Metodo HPLC-MS-MS - Caratterizzazione di due modelli cellulari NG 108-15 e U87 MG trattati con

In questo studio è stato utilizzato un metodo cromatografico già sviluppato e ottimizzato in laboratorio, che permette la separazione di T1AM e TA1. La colonna cromatografica utilizzata è

stata una colonna Gemini C18 (Phenomenex Torrance,CA), 100 Aº, 2x50 mm e 3µm. Questo tipo di colonna a fase inversa presenta una fase stazionaria idrofobica ed è una delle più utilizzate in analisi LC-MS. La scelta delle fasi mobili è altrettanto importante nello sviluppo e applicazione di un metodo cromatografico. Le fasi mobili erano costituite da metanolo:acetonitrile (ACN) (1:4 v:v) contenente 0,1 % acido formico (Fase A) e H2O contenente 0.1 % acido formico (Fase B). Variando

la percentuale di A e B durante la corsa cromatografica, si crea un gradiente di eluizione ottimizzato per la corretta separazione degli analiti di interesse. Il gradiente utilizzato in questo metodo è riportato in figura 12. Durante la corsa cromatografica, la colonna è stata mantenuta ad una temperatura di 20 °C all’interno di un forno termostatato e il flusso di fase mobile era stato impostato a 300 µL/min. Il metodo SRM utilizzato prevedeva l’utilizzo dei seguenti frammenti: 356.2→165.3, 356.2→195.1, 356.2→212.2, 356,2→339.0 Da per T1AM, analizzato in modalità

37 -2 0 2 4 6 8 0 50 100 min c o n c e n tr a z io n e % Fase A Fase B

Figura 12. Grafico della variazione del gradiente della fase mobile durante l'analisi cromatografica; in blu la Fase A (metanolo:aceto nitrile, contenente lo 0,1 % di acido formico), in rosso la Fase B (acqua

contenente lo 0,1% di acido formico).

Esistono dei limiti strumentali al di sotto dei quali non è possibile misurare la concentrazione delle molecole di interesse, questi variano da molecola a molecola perché dipendono da vari fattori tra cui la matrice in cui si trovano immerse le molecole oppure i gruppi funzionali. Per le molecole di interesse di questo studio i limiti sono:

- per T1AM di 0,3 nM,

- per TA1 di 5 nM.

- per T3 e T4 di 1 nM

7.4.4 Ricerca dell’aldeide

Per la ricerca dell’ipotetica aldeide è stato utilizzato l’enzima amino ossidasi plasmatica di origine bovina (EC 1.4.3.21). L’enzima è stato sciolto in PBS e sono state preparate due soluzioni contenenti 2.8 mL di PBS (67 mM, fosfato di potassio pH 7.2), 0.1 mL di enzima (10 mg/mL) e 0.1 mL di T1AM. Nel primo esperimento la concentrazione di T1AM era di 0.88 mM, mentre nel

secondo era di soluzione era di 1.67 mM. La miscela così ottenuta è stata incubata per 10 min a 25 °C e centrifugata per 5 min a 14000 rpm per rimuovere l’eventuale pellet. A 0.5 mL di sovranatante sono stati aggiunti 1.5 mL di ACN per favorire la precipitazione proteica. Dopo centrifugazione, il

sovranatante è stato analizzato mediante HPLC-MS/MS operante in modalità Full Scan. In questa modalità, solamente il Q1 effettua una scansione su un range di massa determinato, mentre Q2 e Q3 fungono da guide verso il detector. Dato che l’ipotetico peso molecolare dell’aldeide è di circa 354 Da, il range di massa del Q1 (operante in modalità negativa) è stato impostato tra 100 e 400 Da.

Per verificare la presenza o meno di questa ipotetica aldeide sono state effettuate ulteriori prove utilizzando la lisina, un amminoacido la cui catena laterale potrebbe formare una base di Shiff con l’aldeide e quindi un nuovo addotto che non dovrebbe rendere visibile l’aldeide. La soluzione è stata preparata sciogliendo 1,33 mg di lisina in 1,09mL di PBS. La miscela di incubazione è stata preparata con 100 µL di enzima, 150 µL di lisina, 6 µL di T1AM e 1250 µL di PBS. A questo punto

sono stati ripetuti tutti i passaggi descritti precedentemente e l’analisi è stata effettuata mediante HPLC-MS-MS in modalità Full Scan.

