico 73

4.2.3 Studio residuo n-BuOH di Polygala flavescens subsp. flavescens 74

4.3 Analisi delle frazioni 76

4.3.1 Analisi frazione 2 76 4.3.1.1 Analisi frazione 2/10 77 4.3.2 Analisi frazione 3 79 4.3.2.1 Analisi frazione 3/2 80 4.3.3 Analisi frazione 4 83 4.3.3.1 Analisi frazione 4/5 84 4.3.4 Analisi frazione 10 86 4.3.5 Analisi frazione 12 88

4.4 Inibizione enzima lattato deidrogenasi 90

Capitolo 5 – Materiali e Metodi 91

5.1 Metodi cromatografici 92

5.1.1 Cromatografia su strato sottile 92

5.1.2 Cromatografia ad esclusione molecolare 93

5.1.3 HPCPC (High Performance Centrifugal Partition Chromatografy) 94

5.1.4 HPLC (High Performance Liquid Chromatografy) 95

5.2 Metodi chimico-fisici 96

5.2.1 Potere ottico rotatorio 96

5.2.2 Spettri di risonanza magnetica nucleare 96

5.2.3 Spettri ESI-MS 97

5.2.4 Spettri HRESIMS 97

5.3 Metodi biologici 99

5.3.1 Inibizione enzima lattato deidrogenasi 99

Conclusione 100

1

INTRODUZIONE

Scopo del presente lavoro di tesi è la ricerca, l’isolamento e la caratterizzazione di metaboliti secondari da Polygala flavescens subsp. flavescens, pianta erbacea che cresce esclusivamente su territorio italiano (Peruzzi et al., 2014).

Lo studio si è svolto presso il laboratorio di fitochimica del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, con la collaborazione del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Salerno, presso il quale sono stati effettuati gli esperimenti per la caratterizzazione strutturale delle nuove molecole.

Polygala L. è il genere più importante all’interno delle Polygalaceae, sia perché comprende circa la metà dei membri della famiglia, sia per la diffusione cosmopolita. L’ampia distribuzione l’ha reso un genere molto vario sia da un punto di vista botanico che fitochimico. Precedenti studi fitochimici sul genere hanno riportato la presenza di xantoni, saponine e oligosaccaridi tra i principali metaboliti secondari e in misura minore anche benzofenoni e flavonoidi. Nella tradizione il genere Polygala L. è conosciuto per le proprietà sedative, antinfiammatorie ed espettoranti ed è usato nel trattamento della depressione e dell’insonnia; tutti effetti riconducibili ai principali costituenti del genere.

Sul territorio italiano il genere risulta diffuso e notevolmente differenziato: 23 specie e 15 sottospecie. Nonostante questo le specie italiane sono ancora poco studiate, seppur potenzialmente interessanti per i loro contenuto di metaboliti secondari.

L’interesse verso il sottotipo Polygala flavescens subsp. flavescens, nasce da un precedente lavoro di tesi, fitochimico e sistematico, finalizzato a chiarire le relazioni che intercorrono tra gli individui che appartengono al gruppo endemico italiano Polygala flavescens DC. Durante lo studio erano stati isolati diversi metaboliti secondari da Polygala flavescens subsp. flavescens, fra cui flavonoidi e oligosaccaridi; con il seguente lavoro di tesi si vuole continuare e concludere l’isolamento e la caratterizzazione di tali costituenti.

Il lavoro di ricerca è iniziato con la raccolta del materiale vegetale, seguito da essiccamento e macinazione della pianta. La droga macinata è stata poi estratta con solventi a temperatura ambiente. Una volta ottenuti gli estratti il passo successivo è stata la separazione dei vari costituenti mediante l’utilizzo di tecniche cromatografiche, al fine di ottenere i composti puri. La caratterizzazione dei composti è avvenuta con l’ausilio di diverse tecniche spettroscopiche e spettrometriche.

2

I composti isolati sono stati saggiati nell’ambito in un progetto di ricerca, in collaborazione con il gruppo del Prof. Minutolo del Dipartimento di Farmacia, Università di Pisa, finalizzato a testare l’attività inibitoria di diverse classi di composti naturali sull’enzima lattato deidrogenasi (LDH), possibile futuro target terapeutico nel trattamento dei tumori.

3

CAPITOLO 1

BOTANICA

1.1 La famiglia delle Polygalaceae 4

1.2 Il genere Polygala L. in Italia 6

1.3 Polygala flavescens subps. flavescens 8

1.4 Il genere Polygala L. nella tradizione popolare 10

4

1.1 La famiglia delle Polygalaceae

La famiglia delle Polygalaceae appartiene all’ordine delle Fabales, collocazione di recente attribuita da parte dell’Angiosperm Phylogeny Group (APG, 1998; APG II, 2003; APG III, 2009; APG IV, 2016). All’interno della famiglia si possono individuare 4 tribù, Xanthophylleae, Moutabeae, Carpolobieae, Polygaleae, 21 generi e 800-1000 specie, distribuite in tutto il mondo, con centro di diversità nelle aree tropicali e subtropicali (Fig. 1.1) (Eriksen e Persson, 2007).

Fig. 1.1 Distribuzione Polygalaceae

Xanthophylleae, Moutabeae e Carpolobieae sono principalmente limitate alle umide foreste tropicali. Generalmente presenti come piccoli alberi, arbusti e liane. La maggior parte delle specie sembra avere una preferenza per ambienti luminosi come i bordi forestali o lungo i fiumi. Le Polygaleae comprendono sia membri a fusto legnoso, i quali nei climi umidi o semi asciutti costituiscono vere e proprie foreste, che membri erbacei. Le specie semi-desertiche si sono spesso evolute in arbusti talvolta spinosi (Eriksen e Persson, 2007).

1.1.1 Caratteristiche botaniche

Le Polygalaceae si presentano in una grande varietà di forme, alberi, liane, frutici, suffrutici ed erbe perenni e annuali. L’indumento, se presente, è costituito da peli semplici, unicellulari o pluricellulari, con superficie liscia o verrucosa. Il fusto solitamente circolare, occasionalmente angoloso o alato, può presentare aculei. Le foglie, solitamente alterne,

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qualche volta verticillate od opposte, sono sessili o picciolate, semplici, senza stipole. Le infiorescenze terminali o ascellari, sono riunite in racemi semplici o composti, raramente fiori solitari. I fiori sono bisessuali, più o meno attinomorfi o zigomorfi, sottesi da brattee e due bratteole le quali sono spesso precocemente caduche. Il calice è pentamero, con sepali da subuguali a fortemente disuguali, liberi, parzialmente connati o fusi in un tubo, caduchi o persistenti. La corolla è pentamera o trimera, con petali liberi tra loro, da subuguali a fortemente irregolari. I fiori sono bianchi, gialli, rosa, viola o blu, con il petalo abassiale (carena) spesso di colore contrastante. Gli stami sono (2−)5–8(–10); filamenti liberi, adnati ai lobi della corolla e/o fusi in una guaina; le antere 2-4-sporangiate. L’ovario è 2-8-carpellare, sincarpico, generalmente con tanti loculi quanti i carpelli, occasionalmente uniloculare, ogni loculo con un singolo ovulo epitropo pendulo. Lo stilo è dritto, curvo o genicolato, a volte compresso lateralmente, distalmente indiviso o bilobato con 1-2 aree stigmatiche. I frutti sono di norma secchi e indeiscenti, e occasionalmente alati (samara), o carnosi. I semi sono glabri o pelosi, quelli delle capsule ed alcune bacche spesso dotati di arillo esostomico (caruncola), o in possesso di altre escrescenze arillari (Eriksen e Persson, 2007).

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1.2 Il genere Polygala L. in Italia

Il genere Polygala L. è il più diffuso all’interno della famiglia delle Polygalaceae, costituito da circa 500 specie e distribuito in tutto il mondo ad accezione delle zone Artiche e della Nuova Zelanda (Eriksen e Persson, 2007). Sul territorio italiano il genere risulta diffuso e notevolmente differenziato: 23 specie, 13 sottospecie eterotipiche e 2 eterotopiche. La vasta distribuzione e l’ampia diversificazione del genere, testimonianza della sua antica origine, l’hanno reso un’ottima fonte di nuove molecole.

