Microestrazione in fase solida (SPME)

La calibrazione del metanolo in fase acquosa riportata in precedenza è utilizzabile per valori di concentrazione relativamente alti, ma risulta inadeguata per le basse

concentrazioni di metanolo che potrebbero essere ottenute nella fase di sintesi: infatti, il picco dell’acqua all’analisi gascromatografica copre quasi totalmente il picco del metanolo quando quest’ultimo è presente a basse concentrazioni in fase acquosa (nell’ordine del 0.02% v/v, cioè due ordini di grandezza in meno rispetto alla calibrazione riportata nel paragrafo precedente), come risulta chiaramente dal cromatogramma riportato in Figura 3.13 ottenuto iniettando 0.1 µL di soluzione acquosa di metanolo al 0.02% v/v.

Figura 3.13: Cromatogramma di una soluzione acquosa di metanolo allo 0.02% (v/v).

È quindi necessario ottimizzare il metodo analitico rendendolo sensibile anche a tali basse concentrazioni. Tale ottimizzazione è stata effettuata mediante l’utilizzo di una tecnica di estrazione di recente sviluppo: la microestrazione in fase solida (Solid Phase Micro Extraction, SPME), per mezzo della quale è stato possibile preconcentrare il campione da analizzare estraendo selettivamente il metanolo così da minimizzare l’interferenza causata dalla presenza dell’acqua.

La SPME è una tecnica analitica, utilizzata per la prima volta nel 1990 all’University of Waterloo in Canada dal gruppo del professor Pawlinszyn (Artur e Pawliszyn,

min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Norm. 0 200 400 600 800 1000 TCD1 B, (STELLA\META0700.D) 4. 7 4 4 min 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 Norm. -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 TCD1 B, (STELLA\META0700.D) acqua

1990), che consiste nell’estrazione più o meno selettiva di sostanze volatili o semi volatili da campioni liquidi o gassosi mediante l’utilizzo di un sistema a siringa all’interno del quale è contenuta una fibra di silice fusa rivestita da un film polimerico, saldata alla parte terminale di un tubicino sottile di acciaio e protetta da un opportuno rivestimento in acciaio. Il cuore della tecnica SPME è proprio tale fibra, che a seconda del materiale che la costituisce adsorbe in modo più o meno selettivo gli analiti cui è esposta.

La tecnica SPME è contemporaneamente un metodo di trattamento del campione e un sistema di introduzione del campione nell’iniettore del gascromatografo. Infatti, durante la fase di estrazione o preconcentrazione (Figura 3.14), lo stantuffo del sistema a siringa, precedentemente introdotto nella vial contenente il campione da analizzare (1), viene spinto per permettere l’esposizione della fibra al campione (2). Dopo un opportuno tempo di campionamento lo stantuffo viene ritratto e la siringa viene rimossa dalla vial (3). In tale intervallo di tempo si ha la ripartizione dell’analita (nel nostro caso metanolo) tra il campione (soluzione acquosa o matrice gassosa) ed il polimero che riveste la fibra di silice fusa. Nella fase di desorbimento o campionamento, schematizzata anche in Figura 3.15, la siringa è introdotta (4) nell’iniettore dello strumento di analisi (gascromatografo nel nostro caso), dopo di che lo stantuffo è spinto (5) in modo che la fibra rilasci quanto precedentemente adsorbito. Dopo un opportuno tempo di desorbimento, lo stantuffo viene ritratto, il sistema a siringa è rimosso dall’iniettore (6) ed è pronto ad un altro ciclo di analisi. In generale il tempo di estrazione o campionamento è determinato dal tempo richiesto per estrarre gli analiti con tempo di estrazione più elevato.

Figura 3.14: Processo di estrazione e desorbimento nella tecnica SPME.

Figura 3.15: Processo di desorbimento nella tecnica SPME.

La tecnica SPME può essere utilizzata secondo due diverse metodologie di campionamento, riportate schematicamente in Figura 3.16: i) campionamento diretto, nel quale la fibra viene posta a diretto contatto con il campione da analizzare (gassoso o liquido) coinvolgendo in questo modo due fasi (sistema a due fasi); ii) campionamento con Spazio di Testa, nel quale la fibra è posta a contatto con il vapore, in equilibrio con il campione liquido da analizzare, coinvolgendo in questo modo tre fasi (sistema a tre fasi).

1. Introduzione nel campione Desorbimento 3. Rimozione della siringa Estrazione 2. Estrazione 4. Introduzione nell’iniettore

5. Desorbimento 6. Rimozione _{della siringa}

dall’iniettore

Figura 3.16: Tecnica SPME con campionamento con a spazio di testa (a) e con

campionamento diretto (b).