8 Analisi statistica

Nelle figure sono indicati risultati rappresentativi dei vari esperimenti di uptake. I valori sono espressi come media ± SEM. Ciascun punto dei grafici è stato condotto in duplicato.

Per l’analisi dei dati e l’elaborazione dei grafici è stato usato il software GraphPad Prism versione 6.0 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). I campioni della spettrometria di massa sono analizzati con il software Analyst 1.6.2. (SCIEX).

9 Risultati

9.1 Uptake di T

AM

Da studi condotti nel 2017(27), è stato osservato che la concentrazione della T1AM a contatto con il

DMEM in presenza di FBS, senza essere messo in coltura con linee cellulari, tendeva a diminuire esponenzialmente nel tempo, già dopo circa 1 ora si riduceva del 10% , mentre sembrava formarsi in modo crescente nel tempo il suo catabolita TA1. In questo lavoro di tesi, è stato riprodotto lo

stesso esperimento ma apportando alcune modifiche: è stata valutata la variazione della T1AM nel

solo mezzo addizionato ma partendo da concentrazioni micromolari, le stesse utilizzate nei trattamenti per valutare gli effetti della T1AM sul sistema glutamatergico (Sacripanti et al,

unpublished observations), senza però entrare in contatto con la coltura cellulare; per mantenere il paragone con il trattamento su cellule è stato aumentato di conseguenza anche il tempo di incubazione, valutando la sparizione della T1AM fino a 24 ore. Il risultato ottenuto ha confermato

quello che era già stato dimostrato nello studio precedente: come mostrato in figura 13A, la T1AM,

presente nel mezzo addizionato con FBS, tendeva progressivamente a diminuire nel tempo a tutte le concentrazioni testate. A basse dosi (0,1 µM) la T1AM non era più misurabile dopo 4 ore, mentre

era ancora presente, anche se in tracce, dopo 24 ore alle dosi maggiori (1 e 10 µM). Contemporaneamente è stata rilevata la formazione, crescente nel tempo, del suo catabolita TA1

(figura 13B), che risultava essere rilevabile fino a 24 ore. Al tempo t=0 la presenza del catabolita non era misurabile, indicando l’assenza di produzione endogena di TA1.

0 2 4 10-1 100 101 102 103 104 105 15 18 21 24 Time (h) C o n c e n tr a ti o n ( n M ) T1AM 0,1M T1AM 1M T1AM 10M

A.

41 . 0 2 4 10-1 100 101 102 103 104 15 18 21 24 Time (h) C o n c e n tr a ti o n ( n M ) TA₁ medium T₁AM 0,1M TA₁medium T₁AM 1M TA₁medium T₁AM 10M

Figura 13. Variazione della concentrazione di T1AM nel mezzo contente FBS in assenza di cellule e

produzione di TA1: A, grafico della riduzione della concentrazione di T1AM . B, grafico della produzione di

TA1 in presenza di varie concentrazioni T1AM (0.1-1-10 µM)

L’esperimento è stato ripetuto, analizzando l’uptake della T1AM in presenza di due linee cellulari,

NG-108-15 e U-87MG. Sia la linea ibrida che quella umana sono state incubate con un mezzo di coltura standard in presenza di FBS e i trattamenti sono stati eseguiti con le stesse concentrazioni di T1AM. È stato valutato l’assorbimento di T1AM e la produzione di TA1 in entrambe le linee

cellulari sia nei mezzi di coltura che nei lisati cellulari.

Innanzitutto è stato analizzato l’andamento del TA1 addizionata al mezzo in assenza di cellule.

Come illustrato nella figura 14 la concentrazione non ha subito variazioni nel tempo, indicando che il catabolita non subisce ulteriori modificazioni in presenza di FBS.

42 0 2 4 10 100 1000 10000 100000 20 22 24 h n M TA1 0.1M TA1 1M TA1 10M

Figura 14. Rappresentazione dell'andamento di TA1 nel mezzo standard, incubato con solo TA1, in assenza

di cellule.

Inoltre una media dei valori a t=0 è stata utilizzata per il calcolo della concentrazione di TA1 negli

esperimenti qui di seguito descritti.

In entrambe le linee cellulari è stato osservato il seguente andamento, come illustrato nelle figure

15 e 16:

• Nei mezzi, è stato riscontrato un drastico calo della concentrazione di T1AM che tendeva a

zero entro poche ore dall’inizio del trattamento. In particolare la concentrazione di T1AM a

0,1 e 1 µM diventava non rilevabile dopo 2-3 ore, mentre quella di T1AM 10 µM era

rilevabile fino a 24 ore, lasciando ipotizzare la saturazione del sistema enzimatico di catalisi. Inoltre è stata osservata una notevole produzione di TA1, rilevabile già dopo un’ora di

trattamento e misurabile fino a 24 ore, presentando valori anche superiori alla concentrazione iniziale di T1AM.

