Set-up sperimentale

Come accennato in precedenza nell’introduzione, l’imaging in vivo di campioni biologici viventi richiede che la sorgente laser-plasma di raggi X soft nella regione spettrale della water window abbia dimensioni molto piccole tali da poterla, in pratica, considerare puntiforme e sia abbastanza intensa (brillante) da poter ottenere le immagini con un solo colpo (shot) laser.

Nei nostri esperimenti a singolo shot laser, la sorgente puntiforme di raggi X soft nella water window è stata ottenuta generando plasma su un bersaglio solido (ittrio in questo caso), dopo aver focalizzato su di esso la radiazione infrarossa emessa dalla sorgente laser tabletop e ultraintensa Nd:YAG/Glass di Tor Vergata, ovvero utilizzando l’apparato sperimentale descritto nel paragrafo 1.9 e più in dettaglio in [1] volto alla realizzazione di una sorgente laser-plasma.

Lo schema che rappresenta i punti salienti del set-up sperimentale utilizzato negli esperimenti di imaging X con cristallo di LiF come detector è mostrato in figura 21, dove

microscope holder with sample and LiF sta per supporto del microscopio con il campione di interesse ed il cristallo (rivelatore) di LiF, laser beam per fascio laser, focusing lens per lente di focalizzazione, X-rays per raggi X e vacuum chamber per camera da vuoto.

Figura 21 Schema delle parti fondamentali del set-up sperimentale usato durante gli esperimenti di imaging X con cristallo di LiF come rivelatore. Si noti che il campione biologico ed il detector di LiF sono molto vicini (7mm) alla sorgente laser-plasma di raggi X soft a cui il campione viene esposto per l’imaging. La sorgente laser usata per generare plasma su target solido di ittrio (Y) è quella tabletop e ultraintensa Nd:YAG/Glass nell’infrarosso di Tor Vergata.

In particolare, l’energia del fascio laser durante gli esperimenti era di circa 8J mentre la lente di focalizzazione usata era un tripletto, che ha permesso di ottenere un’ottima focalizzazione del fascio raggiungendo un diametro dello spot laser sul target inferiore a 100µm (50µm circa). Il bersaglio solido a cui si è ricorso negli esperimenti era, invece, costituito da un sottile nastro rotante di ittrio (Y).

Così facendo, un plasma con una temperatura di circa 250eV è stato generato nelle nostre condizioni sperimentali [33 , 34]. Tale plasma principalmente emette radiazione nell’intervallo di energia compreso tra 0,05keV e 2keV, mentre il target di ittrio è stato scelto poiché fornisce, rispetto ad altri target, la migliore efficienza di conversione tra radiazione laser e raggi X soft emessi da plasma indotto da laser nella regione spettrale della water window [27_, 35_].

Un singolo shot laser è stato sufficiente per ottenere un’immagine SXCM di alta qualità del campione biologico di interesse su un cristallo lucidato di LiF, che è stato disposto molto vicino al target di ittrio ad una distanza da esso di circa 7mm (figura 21).

All’interno della camera da vuoto, il campione biologico con il suo terreno di coltura ed il rivelatore a cristallo di LiF sono stati protetti dal vuoto mediante un supporto speciale per microscopio (microscope holder with sample and LiF), dotato di una finestra sottile consistente di un filtro di nitruro di silicio (Si3N4) con spessore di appena 100nm (figura 22 in cui si riporta lo schema di tale supporto; maggiori dettagli sono disponibili in [27,28,35]).

Figura 22 Dettaglio del supporto speciale per microscopio con campione biologico + terreno di coltura + rivelatore a cristallo di LiF usato per protezione dal vuoto. Si noti che “vacuum protected holder” sta per supporto protetto dal vuoto, “in vivo cells” sono le cellule viventi di interesse rappresentate, nel nostro caso, da cellule di Chlorella sorokiniana, ovvero da micro alghe verdi di forma sferica raffigurate da piccole palline di colore verde, “living media” sta per terreno di coltura ove le cellule sono immerse e “Si3N4 window” per finestra di nitruro di

silicio il cui spessore è pari a soli 100nm.