Durante la fase di microestrazione si istaurano quindi degli equilibri tra:

• l’analita nel campione e l’analita adsorbito nel polimero che ricopre la fibra di silice, per i sistemi a due fasi, cioè nel caso del campionamento diretto; • l’analita nel campione, l’analita nella fase vapore in equilibrio con il

campione e l’analita nel polimero che ricopre la fibra di silice, nel caso di campionamento con spazio di testa.

La quantità di analita adsorbita dalla fibra dipende in primo luogo dallo spessore del polimero di rivestimento. Dopo di questo, nel caso di campionamento diretto la quantità di analita adsorbita dipende dalla costante di distribuzione (K) dell’analita tra il campione (liquido o gassoso) ed il rivestimento polimerico della fibra, definito come segue: campione fibra C C K= (3.1)

dove Cfibra e Ccampione sono le concentrazioni dell’analita nella fibra e nel campione da analizzare, rispettivamente.

Nel caso di campionamento con spazio di testa, la quantità di analita adsorbita dalla fibra dipende dalla costante di distribuzione (K’) dell’analita tra il campione (liquido) e la fase gassosa in equilibrio con esso, e dalla costante di distribuzione (K’’) tra la fase gassosa e la fibra, definite come:

campione a) campione Spazio di testa b)

campione gas C C K'= (3.2) gas fibra C C ' K' = (3.3)

dove Ccampione, Cgas e Cfibra sono rispettivamente le concentrazioni dell’analita nel campione da analizzare, nella fase gas in equilibrio con il campione e nella fibra. La costante di distribuzione K’ diminuisce all’aumentare del peso molecolare e del punto di ebollizione dell’analita.

L’estrazione può essere considerata quantitativa quando si raggiunge l’equilibrio tra le fasi coinvolte. In altre parole, quando si raggiunge l’equilibrio, la quantità di analita estratto è costante e indipendente dal tempo di esposizione.

Le calibrazioni effettuate utilizzando la tecnica SPME si basano sulla considerazione che, entro un determinato range di concentrazione dell’analita, esiste una relazione lineare tra la massa dell’analita adsorbito e la sua concentrazione iniziale nel campione da analizzare. Superato tale range si ha la saturazione della fibra.

La selettività dell’estrazione dell’analita nelle fase fibra è influenzata dal tipo di polimero di rivestimento o dallo spessore dello strato polimerico. In generale, sostanze volatili vengono meglio estratte con strati più spessi di polimero, mentre rivestimenti con spessori più sottili sono efficacemente impiegati per sostanze semivolatili. I polimeri costituenti il film polimerico che riveste la guaina di silice fusa più utilizzati sono:

• polidimetilsilossano/divinilbenzene (PDMS/DVB); • poliacrilato (PA); • carbowax/divinilbenzene (CW/DVB); • polidimetilsilossano/carboxene (PDMS/CAR); • polidimetilsilossano/divinilbenzene/carboxene (PDMS/DVB/CAR); • Carbowax/resina temprata (CW/TPR);

Lo spessore del film polimerico varia da 7 µm a 100 µm. Il differente spessore permette di adsorbire quantità diverse di analita sulla superficie polimerica.

Le caratteristiche più importanti che rendono la microestrazione in fase solida un’interessante tecnica di analisi sono:

- semplicità, in quanto l’estrazione e la preconcentrazione del campione sono effettuati in un unico step e non è richiesto l’utilizzo di solventi;

- rapidità, con un tempo di campionamento compreso tra i 2 e i 30 minuti (in funzione del tipo di analita), intervallo durante il quale viene raggiunto l’equilibrio tra le fasi coinvolte nel processo di estrazione;

- elevata sensibilità, in quanto possono essere determinate concentrazioni dell’ordine delle ppm;

- relativa economicità, in quanto le fibre possono essere utilizzate fino ad un massimo di circa 100 campionamenti a seconda delle caratteristiche del campione da analizzare, con qualunque tipo di GC o di HPLC, utilizzando la metodologia di campionamento diretto; se poi si considera la metodologia con Spazio di Testa, nella quale la matrice in cui è concentrato l’analita non contamina la fibra, è possibile utilizzare la stessa fibra per un tempo maggiore.

La tecnica SPME ha avuto nell’ultimo decennio un notevole sviluppo (Chen e Pawliszyn, 2004; Ouyang e coll., 2005; Ouyang e Pawliszyn, 2006; Avila e Breiter, 2007) e ha trovato applicazione: nell’analisi quantitativa di molecole organiche volatili e di agenti inquinanti nell’aria (Chai e Pawliszyn, 1995; Llompart e coll., 1998; Harvey e coll., 2002) e nelle acque reflue (Langenfeld e coll., 1996), nonché in campo bioanalitico per la separazione di analiti da campioni biologici (Musteata e Pawliszyn, 2007).