• Nei lisati invece, è stato rilevato un assorbimento della T1AM misurabile già a t=1h e

successivamente una diminuzione della sua concentrazione che avveniva più lentamente, ma comunque rilevabile fino al termine del trattamento (24 ore). Anche nei lisati è stato osservata la formazione di TA1, dopo un’ora di trattamento, anche se presente a

concentrazione circa 10 volte inferiori rispetto alle concentrazione nel mezzo. In quasi tutti i campioni comunque la concentrazione del catabolita è rimasta costante per tutta la durata del trattamento.

I risultati indicano che le linee cellulari utilizzate sono in grado di assorbire la T1AM ma anche di

metabolizzarla con produzione del suo catabolita TA1, come riscontrato nel primo esperimento con

il solo mezzo. Inoltre la formazione di TA1 si riscontra anche a livello intracellulare e il catabolita

non sembra subire ulteriori processi chimici.

NG 108-15

(a)

0 2 4 1 0- 2 1 0- 1 1 00 1 01 1 02 1 03 1 04 1 05 2 0 2 2 2 4 T im e ( h ) C o n c e n tr a ti o n ( n M ) T 1 A M m e d iu m T 1 A M 0 .1 M T 1 A M m e d iu m T 1 A M 1 M T 1 A M m e d iu m T 1 A M 1 0 M T 1 A M ly s a te T 1 A M 0 .1 M T 1 A M ly s a te T 1 A M 1 M T 1 A M ly s a te T 1 A M 1 0 M

(b)

0 2 4 1 0- 1 1 00 1 01 1 02 1 03 1 04 2 0 2 2 2 4 T im e ( h ) C o n c e n tr a ti o n ( n M ) T A 1 m e d iu m T 1 A M 0 .1 M T A 1 m e d iu m T 1 A M 1 M T A 1 m e d iu m T 1 A M 1 0 M T A 1 ly s a te T 1 A M 0 .1 M T A 1 ly s a te T 1 A M 1 M T A 1 ly s a te T 1 A M 1 0 M

Figura 15. Uptake cellulare di T1AM nella linea NG108-15 nei mezzi e nei lisati e produzione di TA1: (a) grafico

rappresentativo della variazione di concentrazione della T1AM rilevata nel mezzo (in rosso) e assorbimento della

T1AM da parte delle cellule (in nero) (lisato); (b)produzione del TA1 nel mezzo (in rosso) e nel lisato (in nero) alle

U-87 MG

(a)

0 2 4 1 0- 1 1 00 1 01 1 02 1 03 1 04 1 05 2 0 2 2 2 4 T im e ( h ) C o n c e n tr a ti o n ( n M ) T 1 A M m e d iu m T 1 A M 0 .1 M T 1 A M m e d iu m T 1 A M 1 M T 1 A M m e d iu m T 1 A M 1 0 M T 1 A M ly s a te T 1 A M 0 .1 M T 1 A M ly s a te T 1 A M 1 M T 1 A M ly s a te T 1 A M 1 0 M

(b)

0 2 4 1 0- 1 1 00 1 01 1 02 1 03 1 04 1 05 2 0 2 2 2 4 T im e ( h ) C o n c e n tr a ti o n ( n M ) T A 1 ly s a te T 1 A M 0 .1 M T A 1 ly s a te T 1 A M 1 M T A 1 ly s a te T 1 A M 1 0 M T A 1 m e d iu m T 1 A M 0 .1 M T A 1 m e d iu m T 1 A M 1 M T A 1 m e d iu m T 1 A M 1 0 M

Figura 16. Uptake cellulare di T1AM nella linea U87 MG nei mezzi e nei lisati e produzione di TA1: (a) grafico

rappresentativo della variazione di concentrazione della T1AM rilevata nel mezzo (rosso) e assorbimento della

T1AM da parte delle cellule (in nero) (lisato); (b) produzione del TA1 nel mezzo (in nero) e nel lisato (in rosso)

alle varie concentrazioni di T1AM. I valori relativi a TA1 lisati T1AM 0,1µM non sono significativi perché al di

Come esperimento di controllo, per valutare l’eventuale presenza di T1AM endogena, le cellule

NG 108-15 sono state trattate con DMEM e FBS senza aggiunta di T1AM. L’estrazione sia dei

mezzi che dei lisati non ha rilevato né la presenza di T1AM né quella del suo catabolita TA1. Lo

stesso esperimento è stato ripetuto sostituendo l’FBS con il siero umano nel mezzo di coltura o trattando le cellule con solo siero umano, ottenendo comunque gli stessi risultati negativi. Con questi dati è quindi possibile escludere la presenza o la produzione di T1AM endogena e del suo

catabolita da parte delle cellule e dei sieri bovino e umano.