A causa della limitata trasparenza ai raggi X soft dell’acqua presente nel campione biologico ed, eventualmente, nel terreno di coltura e degli effetti di diffrazione, la tecnica di microscopia a contatto WW SXCM è in grado di investigare soltanto uno spessore di circa 10µm delle cellule viventi e dei campioni biologici in generale.

Inoltre, grazie alla loro protezione dal vuoto, nel corso dei nostri esperimenti le cellule di Chlorella sorokiniana rimangono nelle loro condizioni naturali di vita durante l’intervallo di tempo molto breve nel quale vengono irradiate mediante raggi X soft emessi da plasma indotto da laser.

Durante l’esposizione alla radiazione X, il cristallo di LiF viene colorato proporzionalmente all’intensità dei raggi X che attraversano lo strato delle cellule presenti nel

campione biologico. In particolare, la radiazione X soft emessa da plasma indotto da laser nella regione spettrale della water window (280 − 530)eV riesce ad attraversare con più facilità lo strato cellulare rispetto a quanto riesce a fare quella con energia che cade al di fuori di tale intervallo, poiché quest’ultima risulta essere maggiormente assorbita dall’acqua la cui trasparenza alla radiazione X incidente è, invece, maggiore proprio nella water window considerata, per questa ragione, come la finestra di trasmissione dell’H2O per i raggi X soft. Pertanto, questi ultimi nella water window riescono a generare un numero maggiore di difetti elettronici sulla superficie del cristallo di LiF.

Dopo l’esposizione ai raggi X soft nella WW, che costituisce la prima fase del processo di imaging su cristallo di LiF e che è anche detta fase di scrittura, il supporto speciale per microscopio è rimosso dalla camera da vuoto ed il cristallo di LiF viene ripulito rimuovendo le cellule, le loro tracce ed il terreno di coltura.

Durante, invece, la seconda fase del processo di imaging su cristallo di LiF, detta anche fase di lettura o di readout mostrata in figura 23, l’immagine di fluorescenza immagazzinata nel cristallo di LiF viene visualizzata mediante un microscopio ad alta risoluzione utilizzato in modalità di fluorescenza (ZEISS AXIOPLAN2 dotato di una videocamera CCD digitale della LEICA DFC350FX a 12bit con dimensione del singolo pixel di 6,45 · 6,45µm2).

Inoltre, il microscopio è dotato di due filtri ottici differenti di vetro per migliorarne l’efficienza di rilevazione. Tali filtri sono disposti nella parte di illuminazione ed in quella di raccolta del microscopio, come è possibile vedere in figura 23 dove Filter 1 e Filter 2 rappresentano proprio i due filtri appena citati, Filter 1 transmission e Filter 2 transmission indicano le loro trasmissioni nelle regioni spettrali (0,4 – 0,5)µm per il filtro 1 e (0,5 – 0,9)µm per il filtro 2, Fluorescence microscope sta per microscopio in modalità di fluorescenza, Pumping beam per fascio di pompaggio, Irradiated LiF per cristallo di LiF irradiato mentre Luminescence emission per emissione di luminescenza (ovvero di fluorescenza).

Infine, riassumendo, è possibile affermare che il processo di imaging di campioni biologici su cristallo (rivelatore) di LiF consiste di due fasi (o steps):

1) quella di irradiazione del campione biologico tramite raggi X soft nella regione spettrale della water window, come quelli emessi da plasma indotto da laser, che permette di creare un’immagine latente di fluorescenza nel rivelatore (cristallo) di LiF dove viene immagazzinata. Tale fase è anche detta di scrittura (figure 21 e 22); 2) quella di eccitazione ottica e di lettura (readout) in fluorescenza dell’immagine

registrata su cristallo di LiF mediante apposito microscopio ZEISS AXIOPLAN2 ad alta risoluzione citato in precedenza (figura 23).

Figura 23 Fase di eccitazione ottica e di lettura (readout) in fluorescenza dell’immagine registrata su cristallo di LiF mediante apposito microscopio ad alta risoluzione.