Gli alimenti consumati con la dieta forniscono grassi, carboidrati e proteine, nonché vitamine, minerali e oligoelementi; fattori dietetici che, come dimostrato fino ad ora, possono influenzare i processi cellulari regolando l'espressione dei microRNA endogeni. Nell’ultimo decennio è stato dimostrato che gli alimenti di origine vegetale e animale contengono essi stessi notevoli quantità di microRNA in grado di attraversare la barriera intestinale, entrare in circolo e raggiungere i diversi organi e tessuti dove svolgono la loro azione.51
La prima volta che si è parlato di microRNA esogeni è stato nel 2012, in un’indagine sul profilo dell’espressione dei microRNA circolanti nel siero di donatori cinesi sani. L’indagine ha rilevato, nel siero dei volontari, la presenza del miR-168a, un microRNA altamente espresso nel riso; risultato che appariva coerente con il grande uso di questo alimento nella popolazione cinese.52
Per determinare se miR168a fosse veramente un microRNA di origine vegetale i ricercatori hanno trattato i microRNA totali, isolati dal siero, con un agente ossidante, il periodato di sodio. I microRNA vegetali sono 2′-O-metile modificati sul ribosio del nucleotide terminale, il che li rende resistenti al periodato, mentre i microRNA dei mammiferi hanno un ossidrile libero al 2′ e sono sensibili al periodato (Figura 21).53
Figura 21. Sequenza nucleotidica di un microRNA animale e di un microRNA vegetale. (Dr.Noel Sturm) H
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Dopo il trattamento ossidante i microRNA sono stati analizzati con una tecnica di sequenziamento che, basandosi sull’utilizzo di coloranti, consente l'identificazione di singoli nucleotidi. Poiché a questi coloranti rispondono solo i micoRNA che non sono stati ossidati, un confronto delle librerie di sequenziamento, prima e dopo l'ossidazione, consente di valutare se i microRNA testati hanno l’estremità 2′-O metilata. Come ipotizzato, la maggior parte dei microRNA endogeni nel siero umano non sono stati rilevati dal colorante perché ossidati. Il miR-168a, rimasto invariato dopo il trattamento con periodato, ha risposto invece al colorante, confermando la presenza dell’estremità 2′-O-metilata e la sua origine vegetale.53
Il passo successivo degli autori è stato quello di identificare la fonte esatta di questo microRNA vegetale analizzando la sua espressione in vari alimenti. Il miR-186a era presente in alimenti come cavoli, grano e patate, ma il suo livello era effettivamente molto alto nel riso; è inoltre interessante notare che la presenza di mir-186a rimaneva stabile anche dopo la cottura.53
Infine, per confermare l’ipotesi che i microRNA vegetali rilevati fossero il risultato dell'assunzione di cibo, i livelli di miR168a sono stati valutati nel siero e nei tessuti di un gruppo di topi nutriti con una dieta ricca di riso e confrontati con i livelli rilevati in un gruppo di topi nutriti con una dieta di controllo. I livelli di miR-168a erano significativamente aumentati nei topi nutriti con riso rispetto al controllo, sia nel siero sia in vari tessuti tra cui fegato, intestino tenue e polmone. E’ stato esaminato anche l'effetto dell'acidificazione sulla stabilità dei microRNA vegetali esogeni per analizzare quello che succede durante la digestione. I microRNA vegetali isolati sono stati conservati in ambiente a pH 2, a 37°C, in modo da imitare l’ambiente del tratto gastrointestinale; dopo diverse ore il livello e la qualità dei microRNA era ancora lo stesso.53
Anche in questo caso l’ipotesi è che il nucleotide terminale 2’-O-metilato renda i microRNA vegetali biologicamente stabili garantendo la loro biodisponibilità nell’organismo.54
Questo studio ha aperto la strada per l’esplorazione della funzione fisiologica, nell'uomo e negli animali, dei microRNA esogeni introdotti con la dieta.