9.2 Ricerca dell’aldeide

Questo lavoro di tesi si è concentrato anche sulla ricerca dell’ipotetica aldeide come intermedio del catabolismo della T1AM a TA1 (figura 17).

Figura 17. Illustrazione del possibile metabolismo: la T1AM è soggetta a deamminazione ossidativa da parte

delle amino ossidasi (nell'immagine è indicata l'amino ossidasi semicarbazide sensibile, SSAO). L’aldeide tiroacetica prodotta (in questa immagine in equilibrio con la sua forma enolica) è successivamente ossidata

dall’aldeide deidrogenasi ad acido 3-iodotiroacetico, TA1

Quindi sono state effettuate una serie di prove utilizzando l’enzima amino ossidasi plasmatica bovina che viene messa a contatto con la T1AM, utilizzata a due concentrazioni (25 µM e 100 µM).

I risultati sono stati ottenuti mediante HPLC-MS/MS operante in modalità Full Scan. Dall’analisi della miscela contenente T1AM a 25 µM e in presenza dell’enzima è stato rilevato, in modalità Full

Scan positivo, un picco a m/z 356.2 Da corrispondente alla T1AM. Questo picco non è stato

osservato in modalità Full Scan negativa molto probabilmente a causa di una concentrazione troppo bassa della T1AM iniziale. Infatti, nella miscela contenente T1AM a 100 µM si osserva il picco a

m/z 354 Da corrispondente alla T1AM (MW 355 Da), anche in modalità negativa (figura 18A).

Inoltre, sempre in modalità Full Scan di ioni negativi, compare anche il picco a m/z 352.9 Da (MW aldeide tiro acetica 354 Da), corrispondente all’ipotetica aldeide e un picco a m/z 399 Da, corrispondente a un ipotetico addotto con acido formico (HCOOH, MW 46 Da) (figura 18B).

Figura 18. Spettro di massa della T1AM 100 µM in Full Scan, modalità negativa. A. Nello spettro A è

indicato il picco relativo a T1AM con rapporto m/z 354 Da; B. Nello spettro B è indicato il picco

dell'ipotetica aldeide 3-iodotiroacetica m/z 352.9 Da e del suo potenziale addotto con acido formico con rapporto m/z 399 Da.

Da questi grafici non si osservava la formazione di TA1 (m/z 369.1 Da), quindi questo fa ipotizzare

che se la reazione è avvenuta si è fermata alla formazione dell’aldeide. Con questi soli dati non è stato possibile affermare con certezza che quel picco a 352.9 Da sia relativo all’aldeide che stiamo

A

cercando. Per cercare di confermarne l’identità è stata fatta una frammentazione dello ione dell’ipotetica aldeide, ottenendo i seguenti frammenti:

- un frammento a 126.9 Da, probabilmente corrispondente all’atomo di iodio, questo confermerebbe l’effettiva provenienza della molecola dalla T1AM

- un frammento a 225 Da che potrebbe corrispondere allo scheletro dell’ipotetica aldeide dopo perdita di iodio (figura 19)

Figura 19. Rappresentazione della frammentazione dello ione dell'ipotetica aldeide: il picco a 352.9 Da è il peso molecolare dello ione aldeide, il picco a 225 Da rappresenta il frammento che ha perso lo iodio

(frammento 126.8 Da).

La frammentazione di questo ione ha rafforzato l’ipotesi che la molecola rilevata fosse un derivato della T1AM.

È stato frammentato anche lo ione dell’ipotetico addotto a m/z 399 Da. Dalla frammentazione si ottiene un picco a m/z 353 Da che potrebbe corrispondere a quello dell’aldeide, un picco a m/z 126.9 Da che potrebbe corrispondere allo ione iodio, confermando che l’addotto deriva da molecole contenenti iodio.