1.2.1 Caratteristiche botaniche

Presente soprattutto come suffrutice o erba annua o perenne, le Poligale italiane raramente sono completamente glabre. Presentano piccoli peli, curvi, quasi ciglia, che le rendono puberule sui fusti e sui margini fogliari. I fusti sono più o meno angolosi, variamente puberuli soprattutto nella parte superiore. Le foglie, alterne, spiralate, senza stipole da sempreverdi a estivali, presentano spiccata eterofillia tra quelle inferiori dei fusti e quelle delle parti medie e superiori dei cauli. Le foglie superiori sono per lo più lanceolate o lineari di variabile lunghezza e larghezza. I fiori sono riuniti in infiorescenze terminali, raramente singoli, diverse per lunghezza e numero di fiori. Il calice è formato da tre sepali esterni lineari (bratteole) e 2 interni (ali) con funzione vessillifera. Le ali sono uno dei caratteri più variabili. Si possono riconoscere diversi tipi di colore: da rosacee a porporine, da cerulee o azzurre a violacee e blu-gialle-bianche, spesso macchiate di rosa o blu. La forma varia da ovale, obovale, ellittica, falcata, più o meno cuneata alla base o apicolata all’apice. Le nervature sono in genere reticolate. La corolla presenta un lobo frangiato, un variabile numero di lacinie e due lobi superiori, spesso di colore diverso dalle ali. Stami 8 connati e concresciuti con la corolla. Ovario supero bicarpellare e biloculare. Il frutto è una capsula più o meno obovale e marginata, può essere sessile o più o meno stipitata, inclusa o sporgente dalle ali. Il seme è irsuto, cilindrico o poco appiattito (Arrigoni, 2014). In figura 1.2 si riporta un esempio di Polygala italiana.

7 Fig.1.2 Esempio di Polygala Italiana (P. alpestris Rchb. subsp. meridionalis)

8

1.3 Polygala flavescens subsp. flavescens

Polygala flavescens DC. costituisce un particolare gruppo di taxa endemici italiani, gli unici caratterizzati da fiori gialli. Questa specie è distribuita su buona parte del territorio italiano, dall’Emilia Romagna alla Basilicata (Fig. 1.3) (Peruzzi et al., 2014).

Fig. 1.3 Distribuzione di Polygala flavescens DC. in Italia

Al gruppo Polygala flavescens DC. appartengono tre sottospecie di cui solo Polygala flavescens subsp. flavescens è oggetto del presente studio.

La specie si presenta come un’erba perenne con diversi fusti ascendenti o eretti, puberuli (Fig 1.4). Foglie inferiori obovali, le altre da lanceolate a lineari-lanceolate, acute. Racemi terminali fino a 10 cm, con 12-25 fiori. Brattee lucide, il doppio del pedicello, caduche. Bratteole lanceolate, acutissime. Ali gialle o giallo-verdastre, lanceolato-ellittiche, acute, cuneate. Corolla gialla, uguagliante o di poco superante le ali. Capsula obcordata, attenuata alla base, più o meno stipitata, con profonda e stretta smarginatura. Seme 3 mm con lobi laterali dello strofiolo circa la metà della lunghezza del seme (Arrigoni, 2014).

9 Fig. 1.4 Polygala flavescens subsp. flavescens

10

1.4 Il genere Polygala nella tradizione popolare

Il genere Polygala L. è da sempre fonte di specie di interesse medicinale, trovando, nei secoli, largo impiego tra le popolazioni locali e nelle medicine tradizionali.

Le radici di Polygala senega L., in Nord America, sono utilizzate come espettorante per tosse e bronchiti, come diuretico e diaforetico, mentre gli indiani la usano per il trattamento dei morsi di serpente. Gli infusi provenienti dagli estratti di radici di Polygala paniculata L. sono considerati diuretici, mentre quelli di Polygala angustifolia Chodat emetici. Le radici di Polygala sibirica L., insieme alla liquirizia, sono usate per trattare la depressione, l'irritabilità e l'insonnia nella moderna erboristeria cinese (Eriksen e Persson, 2007). L’uso di Polygala tenuifolia Willd., conosciuta col nome di Polygala Radix, nella Medicina Tradizionale Cinese è ormai consolidato. Usata come espettorante, per tosse, bronchite ed asma (Delaude, 1992). Nella Medicina Tradizionale Coreana, invece, le radici sono usate come antipsicotico e sedativo (Chung et al.,1992). Nel sud della Cina P. fallax Hemsl. è usata come tonico e per l’epatite, mentre P. japonica Houtt. come espettorante, antinfiammatorio e antibatterico (Zhang et al., 1995a). P. myrtifolia L. viene impiegata come impiastro per la gotta in Sud Africa (Lacaille-Dubois et al., 2005). Anche se più di rado Polygala L. viene consumata come bevanda o cibo. In Africa, i semi di Polygala butyracea Heck. vengono utilizzati per produrre un grasso alimentare chiamato burro malukang; mentre in Nepal, le radici di Polygala arillata Buch-Ham. sono fatte fermentare per produrre una bevanda alcolica (Eriksen e Persson, 2007).

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CAPITOLO 2

FITOCHIMICA

2.1 Precedenti studi fitochimici 12

12

2.1 Precedenti studi fitochimici

Polygala L. si presenta come un genere ricco di metaboliti secondari quali saponine, oligosaccaridi e xantoni. La letteratura riporta in misura minore anche flavonoidi e benzofenoni.

Quello che realmente colpisce da un analisi più attenta è che, pur essendo un genere composto da circa 500 specie, soltanto un esiguo numero di individui è stato oggetto di studi e pochissimi appartenevano al genere Polygala italiano.

2.1.1 Saponine triterpeniche

Le saponine sono la seconda classe di metaboliti più presenti in Polygala L. Si tratta di composti capaci di produrre schiuma in acqua, anche a basse concentrazioni, poiché abbassano la tensione superficiale con un effetto simile a quello dei saponi. Le saponine sono glicosidi, formati da una porzione lipofila (aglicone) denominata sapogenina e una porzione idrofila zuccherina: da questa doppia natura deriva proprio la loro capacità tensioattiva.

L’aglicone più comune nelle saponine del genere Polygala L. è la presenegenina, presente in molte specie come P. senega L., P. tenuifolia Willd., P. glomerata Lour., P. fallax Hemsl., P. reinii Franch. & Sav, P. japonica Houtt. e P. arillata Bunch-Ham. Da P. japonica Houtt. sono state isolate saponine con aglicone differente come: baiogenina, polygalegenina, acido medicagenico o ederagenina (Fig.2.1). Indipendentemente dalla natura dell’aglicone tutte presentano in C-3 da uno a due molecole di glucosio e da uno a sei zuccheri in C-28, alcuni dei quali acilati da residui di acidi p-, o di-, o trimetossicinnamici e/o da acido acetico (Lacaille-Dubois et al., 2005).

13 R₃ R₂ HO COOH 1 2 3 4 5 6 7 8 26 9 10 25 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ₂₁ 22 28 29 30 R₁ 24

Fig. 2.1 Struttura aglicone saponine del genere Polygala

Aglicone R1 R2 R3 Pianta Presenegenina OH COOH CH2OH P. senega L., P. tenuifolia Willd., P. glomerata Lour., P. fallax Hemsl., P. reinii Franch.&Sav., P. japonica Houtt. P. arillata Houtt.

Baiogenina OH CH2OH CH3 P. japonica Houtt.

Polygalagenina OH CHO CH3 P. japonica Houtt.

Acido

medicagenico OH COOH CH3 P. japonica Houtt.

14

La biosintesi dell’aglicone, pentaciclo a 30 atomi di C, segue la via dell’acido mevalonico fino alla formazione del farnesil pirofosfato (FPP). A questo punto due molecole di FPP regiscono tra di loro in una reazione di dimerizzazione testa-testa per dare lo squalene; il quale per riarrangiamento ciclizza a formare il lupeolo, precursore di tutte le saponine (Fig. 2.2).

