Microradiografie di campioni biologici

Come già detto in precedenza, i raggi X emessi da plasma indotto da laser sono usati, tra le varie applicazioni, anche per fare microradiografie di campioni biologici sottili visto che la radiazione X permette di visualizzarne la struttura e di rilevare l’eventuale presenza di metalli pesanti, di contaminanti o di agenti inquinanti attraverso il loro assorbimento selettivo.

Ri sp os ta d el f otodiodo P IN ( V )

Energia del laser (J)

Energia del laser (J)

Inte nsità d ei p ixe l d ella CCD

Tutte queste considerazioni hanno rappresentato il punto di partenza per ottenere microradiografie digitali preliminari, registrate su CCD, di foglie essiccate di eucalipto prelevate nel cortile della Facoltà di Ingegneria dell’Università degli Studi di Roma Tor Vergata. I raggi X usati per fare le microradiografie sono di tipo soft e sono quelli ottenuti mediante la sorgente laser-plasma di Tor Vergata.

Su un supporto di rame dotato di diversi fori circolari di diametri compresi tra 1mm e 5mm sono stati disposti in questo ordine, vicino al chip della CCD ad una distanza inferiore al cm, un sottile foglio di alluminio di spessore pari a 15µm, il campione biologico considerato (foglia di eucalipto nel nostro caso) ed un sottile film di Kapton con spessore di 7µm.

In particolare, il filtro di alluminio è stato usato per bloccare le componenti visibile e UV della radiazione emessa da plasma indotto da laser, mentre il foglio (film) di Kapton è stato utilizzato per proteggere il chip della CCD dai detriti provenienti dal target solido (rame nel nostro caso) su cui è stato generato il plasma nel corso dell’esperimento.

Nella figura 19 viene mostrato un esempio di microradiografia preliminare di foglia di eucalipto essiccata, ottenuta con un’energia della sorgente laser Nd:YAG/Glass di Tor Vergata pari a 9J, con un tempo di esposizione della CCD di 1s e con una temperatura di lavoro (ovvero di raffreddamento della CCD) di −20°C.

Figura 19 Microradiografia digitale di foglia di eucalipto essiccata, registrata su CCD e ottenuta sfruttando la radiazione X soft emessa da plasma di Cu indotto dalla sorgente laser Nd:YAG/Glass di Tor Vergata. Si noti che nell’esperimento l’energia della sorgente laser era pari a 9J, che il tempo di esposizione della CCD era di 1s e che la sua temperatura di lavoro era pari a −20°C.

Dalla figura 19 si può subito riscontrare il verificarsi di un diverso assorbimento dei raggi X soft da parte del campione, riconoscibile attraverso la presenza di zone più scure e più chiare nella radiografia corrispondenti rispettivamente ad aree di maggiore e minore assorbimento dei raggi X soft da parte della foglia di eucalipto. Inoltre, il differente assorbimento della radiazione X permette di evidenziare le varie strutture presenti nella foglia, come ad esempio le venature principali e quelle secondarie che sono chiaramente visibili dalla radiografia.

Come detto precedentemente, le microradiografie di campioni biologici sono uno strumento molto utile ed efficace per mostrare la presenza sul campione di eventuali agenti inquinanti o contaminanti, permettendo così di fare una mappatura dei siti di accumulo di tali sostanze.

A tale scopo, quindi, diversi campioni biologici con differenti livelli di contaminazione sono stati preparati dalla Dott.ssa Lucia Reale. Di tali campioni si sono ottenute delle microradiografie procedendo nella stessa maniera con la quale è stata fatta la microradiografia preliminare della foglia di eucalipto (figura 19), ovvero sempre sfruttando i raggi X essenzialmente di tipo soft emessi da plasma di Cu indotto dalla sorgente laser Nd:YAG/Glass di Tor Vergata e registrando l’immagine radiografica su CCD.

Dalle microragiografie ottenute, mostrate in figura 20 utilizzando come campione delle foglie di Viola tricolor con diversi livelli di contaminazione da CuSO4 al 2% raggiunti esponendo il campione per tempi diversi all’agente inquinante, è possibile individuare le varie strutture granulari delle foglie che assorbono maggiormente i raggi X soft e che sono responsabili della presenza di regioni più scure nelle immagini radiografiche.

Inoltre, la presenza in un campione biologico di strutture con livelli differenti di assorbimento dei raggi X diventa sempre più evidente all’aumentare della concentrazione di sostanze inquinanti (ovvero al crescere del livello di contaminazione), che tendono ad accumularsi in corrispondenza di particolari siti (aree) del campione dove, quindi, l’assorbimento dei raggi X risulta maggiore.

Tutto ciò è chiaramente visibile dai risultati ottenuti con CCD e mostrati in figura 20, ma anche da quelli ottenuti utilizzando come strumento di registrazione delle pellicole particolari sensibili ai raggi X (ad esempio quelle dette RAR e prodotte dalla Kodak) al posto della CCD [25].

Infine, una valutazione qualitativa e quantitativa della differenza (o contrasto) tra i siti di bioaccumulo delle sostanze inquinanti ed il resto del campione biologico non contaminato o scarsamente contaminato può essere fatta tramite un’analisi visiva delle radiografie oppure

attraverso l’analisi dei profili lineari, effettuati mediante appositi software di elaborazione delle immagini, lungo le varie regioni di interesse del campione biologico.

Una prima valutazione qualitativa di tipo visivo del bioaccumulo può essere fatta proprio in figura 20, dove vengono mostrate differenti microradiografie di foglie di Viola tricolor aventi tre diversi livelli di contaminazione dovuti a CuSO4 al 2%:

1) controllo (ovvero nessuna contaminazione); 2) contaminazione per 4 ore;

3) contaminazione per 24 ore.

Figura 20 Microradiografie digitali di foglie di Viola tricolor, registrate su CCD sfruttando la radiazione X soft emessa da plasma di Cu indotto dalla sorgente laser Nd:YAG/Glass di Tor Vergata. Si noti che nell’esperimento l’energia della sorgente laser era pari a 9J, che il tempo di esposizione della CCD era di 1s, che la sua temperatura di lavoro (ovvero di raffreddamento) era pari a −50°C e che il diametro dei fori sul disco di rame ove sono stati posizionati i vari campioni era pari a 5mm. Le foglie di Viola tricolor presentano tre diversi livelli di contaminazione da CuSO4 al 2%: controllo (nessuna contaminazione, prime

due radiografie in alto a sinistra, quelle più chiare con minore assorbimento di raggi X), contaminazione per 24 ore (le radiografie più scure con maggiore assorbimento di raggi X) e contaminazione per 4 ore (le rimanenti radiografie).