Un ulteriore prova, per confermare la presenza di una eventuale aldeide come intermedio del catabolismo della T1AM a TA1, è stato l’utilizzo della lisina. Dato che questo amminoacido può

formare una base di Shiff con l’aldeide, quello che ci si aspetta di osservare, nel caso in cui sia presente l’aldeide, è un picco corrispondente alla formazione del rispettivo addotto con un peso molecolare di circa 500 Da. I risultati sono stati ottenuti andando ad aumentare il range di massa di

Q1 a 250-550 Da in modo da osservare picchi relativi alla possibile formazione dell’addotto. Sono stati rilevati due picchi più intensi: uno a 353 Da, corrispondente all’ipotetica aldeide e l’altro a 398.9 Da, corrispondente all’ipotetico addotto (figura 20).

Figura 20. Spettro di massa della T1AM in Full Scan, modalità negativa in presenza della lisina, aminoacido

con catena laterale contenente un gruppo amminico. Si nota la presenza del picco relativo all'ipotetica aldeide tiroacetica con rapporto m/z 353 Da e dell’addotto con acido formico, m/z 398.9 Da. Non sono stati

rilevati picchi relativi ad addotti con la lisina

Nonostante i risultati ottenuti, non si può avere la certezza che vi sia come intermedio, del catabolismo della T1AM, l’aldeide.

Per confermare la presenza dell’aldeide è stata sintetizzata (Sestito et al unpublished observations) la molecola da utilizzare come standard interno. L’aldeide di sintesi però presenta un gruppo metilico di protezione legato al gruppo ossidrilico, rendendola non identica alla molecola naturale (figura 21).

Figura 21. Struttura molecolare dell'aldeide usata come standard interno. La molecola presenta un gruppo metossi al posto del gruppo ossidrilico presente nell'ipotetica aldeide.

L’aldeide è stata analizzata mediante HPLC-MS/MS e dai primi risultati ottenuti è stato rilevato un picco a 224 Da, già riscontrato in presenza dell’ipotetica aldeide tiroacetica. Il picco potrebbe derivare da una frammentazione della molecola che ha prodotto la perdita dello iodio e del gruppo metilico di protezione. Questi sono solo dati preliminari che necessitano di ulteriore conferma. La presenza del gruppo metilico potrebbe indurre un differente comportamento nella frammentazione rispetto all’aldeide che presenta il gruppo ossidrilico libero (figura 22).

Figura 22. Rappresentazione della frammentazione dello ione dell'aldeide di sintesi illustrata nella figura 21: si evidenziano un picco con rapporto m/z 366.9 Da, che rappresenta la molecola, e un picco m/z 223.8

10 Discussione

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare l’assorbimento e il metabolismo della T1AM a diverse concentrazioni, in presenza di un mezzo di coltura standard e utilizzando due linee

cellulari, una linea cellulare umana di glioblastoma (U-87MG) e una linea ibrida di neuroblastoma di topo e glioma di ratto (NG108-15) e di determinare la presenza dell’aldeide 3-iodotiroacetica come presunto intermedio del catabolismo della T1AM a TA1.

Lo studio ha evidenziato che le cellule neuronali sono in grado di assorbire e metabolizzare la T1AM a TA1, un catabolismo che inizia già nel mezzo contenente FBS. Al termine del trattamento

la T1AM era sempre comunque misurabile sia nel mezzo sia nel lisato cellulare soprattutto ad

elevate concentrazioni.

L’analisi dei risultati è avvenuta tramite HPLC-MS/MS e ha confermato quello che era già stato valutato in uno studio condotto negli anni precedenti (27), ovvero che la concentrazione di T1AM

tende ad essere metabolizzata appena a contatto con le proteine sieriche e che sin dall’inizio del trattamento si ha la produzione del suo catabolita TA1, la cui concentrazione tende a rimanere

costante nel tempo. Dai risultati ottenuti si conferma che il catabolismo della T1AM dipende da

specifiche proteine presenti nel siero fetale bovino utilizzato nel mezzo di coltura e che le elevate concentrazioni iniziali del composto permettono la sua rilevabilità fino al termine del trattamento. Con gli esperimenti di uptake è stato possibile verificare la capacità di T1AM di essere assorbito

dalle cellule e il suo metabolismo attraverso la produzione di TA1 considerato un catabolita della