Fig. 2.2 Lupeolo, precursore saponine

La letteratura riporta saponine isolate da P. tenuifolia Willd., P. japonica Houtt., P. amarella Crantz., P. fallax Hemsl., P. senega L., P. glomerulata Lour. e P. reinii Franch. & Sav., tuttavia possiamo considerare rappresentative quelle ottenute da P. japonica Houtt., P. tenuifolia Willd. e P. senega L.

Le polygalasaponine I−XIX (1-19) (Fig. 2.3 e 2.4) (Zhang et al., 1995a, 1995b) e le

polygalasaponine XXVIII−XXXII (20-24) (Fig. 2.5) (Zhang et al., 1996), sono state ottenute, rispettivamente, dalle parti aeree e dalle radici di P. japonica Houtt.; Li et al. hanno isolato le polygalasaponine E–H e J (25-29) (Fig. 2.6) sempre dalle parti aeree di P. japonica Houtt (Li et al., 2006a).

15 O O OR1 HO HO HO HO OH O O O OR₃ R2O HO HO

Fig. 2.3 Struttura polygalasaponine I-X

Composto R1 R2 R3 1 H H H 2 H H Rha 3 H Api Rha 4 H Api Xyl(1→4)Rha 5 H H Xyl(1→4)[Api(1→3)]Rha 6 Glc H H 7 Glc H Rha 8 Glc Api Rha 9 Glc H Xyl(1→4)Rha 10 Glc Api Xyl(1→4)Rha

16 R₁O R3 HO O OR2

Fig. 2.4 Struttura polygalasaponine XI-XIX

Composto R1 R2 R3 11 Glc(1→2)Glc Glc(1→2)Glc CH2OH 12 Glc Glc CHO 13 Glc(1→2)Glc H CHO 14 Glc(1→2)Glc Glc CHO 15 Glc(1→2)Glc Glc(1→2)Glc CHO 16 Glc(1→2)Glc Xyl(1→4)Glc(1→2)Glc CHO 17 Glc(1→2)Glc Rha(1→2)Glc CHO 18 Glc(1→2)Glc Xyl(1→4)Rha(1→2)Glc CHO 19 Glc(1→2)Glc Xyl(1→4)Rha(1→2)[Api(1→3)]Glc CHO

17 GlcO COOH HO O O O O R2O O OH R3O O O OH R4O R5O OH OR₁ O MeO p-metossicinnamoil O MeO 3,4,5-trimetossicinnamoil OMe MeO A= _B=

Fig. 2.5 Struttura polygalasaponine XXVIII-XXXII

Composto R1 R2 R3 R4 R5

20 H H H H H

21 H H H H Gal(1→5)Api

22 A Glc H H Gal

23 B H Api Ara H

18 Fig. 2.6 Struttura polygalasaponine E-H e J

Composto R1 R2 R3 R4 25 H COOH H H 26 Glc CH2OH H H 27 H CH2OH Api H 28 H COOH Api H 29 Glc CH2OH H Gal HO R2 R1O O O O O HO HO HO O OH R3O O O OH HO R4O

19

Xu et al. hanno isolato da P. tenuifolia Willd. una nuova saponina triterpenica chiamata tenuifoside A (Fig. 2.7) (Xu et al., 2006), mentre Sakuma e Shoji hanno separato cinque nuove saponine dalle radici, denominate onjisaponine A, B e E-G (30-34) (Fig 2.8 e 2.9) (Sakuma e Shoji, 1981a, 1981b).

GlcO COOH O O O O RhaO O OH ApiO O O OH R2O HO OH OR₁

20 GlcO COOH HO O O O O R2O O OH R3O O O OH HO GalO OH OR₁ Fig 2.8 Onjisaponine A, B ed E Composto R1 R2 R3

30 p-metossicinnamoil Rha Api

31 p-metossicinnamoil Rha H 32 3,4,5-trimetosssicinnamoil H H GlcO COOH HO O O O O HO O OH ApiO O O OH RO OH OH O O MeO MeO OMe Fig. 2.9 Onjisaponine F e G Composto R 33 H 34 Ara

21

Dalle radici di P. senega L., sono stati ottenuti gli isomeri (E)- e (Z)- delle senegasaponine A–C (35-40) (Fig. 2.10) (Yoshikawa et al., 1995, 1996).

GlcO COOH HO O O O O R2O O OH R3O O O OH HO GalO OH OR1 O MeO MeO H O H H H (E)-p-metossicinnamoil _{(Z)-p-metossicinnamoil} A= _B=

Fig. 2.10 Struttura senegasaponine A−C isomeri E e Z

Composto R1 R2 R3 35 A H Api 36 B H Api 37 A H H 38 B H H 39 A 6-O-Ac-Glc H 40 B 6-O-Ac-Glc H

22

2.1.2 Oligosaccaridi

Gli oligosaccaridi sono una classe di composti molto eterogeneo costituita da più unità di zuccheri (da 2 a 5), quale glucosio, fruttosio, ramnosio, legate mediante legami glicosidici che coinvolgono gli ossidrili presenti in varie posizioni.

La biosintesi degli oligosaccaridi dipende dalla formazione di uno zucchero attivato legato ad un nucleoside difosfato, generalmente UDP. La reazione dello zucchero 1-fosfato con l’UDP porta alla formazione dell’UDP-zucchero; in seguito, una reazione di sostituzione nucleofila, tra l’UDP-zucchero e un altro zucchero porta al nuovo derivato dello zucchero oligosaccaridico (Dewick, 2000).

La letteratura riporta oligosaccaridi isolati da P. senega L., P.tenuifolia Willd., P. arillata Buch-Ham., P. glomerata Lour., P. japonica Houtt., P. fallax Hemsl., P. sibirica L. e P. reinii Franch. & Sav. Tra i più rappresentativi del gruppo ricordiamo i senegosi A-O (41-55) (Fig. 2.11 e 2.12) da P. Senega L. (Saitoh et al., 1993a e 1993b; Saitoh et al., 1994a), i

polygalatenoside A-E (56-60) (Fig. 2.13 e 2.14) da P. tenuifolia Willd. (Cheng et al., 2006) e gli oligosaccaridi acilati, denominati reinosio A-J (61-69) (Fig. 2.15 e 2.16) isolati da P. renii Franch. & Sav. (Saitoh et al., 1994b).

23 O O O O R₂O R3O OH HO GlcO R₄O Glc O OH BzO O HO OR₁

Fig 2.11 Struttura senegosi A-E e J-O

Composto R1 R2 R3 R4 41 (E)-feruloil _(E)-feruloil Ac Ac 42 (E)-feruloil _(E)-feruloil Ac H 43 (E)-feruloil _(E)-feruloil H Ac 44 _{(E)-feruloil (E)-feruloil} H H 45 _{(E)-feruloil (Z)-feruloil} Ac _Ac 46 _{(E)-p-cumaroil (E)-feruloil} Ac _Ac 47 _{(E)-p-cumaroil} (E)-feruloil _Ac H 48 _(E)-feruloil (Z)-p-cumaroil _Ac Ac 49 _(E)-feruloil (Z)-p-cumaroil _Ac H 50 _{(E)-p-cumaroil (Z)-feruloil Ac Ac} 51 (Z)-p-cumaroil _{(E)-feruloil Ac Ac}

24 O O O O O O R2O OH HO R3O R4O R₁ O HO MeO OH BzO O HO HO MeO O O

Fig. 2.12 Struttura senegosi F-I

Composto R1 R2 R3 R4

52 Glc Ac H Ac

53 Glc H H Ac

54 Glc Ac H H

25 O R₁O OR₃ OR₂ O O HO HO HO HO

Fig. 2.13 Struttura polygalatenoside A-C

Composto R1 R2 R3 56 H H Benzil 57 Benzil H H 58 H Benzil H O O O HO HO HO OMe MeO OH OH O HO O OH O O HO OH O O OH HO HO HO MeO OH 59 60

26 O OH R₂O R3O R4O O OH R1O O HO OH

Fig. 2.15 Struttura reinosio A-E

Composto R1 R2 R3 R4

61

3,4,5-trimetossicinnamoil H H feruloil

62 feruloil H H benzoil

63 4-O-Rha-(E)-feruloil H benzoil benzoil

64 sinapoil Glc H feruloil 65 sinapoil Glc H sinapoil O O O O R2O AcO OH R3O HO AcO Glc O OH BzO O HO OR1

Fig. 2.16 Struttura reinosio F-J

Composto R1 R2 R3

66 (E)-p-cumaroil (E)-p-cumaroil H

67 feruloil (E)-p-cumaroil H

68 feruloil feruloil Glc

27

2.1.3 Flavonoidi

I flavonoidi sono una classe di costituenti secondari molto diffusa nel regno vegetale, di norma sotto forma di glicosidi. Si tratta di oltre 4000 strutture nella parte agliconica tutte riconducibili a un’unità base a 15 atomi di C (C6-C3-C6) del flavano, 2-fenilcromano (Fig.