L’alimento attualmente più studiato e contenente le quantità più abbondanti di microRNA è il latte, il prodotto secretorio delle cellule epiteliali della ghiandola mammaria. Il microRNA più abbondante del latte, sia umano che vaccino, è il miR- 148a; questo è in grado di essere assorbito dalle cellule intestinali umane, di raggiungere la circolazione sistemica e di andare a modificare l'espressione genica di cellule distanti.55
I microRNA presenti nel latte sono trasportati in esosomi, piccole vescicole extracellulari con doppio strato lipidico, di circa 100 nm di diametro, secreti dalle cellule della ghiandola mammaria. Gli esosomi del latte, umano e bovino, sono altamente resistenti alle condizioni del tratto gastrointestinale, un requisito fondamentale per il loro assorbimento da parte delle cellule epiteliali intestinali. L'assorbimento intestinale degli esosomi è mediato dall'endocitosi, un processo attraverso il quale la cellula internalizza molecole o corpi presenti nello spazio extracellulare tramite modificazione della forma della sua membrana plasmatica. Nella cellula intestinale il miR-148a può esplicare la sua azione o può essere ri- confezionato in esosomi che vengono secreti nel flusso sanguigno e possono raggiungere organi distanti (Figura 22).55
La somministrazione orale di esosomi con microRNA marcato ha permesso la rilevazione del RNA marcato nel cervello, nei reni, nei polmoni e nei fegati dei topi trattati.55
Un bersaglio di miR-148a è la DNA-metiltransferasi 1 (DNMT1), un enzima essenziale per lo sviluppo dei mammiferi e per il controllo della crescita. DNMT1 ha un ruolo nel silenziamento genico in quanto responsabile della metilazione della posizione 5 della citosina nelle isole CpG, regioni del DNA dove una citosina si trova vicino ad una guanina nella sequenza lineare di basi. In generale, l'ipometilazione del DNA aumenta l'espressione genica, mentre la metilazione del DNA sopprime la trascrizione. L’ipotesi è che il miR-148a derivato dal latte, tramite la soppressione di DNMT1, riduca lo stato di metilazione delle isole CpG aumentando l’espressione di geni cruciali per lo sviluppo umano, come FTO, il gene associato alla massa grassa e all’obesità.55
Una delle principali funzioni anabolizzanti del latte è infatti legata all'aumento dell'assunzione di cibo, che è stato correlato proprio ad un incremento della trascrizione di FTO mediata dal miR-148a. La sequenza amminoacidica della proteina FTO trascritta mostra un'elevata somiglianza con l'enzima implicato nella rimozione di gruppi metile dal DNA ed è stato infatti dimostrato che FTO funziona come una demetilasi. Il tipo più comune di modificazione del RNA messaggero eucariotico è un metile in posizione 6 dell’adenosina, modificazione che ha importanti effetti sulla stabilità e sulla traduzione dell'mRNA metilato.56
FTO rimuove il gruppo metile sull’adenosina in un sottoinsieme di mRNA, incluso l'mRNA che codifica per la grelina, l’ormone prodotto dalle cellule del fondo dello stomaco e dalle cellule del pancreas per stimolare l’appetito. I livelli di grelina incrementano prima dei pasti e decrementano circa un'ora dopo. Il miR-148a, aumentando l’espressione di FTO, porta ad un’incontrollata espressione della grelina stimolando continuamente l’appetito. Inoltre, nell’ipotalamo, FTO può aumentare l'espressione del recettore della dopamina D2 (DRD2), aumentando la sensazione di gratificazione derivante dall'assunzione di cibo (Figura 23).55
Figura 23. Modello dei meccanismi di azione di mir-148a. (Melnik55, 2017)
La colecistochinina (CCK) è invece un ormone che, tra le altre azioni, determina il senso di sazietà. La CCK è secreta dal duodeno dopo un pasto, causa il rilascio di bile dalla cistifellea, di enzimi digestivi dal pancreas e stimola la secrezione di insulina. Il senso di sazietà è indotto dal legame della CCK con il suo recettore a livello ipotalamico, il CCK2, che inibisce diversi sistemi coinvolti nell’induzione dell’assunzione di cibo . La somministrazione di un potente antagonista del recettore CCK2 nel cervello di topi ha aumentato significativamente l'assunzione di cibo mentre topi privi del recettore hanno mostrato un aumento del peso corporeo e dell'assunzione di cibo, un aumento della deposizione di grasso, iperglicemia a digiuno, e resistenza all'insulina. Il recettore CCK2 è un obiettivo diretto di miR-148a, è quindi concepibile che, riducendo l’espressione di CCK2 nell’ipotalamo e mettendo a tacere il feedback negativo mediato dalla colecistochinina, il miR-148a derivato dal latte promuova l'iperfagia con conseguente aumento dell'indice di massa corporea e dell'adiposità (Figura 23).55
Il miR-148a del latte ha dimostrato di controllare direttamente anche l’espressione di diversi geni implicati nella regolazione del metabolismo lipidico.