T1AM. Nei mezzi, sia della linea ibrida che di quella umana, è stato osservato un drastico calo della

concentrazione di T1AM e un aumento della produzione di TA1 già dopo un’ora, in particolare è

stato osservato che la T1AM 0,1 e 1 µM risultava non più misurabile dopo circa 2-3 ore, a

differenza della T1AM 10 µM che invece risultava rilevabile anche dopo 24 ore. Nei lisati si

osservavano gli stessi andamenti anche se in maniera più graduale. Questi risultati hanno confermato che T1AM viene assorbito dalle cellule e a contatto con esse e con le proteine presenti

nel FBS viene catabolizzato a TA1. Inoltre la sua rilevabilità alla fine del trattamento indica che è

possibile utilizzare un mezzo addizionato con FBS senza compromettere l’efficacia dell’infusione nella coltura cellulare, soprattutto a concentrazioni superiori a 1µM . In questo modo è possibile evitare una drastica variazione del mezzo di coltura (in genere quando si utilizzano trattamenti con

composti esogeni si evita l’aggiunta di FBS al mezzo per non modificarne la concentrazione) che porterebbe ad alterazione nella cellula stessa.

Per verificare la produzione endogena della T1AM la linea cellulare NG 108-15 è stata incubata con

DMEM addizionato a cui è stato aggiunto siero umano o FBS senza T1AM esogeno. In questo caso

non è stata rilevata né la presenza di T1AM né di TA1. Il dato farebbe escludere la produzione

endogena di T1AM e del suo catabolita. Occorre però precisare che il metodo di estrazione

liquido/liquido è stato ottimizzato per concentrazioni micromolari di T1AM e potrebbe non essere

in grado di estrarre le basse quantità di metabolita endogeno. Per verificare ulteriormente l’assenza di metaboliti endogeni il siero umano è stato estratto con metodo su fase solida, in grado di rilevare concentrazioni nanomolari di prodotto, senza però ottenere risultati significativi, escludendo quindi la presenza di T1AM endogena nei campioni di siero umano analizzati.

La ricerca della presenza della T1AM è diventata un argomento molto dibattuto. Dati in letteratura

indicano che la T1AM endogena è presente praticamente in tutti i tessuti dei roditori con una

concentrazione dell'ordine di pochi pmol/g (nmol/Kg), rilevata dalla LC-MS (2, 27). Tuttavia, l'individuazione della T1AM nel sangue è più difficile: infatti, la concentrazione di T1AM nel

sangue umano e nel sangue di ratto, misurata mediante LC-MS, è molto bassa e spesso al di sotto del limite di rilevazione del saggio. È stato sviluppato anche un test immunologico, che ha permesso di misurare valori della concentrazione della T1AM più elevati rispetto a quelli riscontarti

tramite rilevazione con LC-MS/MS. Queste discrepanze sono state attribuite a un esteso legame proteico e a ulteriori insidie tecniche, compresa la potenziale formazione di addotti nel siero.

Per condurre un’analisi più dettagliata del catabolismo della T1AM ed evidenziare le successive

trasformazioni che subisce questa tironamina, è stata ricercata la presenza dell’eventuale aldeide 3- iodotiroacetica. Il catabolismo della T1AM sembra ricalcare quello degli ormoni tiroidei, dato che si

evidenzia la presenza di TA1, e la sua formazione è inibita da sostanze come l’iproniazide o

semicarbazide che sono inibitori delle aminoassidasi (10, 27). Si ipotizza che la via catabolica preveda la deamminazione ossidativa della T1AM in aldeide 3-iodotiroacetica e successivamente

l’aldeide deidrogenasi la converta in TA1. In questa indagine l’attenzione è stata rivolta alla

formazione dell’intermedio della via catabolica. Per limitare l’interferenza data dai vari composti presenti nel mezzo di coltura, lo studio è stato condotto su un sistema semplificato, contente solo l’enzima aminossidasi e la T1AM. L’analisi HPLC-MS/MS, dopo estrazione, ha evidenziato la

formico normalmente presente nella fase mobile. Per confermare e attribuire il picco identificato è stato necessario sintetizzare uno standard interno (Sestito et al unpublised synthesis). Lo standard però presenta la caratteristica di avere il gruppo ossidrilico presente sull’anello aromatico “protetto” con un gruppo metilico. Questo fa sì che lo standard possa presentare una frammentazione differente rispetto a quella dell’aldeide “endogena”. Comunque l’analisi alla spettrometria di massa

Nel documento Caratterizzazione di due modelli cellulari NG 108-15 e U87 MG trattati con 3-iodotironamina (T1AM) e valutazione della presenza dell'aldeide 3-iodotiroacetica come intermedio del catabolismo di T1AM ad acido 3-iodotiroacetico (TA1) (pagine 36-57)