2.17), costituito da due anelli benzenici (A e B) tenuti insieme da una catena di 3 atomi di carboni facente parte del sistema eterociclico del pirano (anello C) (Morelli, 2006).

O 1 2 3 4 5 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' A B C Fig. 2.17 2-fenilcromano

Da un punto di vista biosintetico i flavonoidi vengono preparati a partire da unità base provenienti dalla via dell’acido shikimico e dell’acetato. L’acido 4-idrossicinnamico (proveniente dalla via dell’acido shikimico) si combina con tre unità di acetato, originando un intermedio polichetidico. La ciclizzazione intramolecolare porta infine alla costruzione del nucleo base dei flavonoidi.

I flavonoidi sono divisibili in 12 classi a seconda delle caratteristiche strutturali. Nonostante siano composti molto abbondanti in natura, la letteratura riguardo al genere Polygala L. riporta poco.

In P. japonica Houtt. sono state trovate le polygaline A-C (70-72) (Fig. 2.18) (Li et al., 2006b), in P. paniculata L. è stata riportata la presenza di rutina (Lapa et al., 2009), mentre in P. caudata Rehder & E. H. Wilson, sono state isolate quercetina e diidroquercetina (Fig. 2.19) (Li et al., 1998).

28 O OH MeO OH O OR2 R1

Fig. 2.18 Struttura polygaline A-C

O OH OH O OH OH HO Diidroquercetina O OH OH HO OH O O OHO OH OH O O HO OH HO Rutina O OH HO OH O OH OH Quercetina

Fig. 2.19 Struttura rutina, quercetina e diidroquercetina

Composto R1 R2

70 H Gal

71 H Api(1→2)Gal

29

2.1.4 Altri metaboliti secondari



Xantoni

Gli Xantoni sono composti C6-C1-C6 strutturalmente legati ai flavonoidi, ma più ristretti

nella distribuzione in natura. Sono caratterizzati dalla presenza di tre anelli condensati, lineari con carbonile in posizione 9 e in 10 un eteroatomo di ossigeno (Fig. 2.20).

O

o

A

B

C

Fig. 2.20 Nucleo xantonico

I due anelli aromatici A e B sono caratterizzati dalla presenza di più gruppi ossidrilici che possono essere liberi (-OH), metilati (-OMe) o glicosilati.

Da un punto di vista biosintetico si formano attraverso la via mista dell’acido acetico e dell’acido shikimico: l’anello A proviene dalla via dell’acetato, mentre l’anello B e il carbonile in C-9 dall’acido shikimico (Morelli, 2006.). La fenilalanina, formata dallo shikimato, perde due atomi di carbonio dalla catena laterale ed è ossidata ad acido idrossibenzoico. Questo si combina con tre unità di acetato (via malonato) per dare l’intermedio acetato-shikimato. Tale intermedio ciclizza per dare il benzofenone. Con una reazione di accoppiamento ossidativo fenolico tra i due cicli del benzofenone si forma lo xantone. L’accoppiamento può avvenire in due diversi modi, a seconda della posizione dei sostituenti, in orto o in para rispetto al gruppo ossidrilico generato dallo shikimato (Negi et al., 2013).

La letteratura riporta gli xantoni in P. tenuifolia Willd., P. caudata Rehder & E. H. Wilson, P. alpestris Rchb., P. sibirica L., P. hongkongensis Hemsl., P. japonica Houtt., P. crotalarioides DC., P. cyparissias A. St.-Hill. & Moq., P. paniculata L., P. tricornis

30

Gagnep., P. vulgaris L., (Klein et al., 2012). Tuttavia gli xantoni in P. alpestre Rchb., P. tenuifolia Willd., P. paniculata L. posso essere considerati rappresentativi del gruppo. Da P. tenuifolia Willd. sono stati isolati vari xantoni glicosidici tra cui polygalaxantone III (Ikeya et al., 1994), polygalaxantone IV-VII (Jiang e Tu, 2002), polygalaxantone VIII- XXI, sibiricoxantone B, 7-O-metilmangiferina e lancerina (Jiang et al., 2005).

In P. alpestris Rchb. e P. paniculata L., oltre alla presenza di xantoni strutturalmente simili a quelli riportati in P. tenuifolia Willd., sono stati scoperti xantoni caratterizzati da un quarto ciclo a cinque termini metilendiossi (-O-CH2-O-), inserito in posizione 2,3. In P.

alpestris Rchb. è stato scoperto il 4,7-diidrossi-2,3-(metilendiossi)-xantone (Dall’Acqua et al., 2004), in P. paniculata L. 1-idrossi-5-metosi-2,3-(metilendiossi)-xantone (Cristiano et al., 2003).



Benzofenoni

I benzofenoni sono una classe di metaboliti secondari poco frequenti nel genere Polygala. Formalmente riconducibili al benzofenone (difenilchetone), questi metaboliti secondari sono strettamente correlati agli xantoni, con i quali condividono la biosintesi, con la differenza che nei benzofenoni la reazione di accoppiamento fenolico ossidativo non avviene.

Fig. 2.20 Nucleo benzofenone

Sono stati ritrovati benzofenoni in alcune specie tra cui P. glomerata Lour., dove sono stati isolati i glomeratidi A–D (Li et al., 2008a), P. tenuifolia Willd., dove sono stati caratterizzati i tenuifenoni A–B (Jiang e Tu, 2005) e P. telephioides Willd., dove sono stati isolati i telefenoni A–C (Li e Nohara, 2000) e telefenone D (Ting-Jun et al., 2010).

31

2.2 Precedenti studi biologici

Nel corso degli anni numerosi sono stati gli studi di attività biologica sul genere Polygala L. Gli effetti terapeutici che gli sono attribuiti sono vari: dal trattamento dell’insonnia o della depressione, all’impiego come sedativo fino a l’uso come espettorante o ipoglicemizzante. Tutti questi effetti provengono dai suoi principali metaboliti secondari: xantoni, saponine e oligosaccaridi.

Nei paragrafi seguenti saranno prese in considerazione le principali attività terapeutiche di saponine e oligosaccaridi, le due principali classi di metaboliti secondari trovati nel corso dello studio su Polygala flavescens subsp. flavescens.

2.2.1 Saponine

L'ampia distribuzione in natura e le varie attività biologiche delle saponine hanno da sempre attirato l'attenzione dell’uomo. L'uso di queste sostanze come detergenti naturali, per l’azione simile ai saponi, e come veleno per i pesci sono noti sin dai tempi più antichi. I primi studi sull’attività biologica delle saponine furono condotti su estratti ricchi di miscele contenti saponine e altri costituenti. Di conseguenza, i risultati di tali studi furono accettati con riserva. Con l’avvento di strumentazioni e tecniche di isolamento sempre più efficienti è stato possibile, nel corso degli anni, non solo determinare la struttura di questi composti ma anche relazionarla con la loro attività biologica (Mahato et al., 1988).

L’azione irritante delle saponine è uno degli effetti più noti di questi costituenti. Nel 2004 l’WHO (World Health Organization) ha inserito Polygala Radix (radici essiccate di P. senega L. o P. tenuifolia Willd.) nelle monografie delle piante medicinali con l’effetto espettorante nel trattamento sintomatico delle tosse dovuta a bronchite ed eccesso di muco nelle vie aeree superiori. Queste azioni sono dovute alle saponine che irritando la mucosa del tratto respiratorio, stimolano la secrezione bronchiale. Contemporaneamente, per la loro capacità tensioattiva, diminuiscono la tensione superficiale del muco, riducendone la viscosità e facilitandone l’eliminazione (Klein et al., 2012). L’assunzione di Polygala Radix, soprattutto per periodi lunghi di trattamento e a dosi elevante, viene consigliata in associazione con il miele per diminuire l’irritazione gastrointestinale che provoca. Tale effetto è dovuto alla capacità delle saponine di ridurre la produzione di PGE2, naturali protettori della mucosa gastrica (Li et al., 2015).