SREBP-1c (proteina legante gli elementi regolatori degli steroli) è un fattore di trascrizione che una volta attivato trasloca nel nucleo e fa partire la sintesi endogena di colesterolo. Il fattore SREBP-1c è controllato da diverse chinasi; SIK1 (salt inducible kinasi) inibisce l’attivazione di SREB-1c comportandosi da regolatore negativo della lipogenesi epatica. Mir-148a sopprime l’espressione di SIK1 favorendo la traslocazione di SREBP-1c nel nucleo e la lipogenesi.57
L’iperespressione di miR-148a derivante dal latte è associata anche ad una riduzione del recettore epatico del colesterolo LDLR e della proteina ABCA1, responsabile dell’efflusso di colesterolo dalle cellule. Il colesterolo circolante non viene captato dal fegato e quello presente nelle cellule non viene rilasciato; in questa situazione si verifica una diminuzione dei livelli circolanti di colesterolo HDL e un aumento del colesterolo LDL.55
Tutti questi meccanismi regolati dal miR-148a agiscono di concerto per fornire lipidi ai tessuti in crescita del bambino, ma nell’adulto provocano un aumento della sintesi del colesterolo e dei suoi livelli plasmatici che potrebbe favorire l’aterosclerosi e l’insorgenza di malattie metaboliche.55
I microRNA del latte sono resistenti anche ai più comuni trattamenti termici utilizzati per ridurre il numero di microrganismi patogeni eventualmente presenti. La pastorizzazione (72-75 °C, 15-30 s) è il trattamento termico comunemente usato per trattare il latte commerciale e gli autori dello studio hanno rilevato che questa non influisce sulla quantità e qualità dei microRNA presenti nel latte.55
Prima della pastorizzazione e della refrigerazione, il latte vaccino era soggetto a fermentazione batterica. Confrontando la morfologia e la distribuzione degli esosomi presenti nel latte crudo con quelli presenti in yogurt fermentati con tre diverse combinazioni di ceppi batterici, si è osservato che il contenuto in esosomi è stato significativamente ridotto negli yogurt fermentati. Gli autori hanno ipotizzato che gli
attacchi dei batteri agli esosomi potrebbero deteriorare l'integrità della membrana con conseguente degradazione del microRNA da parte delle RNasi secrete dai microbi del latte.55
Il latte in polvere per lattanti è ottenuto tramite essicazione del latte vaccino e questa procedura comporta una notevole perdita di microRNA. Gli attuali alimenti per lattanti in commercio contengono solo il 10% di miR-148a rispetto al latte crudo; un deficit che potrebbe avere effetti negativi sulla programmazione metabolica a lungo termine dei bambini.55
Nei lattanti, il miR-148a proveniente dal latte materno, promuove l'anabolismo e la crescita, migliora l’espressione di numerosi geni dello sviluppo, e gioca un ruolo chiave nell'adipogenesi e nel controllo dell'alimentazione. Al contrario, in età adulta, il consumo persistente di latte vaccino, espone l'uomo al miR-148a ectopico, che si comporta da mediatore oressigeno, stimolando l’appetito, e adipogenico, con il rischio di indurre effetti negativi sulla salute a lungo termine favorendo condizioni come l'obesità e il diabete mellito di tipo 2. Nella maggior parte dei mammiferi, infatti, il consumo di latte viene fisiologicamente terminato dopo il periodo di allattamento al seno.55