32

È stato dimostrato che le saponine agiscono anche sul metabolismo. Ad esempio il reinoside C, isolato da P. aureocauda Dunn., è stato testato su topi iperlipemici in vivo e su cellule endoteliali, macrofagi e cellule muscolari lisce in vitro.I topi sono stati sottoposti a una dieta iperlipemica per 30 giorni, poi sono stati trattati con reinoside C per altri 30 giorni. Alla fine sono stati misurati i livelli di lipidi nel siero, la superossido dismutasi (SOD), la malaldeide (MDA), il colesterolo totale (TC) e i trigliceridi (TG) nel fegato. Le cellule endoteliali provenienti dalla vene ombelicale umana (HUVEC), i macrofagi peritoneali e le cellule muscolari lisce (SMC) sono state pre-trattate in vitro con reinoside C e successivamente con lipoproteine ossidate (OxLDL), a bassa densità. I risultati hanno mostrato che il reinoside C è stato capace di diminuire i livelli di lipidi nel siero e nel tessuto epatico dei topi iperlipemici. Inoltre, la saponina, in vitro, ha protetto i vari tipi di cellule dalle lesioni ossidative indotte da OxLDL. Sulla base di questi risultati, il reinoside C può essere considerato un promettente candidato nel trattamento dell’iperlipidemia (Li et al., 2008b).

Nel 1995 e nel 1996, Yoshikawa et al. dimostrarono che (E)- e (Z)-senegasaponine A-C e (Z)-senegina II, isolate da P. senega L., potevano avere un utilizzo come agenti ipoglicemizzanti. Tali composti infatti riducono i livelli di glucosio nel plasma di topi sottoposti a test orale sulla tolleranza del D-glucosio. Gli autori ipotizzarono inoltre, che tale effetto era probabilmente correlato alla presenza del gruppo 4-metossicinnamoil, poiché i composti testati, dove non era presente tale gruppo, avevano dimostrato minore attività ipoglicemizzante (Yoshikawa et al., 1995 e 1996).

I vaccini sono il miglior approccio nella prevenzione e nel controllo delle infezioni. I nuovi vaccini, come le proteine ricombinate, i plastidi di DNA o i peptidi sintetici, risultano un po’ meno attivi rispetto a quelli di vecchia generazione. Per questo è nato il bisogno di sviluppare sostanze che possano coadiuvarli nella loro azione. Questi “aiutanti immunologici” sono sostanze usate in combinazione con specifici antigeni per produrre un maggior effetto immunologico, rispetto alla somministrazione del solo vaccino (Sun et al., 2009). Katselis et al., hanno valutato l’attività immunostimolante di otto saponine pure, estratte dalle radici di P. senega L. su topi con l’antigene OVA. Dai test è stato osservato che le saponine onjisaponina A e B incrementavano i livelli di una sottoclasse di anticorpi, le IG2a, e la produzione di IL-2 (Katselis et al., 2007).

L’estratto acquoso, ottenuto con acqua calda dalle radici di Polygala tenuifolia Willd., si è rivelato contenere quattro saponine, onjisaponina A, E-D, identificate come i più potenti

33

immunostimolanti quando somministrati, per via intranasale, in combinazione con il vaccino per l’influenza nasale (HA) o difterite-pertosse-tetano (DPT) (Nagai et al., 2001).

Nel 2003 importanti studi condotti da Yabe et al. hanno dimostrato come le saponine possano diventare interessanti agenti terapeutici nella cura dell’Alzheimer. Questa malattia, spesso associata all’avanzare dell’età, è causata da una degenerazione dei neuroni colinergici a livello della corteccia e dell’ippocampo, sedi delle funzioni cognitive e della memoria, accompagnato da una diminuzione dei livelli dell’enzima colina acetil transferasi (ChAT). L’attività di questo enzima è influenzata dalla neurotropina (NGF), proteina capace di aumentare i livelli di ChAT. Purtroppo, a causa dell’elevato peso molecolare, NGF non può passare la barriera ematoncefalica e perciò non può essere somministrato come tale nella cura dell’Alzheimer. Per ovviare al problema, una soluzione si è rilevata la somministrazione di sostanze induttori della sintesi di NGF. Yabe et al. hanno dimostrato che le onjisaponine A, B, E-G, estratte dalle radici di P. tenuifolia Willd., aumentano i livelli di NGF secreto da colture in vitro di astrociti, costituenti delle cellule della glia e impegnati nello sviluppo e nel mantenimento delle funzioni neuronali. Questi risultati suggeriscono come l’uso di induttori può essere un nuovo approccio terapeutico contro le disfunzioni della trasmissione colinergica nei pazienti affetti da Alzheimer (Yabe et al., 2003).

34

2.2.2 Oligosaccaridi

Gli studi di attività biologica sugli oligosaccaridi isolati da Polygala L. sono molti, ma tutti trattano vari aspetti delle capacità neuroprotettive e cognitive che questi composti sembrano avere.

Ikeay et al., hanno dimostrato che due oligosaccaridi acilati, tenuifoliside B e 3,6'-disinapoil saccarosio, isolati dall’estratto EtOAc:MeOH di Polygala Radix, potevano migliorare la memoria e avere un’azione neuroprotettiva. I composti hanno dato ottimi risultati in caso di anossia indotta da KCN sui topi, suggerendo un’azione neuroprotettiva e un miglioramento delle facoltà cognitive (Ikeay et al., 2004). Nel 2007, lo stesso gruppo ha associato tali effetti alla porzione sinapoilica, che entrambe le molecole posseggono (Karakida et al., 2007).

Hu et al. hanno studiato gli effetti biochimici che il 3,6'-disinapoil saccarosio (DISS) aveva sui comportamenti legati alla depressione indotta attraverso stress cronico lieve (CMS) sui topi.

La depressione è una patologia molto comune ai giorni nostri. È dovuta a un alterazione dei marker neurochimici; spesso è associata a un’iperattività dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) ed elevati livelli di cortisolo. In un primo studio del 2009 Hu et al. hanno valutato come DISS influenzasse l’asse ipotalamo-ipofi-surrene. Nei topi CMS era stato rilevato un aumento dei livelli di corticotropina (CRT), adenocorticotropina (ACTH) e cortisolo, tutti ormoni controllati dal sistema HPA e implicati nella modulazione del comportamento. La somministrazione di DISS aveva riportato i livelli plasmatici alla normalità. In più si era verificato un aumento dei recettori per i glucorticoidi e i mineralcorticoidi. Questo suggerì che il 3,6'-disinapoil saccarosio poteva avere un effetto antidepressivo (Hu et al., 2009). In uno studio successivo del 2011 gli stessi autori hanno valutato come DISS potesse influenzare l’attività della monoammino ossidasi (MAO), della superossido desmutasi (SOD), i livelli di cortisolo e della malondialdeide (MDA), prodotto dell’ossidazione dei lipidi. I topi esposti a stress per 5 settimane consecutive registrarono un aumento dell’attività delle MAO-A e MAO-B, dei livelli di cortisolo nel plasma, un aumento dei livelli di MDA e una diminuzione dell’attività di SOD. Dalla terza settimana fu somministrato DISS, tramite intubazione gastrica, una volta al giorno per 3

35

settimane consecutive. I risultati mostrarono una diminuzione dell'attività di MAO-A e MAO-B e dei livelli di cortisolo. Inoltre DISS aumentò l'attività di SOD, inibendo l’ossidazione dei lipidi e riducendo la produzione di MDA. Questi dati suggerirono che DISS poteva avere potenti e rapide proprietà antidepressive, mediate attraverso il sistema enzimatico MAO e i sistemi ossidativi (Hu et al., 2011). Queste azioni antidepressive rendono 3,6'-disinapoil saccarosio un farmaco potenzialmente prezioso per il trattamento della depressione.

36

CAPITOLO 3

RISULTATI E DISCUSSIONE

3.1 Isolamento e identificazione dei composti 37

3.2 Composti isolati 40

3.3 Test d’inibizione dell’enzima lattato deidrogenasi

(LDH) 69

37

3.1 Isolamento e identificazione dei composti

Le parti aeree di Polygala flavescens subsp. flavescens, raccolte sulle colline delle Cerbaie, sono state essiccate e successivamente estratte con n-esano e metanolo. Dopo evaporazione del solvente, mediante rotavapor, si sono ottenuti i seguenti residui:

 estratto n-esanico (RE): 5.7 g  estratto metanolico (RM): 71.1 g

Dopo un’analisi degli estratti, mediante cromatografia su strato sottile (TLC) è stato scelto come oggetto di studio l’estratto metanolico. Tale estratto è stato ripartito tra AcOEt, n-BuOH e H2O e separato in tre residui differenti. Durante la ripartizione si è verificata la

precipitazione di un solido amorfo giallo (composto A), successivamente identificato come

rutina. Il residuo n-BuOH (15.5 g) è stato frazionato mediante cromatografia ad esclusione

molecolare (fase stazionaria Sephadex® LH-20) e separato in 18 frazioni principali (1-18). Le frazioni studiate sono state sottoposte a cromatografia HPCPC e HPLC (Fig. 3.1); al termine del lavoro sono stati caratterizzati in totale 7 composti:

 3 saponine triterpeniche (composti B, C, D)  2 oligosaccaridi noti (composti E, G)  2 flavonoidi noti (composti A, F)

La determinazione strutturale di tutti i composti è stata effettuata mediante spettrometria di massa (ESIMS, HRESIMS) e spettroscopia NMR (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, DQF-COSY, 1D-TOCSY).

Tramite la spettroscopia di massa ad alta (HRESIMS) e bassa risoluzione (ESIMS) è stato possibile calcolare la massa esatta dei composti incogniti e studiarne i profili di frammentazione caratteristici, espressi come rapporto massa/carica elettrica (m/z).

La maggior parte delle informazioni strutturali dei composti deriva dagli spettri NMR, ottenuti mediante l’utilizzo di duestrumenti operanti a campi diversi: 150 e 600 MHz. In entrambi gli strumenti è stato utilizzato come solvente CD3OD.

Gli esperimenti monodimensionali 1H e 13C-NMR hanno fornito informazioni sul numero di protoni presenti, il loro accoppiamento ed il valore delle costanti oltre al numero di atomi di carbonio.

38

Di fondamentale importanza nella determinazione strutturale dei composti sono stati gli esperimenti di spettroscopia bidimensionale sia di tipo omonucleare (1H-1H) che eteronucleare (1H-13C), fornendo informazioni di correlazione tra gli atomi.

Tra gli esperimenti omonucleari sono stati registrati il DQF-COSY e l’1-D TOCSY. Tramite DQF-COSY (Double Quantum Filtered COrrelated SpettroscopY), si sono ottenute informazioni sui protoni accoppiati attraverso due o tre legami. Inoltre tale tecnica ha permesso di assegnare i vari sistemi di spin presenti nella molecola anche laddove le costanti di accoppiamento erano molto piccole e, di conseguenza, i segnali non ben risolti.

L’esperimento 1D-TOCSY (Total Correlation SpettroscopY) si è rivelato utile nell’analisi spettroscopica in tutti i casi in cui il segnale di un singolo protone si rivelava molto complicato nel semplice spettro 1H-NMR. Questo esperimento ha permesso di costruire un sistema di spin eccitando selettivamente un protone che, grazie al trasferimento di magnetizzazione, ha consentito di evidenziare tutti gli altri protoni appartenenti allo stesso sistema.

Tra gli esperimenti eteronucleari sono stati registrati l’HSQC e l’HMBC.

L’HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), ha messo in evidenza l’accoppiamento 1

H-13C attraverso un legame (1J), correlando 13C con i protoni ad esso legati.

L’HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence), ha evidenziato la correlazione eteronucleare long range. Gli spettri hanno consentito di rivelare l’accoppiamento 1

H-13

39 Fig. 3.1 Schema riassuntivo del processo di isolamento dei composti A-G

Polygala flavescens subsp. flavescens Estratto metanolico 71.1 g Residuo n-BuOH Sephadex® LH-20 Frazione 2 HPCPC CHCl₃:MeOH:H₂O: iPrOH Frazione 2/10 HPLC MeOH:H₂O 55:45 Frazione 2/10/III Composto B Frazione 3 HPCPC CHCl₃:MeOH:H₂O: iPrOH Frazione 3/2 HPLC MeOH:H₂O 55:45 Frazione 3/2/III Composto C Frazione 4 HPCPC CHCl₃:MeOH:H₂O: iPrOH Frazione 4/5 HPLC MeOH:H₂O 3:2 Frazione 4/5/III Composto D Frazione 10 HPLC MeOH:H₂O 2:3 Frazione 10/2 Composto E Frazione 12 HPLC MeOH:H₂O 2:3 Frazione 12/3 Composto F Frazione 12/4 Composto G Composto A

40

3.2 Composti isolati

3.2.1 Composto A

Il composto A, del peso di 7.0 g, è precipitato come solido amorfo giallo durante la ripartizione dell’estratto metanolico di Polygala flavescens subsp. flavescens in AcOEt:H2O (1:1).

La formula molecolare del composto C27H30O16 (PM 610) è stata determinata tramite

esperimento ESIMS in fase negativa, il quale mostrava un picco quasi molecolare a m/z 609 [M – H]-.

Altre frammentazioni importanti sono state identificate a:





I dati NMR, riportati in Tab. 3.1 e 3.2, mostravano la presenza di una struttura agliconica, riconducibile alla quercetina e una glicosidica, formata da due zuccheri. Il confronto dei dati ESIMS e NMR con quelli riportati in letteratura ha permesso di identificare il composto come quercetin 3-O-rutinoside o rutina (Fig. 3.2), composto già noto in letteratura, e ritrovato frequentemente nel regno vegetale (Kazuma et al., 2003).

O O OH OH HO O O CH2 O OH HO HO OH OH H3C HO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 4' 2' 3' 5' 6' Glc Rha 1 1 6 6 OH O

Fig. 3.2 Struttura composto A Glc = glucopiranosio Rha = ramnopiranosio

41 Tab. 3.1 Dati 1H e 13C NMR dell’aglicone del composto A a

Posizione δH δC 2 - 159.0 3 - 135.4 4 - 179.4 5 - 163.0 6 6.08 d (2.0) 99.9 7 - 166.0 8 6.24 d (2.0) 96.4 9 - 159.3 10 - 105.7 1' - 122.9 2' 7.67 dd (7.3, 2.0) 116.2 3' - 146.1 4' - 149.8 5' 6.84 (8.3) 117.4 6' 7.61 dd (2.0, 8.3) 123.5

Tab. 3.2 Dati 1H e 13C NMR della porzione zuccherina del composto A a

Posizione δH δC Glc 1 5.10 d (7.7) 105.5 2 3.46 dd (7.7, 8.9) 75.8 3 3.40 t (8.9) 78.3 4 3.26 t (8.9) 71.4 5 3.32 m 77.2 6a 3.80 dd (2.5, 11.0) 68.7 6b 3.38 dd (5.0, 11.0) - Rha 1 4.52 d (1.5) 102.5 2 3.62 dd (1.5, 3.4) 72.1 3 3.53 dd (3.4, 9.6) 72.2 4 3.27 t (9.6) 74.0 5 3.44 m 69.8 6 1.14 d (6.2) 17.9 a

Gli spettri sono stati eseguiti in metanolo-d4 a 600 MHz ( 1

H) e 150 MHz (13C). I valori di chemical shift (δ) sono indicati in ppm e le costanti di

accoppiamento J tra parentesi in Hz.

a

Gli spettri sono stati eseguiti in metanolo-d4 a 600 MHz ( 1

H) e 150 MHz (13C). I valori di chemical shift (δ) sono indicati in ppm e le costanti di

42

3.2.2 Composto B, nuova saponina triterpenica

Il composto B, del peso di 1.2 mg, è stato isolato a partire dalla frazione principale 2 ottenuta dopo cromatografia liquida a esclusione molecolare (Sephadex® LH-20). La frazione 2 è stata prima sottoposta ad HPCPC (CHCl3:MeOH:H2O:iPrOH); dopo

opportune riunioni, la frazione 2/10 è stata sottoposta ad HPLC (MeOH:H2O 55:45) in

modo da isolare il composto B.

La formula molecolare C67H106O35 (PM 1470) è stata determinata mediante dati HRESIMS

e ESIMS.

Lo spettro ESIMS, in modalità negativa, del composto mostrava un picco quasi molecolare a m/z 1469 [M – H]–. Sono state inoltre individuate altre frammentazioni importanti:

 m/z 1439 [M – H – 30]–, per la perdita di un gruppo -CH2OH  m/z 1379 [M – H – 30 – 60]–, per la perdita di un gruppo acetilico  m/z 1277 [M – H – 30 – 162]–, per la perdita di un esoso

 m/z 1173 [M – H – 30 – 60 – 44 – 162]–, per la perdita un gruppo carbonilico  m/z 1011 [M – H -30 – 60 – 44 – 162 – 162]–, per la perdita di un secondo esoso In modalità positiva, lo spettro ESIMS ha evidenziato una porzione zuccherina formata da due esosi, due deossiesosi e un pentoso a m/z 747 [162 + 162 + 146 + 146 + 132 – H]–.

L'analisi dei dati NMR (Tab 3.3 e 3.4) ha portato alla caratterizzazione di una saponina triterpenica con sei unità di zucchero e un gruppo acetilico. All'aglicone del composto B, il quale presentava un gruppo idrossimetilenico in C-27, è stata attribuita la struttura di acido 2β,3β,27-triidrossiolean-12-en-23,28-dioico noto anche con il nome di presenegenina. Per la porzione glicosidica, i dati forniti dallo spettro 1H-NMR mostrano: un segnale di singoletto a δ 2.18 per la presenza di un gruppo acetilico e a δ 4.32 (d J=8.0), δ 4.45 (d J=7.8), δ 4.54 (d J=7.5), δ 5.41 (d J=7.8) e δ 5.47 (d J=1.8) la risonanza dei protoni anomerici. Utilizzando una combinazione di esperimenti 1D-TOCSY, DQF-COSY, HSQC e HMBC è stato possibile stabilire il tipo e la posizione dei residui zuccherini. In posizione C-3 è legato un residuo di glucosio mentre gli altri 5 zuccheri si trovano legati al carbonile in posizione 28. In particolare, la catena zuccherina in C-28 presentava un residuo interno di β-fucopiranosio acetililato in posizione C-4 (δH 5.41, δC 75.0), un α-ramnopiranosio

interno, un β-xilopiranosio interno, un β-glucopiranosio terminale e un β-galattopiranosio terminale. I frammenti ESIMS/MS e l’esperimento HMBC hanno portato a stabilire le

43

posizioni dei legami tra le unità di zucchero interne, che sono in accordo con quelle riportate in precedenza per le catene saccaridiche delle saponine del genere Polygala (Yoshikawa et al., 1996). Sulla base di questi dati il composto B è stato caratterizzato come presenegenin 3-O-β-D-glucopiranosil 28-O-{β-D-galactopiranosil-(1→4)-β-D -xilopiranosil-(1→4)-α-L-rhamnopiranosil-(1→2)-[β-D -glucopiranosil-(1→3)]-[4-O-acetil]}-β-D-fucopiranosil estere (Fig 3.3).

O HO CH2OH COOH O CH2OH HO HO OH C O O O O O O O O O O O OCOCH3 CH3 OH OH H3C CH₂OH HO HO HO OH OH CH2OH OH HO OH 1 2 3 4 1 4 6 1 4 6 1 4 1 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ₁₆ 17 18 19 20 21 22 29 30 25 ₂₆ 23 24 28 27 Glc 6 Fuc Glc' Gal Xil Rha 1 6

Fig. 3.3 Struttura composto B Glc = Glucosiopiranosio

Fuc = Fucopiranosio Rha = Ramnopiranosio

Xil = Xilopiranosio Gal = Galattopiranosio

44 Tab. 3.3 Dati 1H e 13C NMR dell’aglicone del composto B a

Posizione δH δC 1a 2.28b 44.7 1b 2.08 dd (13.0, 3.0) 2 4.29 br dd (7.0, 3.5) 71.2 3 4.09 d (2.5) 83.1 4 - 52.5 5 1.70b 52.0 6a 1.60b 21.5 6b 1.30b 7a 1.59b 32.0 7b 1.29b 8 - 41.0 9 1.88b 49.0 10 - 37.1 11a 2.00b 23.7 11b 1.64b 12 5.66 (3.5) 128.4 13 - 139.2 14 - 48.3 15 1.65b 25.0 16a 1.64b 23.7 16b 1.32b 17 - 47.4 18 2.80 dd (13.5, 3.0) 42.0 19a 1.6b 46.2 19b 1.21 m 20 - 31.0 21a 1.37 m 34.3 21b 1.25b 22a 2.37 m 34.7 22b 1.60b 23 - 180.0 24 1.36 s 14.0 25 1.27 s 16.5 26 0.75 s 18.0 27a 3.79b 62.3 27b 3.76b 28 - 177.0 29 0.93 s 33.0 30 0.92 s 23.0 a

Gli spettri sono stati eseguiti in metanolo-d4 a 600 MHz ( 1

H) e 150 MHz (13C). I valori di chemical shift (δ) sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J tra parentesi in Hz.

b

45 Tab. 3.4 Dati 1H e 13C NMR porzione zuccherina del composto B a

Posizione δH δC Glc-1 4.34 d (8.0) 104.1 2 3.24 dd (9.5, 8.0) 75.1 3 3.37 t (9.5) 77.6 4 3.30 t (9.5) 71.0 5 3.28 m 77.5 6a 3.92 dd (12.0, 2.5) 62.5 6b 3.69 dd (12.0, 5.0) Fuc-1 5.49 d (7.8) 94.5 2 3.97 dd (9.0, 7.8) 72.7 3 4.05 dd (9.0, 4.0) 79.5 4 5.41 dd (4.0, 2.5) 75.0 5 3.85 m 72.0 6 1.15 d (6.0) 16.0 COCH3 - 172.0 COCH3 2.18 s 20.4 Rha-1 5.51 d (1.8) 101.2 2 3.97 dd (3.0, 1.8) 71.5 3 3.90 dd (9.0, 3.0) 71.0 4 3.54 t (9.0) 84.0 5 3.86 m 68.3 6 1.32 d (6.5) 18.0 Xyl-1 4.51 d (7.5) 106.0 2 3.16 dd (9.0, 7.5) 75.0 3 3.49 t (9.0) 76.0 4 3.37 m 77.6 5a 4.04 dd (11.0, 2.5) 64.7 5b 3.31 dd (11.0, 5.0) Gal-1 4.39 d (7.5) 104.1 2 3.59 dd (8.0, 7.5) 72.0 3 3.52 dd (8.0, 4.0) 74.6 4 3.83 dd (4.0, 2.5) 70.0 5 3.64 m 75.9 6a 3.76 dd (11.5, 2.5) 62.3 6b 3.69 dd (11.5, 4.5) Glc'-1 4.51 d (8.0) 105.2 2 3.24 dd (9.0, 8.0) 75.1 3 3.37 t (9.0) 77.6 4 3.23 t (9.0) 71.0 5 3.31 m 76.0 6a 3.92 dd (12.0, 3.0) 62.8 6b 3.62 dd (12.0, 4.5) a

Gli spettri sono stati eseguiti in metanolo-d4 a 600 MHz ( 1

H) e 150 MHz (13C). I valori di chemical shift (δ) sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J tra parentesi in Hz. I valori

46

3.2.3 Composto C, nuova saponina triterpenica

Il composto C, del peso di 1.7 mg, è stato isolato a partire dalla frazione principale 3 ottenuta mediante cromatografia liquida a esclusione molecolare (Sephadex® LH-20). La frazione 3 è stata sottoposta ad HPCPC (CHCl3:MeOH:H2O:iPrOH) e dopo opportune

riunioni, la frazione 3/2 è stata sottoposta ad HPLC (MeOH:H2O 55:45) e il composto C è

stato isolato.

La formula molecolare C65H104O33 (PM 1412) è stata determinata tramite dati HRESIMS e

ESIMS.

L’esperimento ESIMS, in modalità negativa, presentava frammentazioni caratteristiche a:  m/z 1249 [M − H − 162]−, per la perdita di un esoso

 m/z 1187 [M − H − 162 − 18 − 44]−, per la perdita di acqua e un acido carbossilico  m/z 1025 [M − H − 162 − 18 − 44 − 162]−, per la perdita di un secondo esoso Mentre lo spettro ESIMS in modalità positiva ha evidenziato un frammento a m/z 747 [162 + 162 + 146 + 146 + 132 − H]−, attribuibile alla porzione zuccherina composta da due esosi, due deossiesosi e un pentoso, suggerendo una struttura glicosidica simile a quella del composto B precedentemente isolato.

I dati forniti dallo spettro 1H NMR della porzione agliconica (Tab. 3.5) mostrano: sei singoletti attribuibili a gruppi metilici a δ 0.83, 0.93, 0.96, 1.17, 1.27 e 1.36, due segnali a δ 4.32 (br dd, J = 7.5, 4.0 Hz) e δ 4.11 (d, J = 3.0 Hz) tipici dei gruppi idrossimetinici, H-2ax

e H-3ax e a δ 5.32 (t, J = 3.5 Hz) la risonanza di un protone olefinico. L'analisi dei dati 13C

NMR ha rivelato 30 segnali, correlati tramite esperimento HSQC ai corrispondenti chemical shifts protonici. I dati hanno portato all’identificazione dell’aglicone acido 2β,3β-diidrossiolean-12-en-23,28-dioico o acido medicagenico.

Per quanto riguarda l’analisi della porzione glicosidica (Tab. 3.6), i dati NMR hanno, confermato quello che già era stato intuito dallo spettro ESIMS, evidenziando una struttura identica a quella del composto B, ad eccezione della mancanza del gruppo acetilico in posizione 4 del β-fucopiranosio.

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Il composto C è stato pertanto caratterizzato come acido medicagenico 3-O-β-D -glucopiranosil-28-O-{β-D-galactopiranosil-(1→4)-β-D-xilopiranosil-(1→4)-α-L

-ramnopiranosil-(1→2)-[β-D-glucopiranosil-(1→3)]}-β-D-fucopiranosil estere (Fig. 3.4). O HO CH3 COOH O CH2OH HO HO OH C O O O O O O O O O O O OH CH3 OH OH H3C CH2OH HO HO HO OH OH CH2OH OH HO OH 1 2 3 1 6 1 4 6 1 4 1 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 ₂₃ 11 12 13 18 14 15 27 16 17 19 20 30 29 21 22 28 26 25 Glc Fuc Glc'

Gal _Xil Rha

6

6

1 6

Fig. 3.4 Struttura composto C Glc = Glucopiranosio

Fuc = Fucopiranosio Rha = Ramnopiranosio

Xil = Xilopiranosio Gal = Galattopiranosio

48 Tab. 3.5 Dati 1H e 13C NMR dell’aglicone del composto C a

Posizione δH δC 1a 2.10b 44.1 1b 1.24b 2 4.32 br dd (7.5, 4.0) 70.8 3 4.11 d (3.0) 86.0 4 - 52.8 5 1.63b 52.5 6a 1.59 m 20.8 6b 1.28b 7a 1.54ab 33.0 7b 1.35b 8 - 41.0 9 1.60b 48.8 10 - 36.7 11a 2.08b 23.6 11b 1.62b 12 5.32 t (3.5) 122.4 13 - 144.0 14 - 42.7 15a 1.68 m 28.3 15b 1.21b 16a 1.64b 23.5 16b 0.96b 17 - 47.4 18 2.87 dd (13.5, 3.0) 42.0 19a 1.74 m 46.0 19b 1.16 m 20 - 31.3 21a 1.41 m 34.4 21b 1.22b 22a 1.85 ddd (16.0, 13.5, 4.0) 31.2 22b 1.55b 23 - 185.0 24 1.36 s 13.4 25 1.27 s 16.4 26 0.83 s 17.0 27 1.17 25.6 28 - 177.0 29 0.93 s 32.8 30 0.96 s 23.5 a

Gli spettri sono stati eseguiti in metanolo-d4 a 600 MHz ( 1

H) e 150 MHz (13C). I valori di chemical shift (δ) sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J tra parentesi in Hz

b

49 Tab. 3.6 Dati 1H e 13C NMR porzione zuccherina del composto C a

Posizione δH δC Glc-1 4.42 d (8.0) 103.5 2 3.23 dd (9.5, 8.0) 75.2 3 3.36 t (9.5) 77.2 4 3.32b 70.5 5 3.32b 77.1 6a 3.92 dd (12.0, 2.5) 61.7 6b 3.69 dd (12.0, 5.0) Fuc-1 5.41 d (7.8) 93.8 2 3.65 dd (9.0, 7.8) 75.7 3 3.86 dd (9.0, 4.0) 85.0 4 3.66 dd (4.0, 2.5) 70.6 5 3.74 m 71.0 6 1.16 d (6.0) 16.4 Rha-1 5.47 d (1.8) 99.5 2 3.95 dd (3.0, 1.8) 71.5 3 3.99 dd (9.0, 3.0) 70.9 4 3.52 t (9.0) 84.0 5 3.83 m 69.0 6 1.30 d (6.5) 18.0 Xyl-1 4.54 d (7.5) 104.5 2 3.23 dd (9.0, 7.5) 74.7 3 3.29 t (9.0) 76.6 4 3.36 m 77.0 5a 4.04 dd (11.0, 2.5) 64.5 5b 3.28 dd(11.0, 5.0) Gal-1 4.45 d (7.8) 105.7 2 3.53 dd (9.0, 7.8) 73.6 3 3.48 dd (9.0, 3.5) 75.4 4 3.84 dd (3.5, 2.0) 70.7 5 3.73 m 76.0 6a 3.86 dd (11.0, 2.5) 61.5 6b 3.65 dd (1105, 5.0) Glc'-1 4.42 d (8.0) 103.0 2 3.24 dd (9.0, 8.0) 75.1 3 3.37 t (9.0) 77.6 4 3.30 t (9.0) 70.0 5 3.31 m 76.0 6a 3.83 dd (12.0, 3.0) 62.0 6b 3.70 dd (12.0, 4.5) a

Gli spettri sono stati eseguiti in metanolo-d4 a 600 MHz ( 1

H) e 150 MHz (13C). I valori di chemical shift (δ) sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J tra parentesi in Hz. I valori

sono stati confermati da esperimenti COSY, 1D-TOCSY, HSQC e HMBC.

b

50

3.2.4 Composto D, nuova saponina triterpenica

Il composto D, del peso di 5.5 mg, è stato isolato a partire dalla frazione principale 4 ottenuta mediante cromatografia liquida a esclusione molecolare (Sephadex® LH-20). La frazione 4 è stata sottoposta ad HPCPC (CHCl3:MeOH:H2O:iPrOH); dopo opportune

riunioni, la frazione 4/5 è stata sottoposta ad HPLC (MeOH:H2O 3:2) e il composto D è

stato così isolato.

La formula molecolare C55H86O24 (PM 1130) è stata determinata tramite spettrometria

HRESIMS e HRESIMS/MS in modalità positiva (m/z 1153.5412 [M + Na]+) (Fig. 3.5 e 3.6)

Lo spettro ESIMS in modalità negativa presentava frammentazioni a:

 m/z 907 [M − H − 60 − 162]−, per la perdita di un gruppo acetilico e un esoso  m/z 761 [M − H − 60 − 162−146]−, per la perdita di un deossiesoso

 m/z 629 [M−H−60−162−146−132]−, per la perdita di un pentoso