Misura diretta

Il cloruro nel sudore è l'analita più direttamente correlato alla funzione anormale del CFTR e mostra una maggiore discriminazione rispetto al sodio. Le tecniche di misurazione accettabili per misurare il cloruro sono colorimetria, coulometria o elettrodo iono selettivo.

B. Sodio

Le tecniche di misurazione accettabili per misurare il sodio sono la fotometria a fiamma, la spettrofotometria ad assorbimento atomico o l'elettrodo ionico selettivo. Il sodio nel sudore è elevato nella FC ma è meno discriminante rispetto al cloruro per la diagnosi e quindi non dovrebbe essere usato da solo per la diagnosi di CF [68].

Interpretazione dei risultati

La concentrazione di cloruro nel sudore deve essere interpretata in relazione alla presentazione clinica del paziente, alla storia familiare, all'età e alla consapevolezza che alcune mutazioni del gene CFTR sono associate a una concentrazione di cloruro di sudore borderline o negativo.

Intervalli di riferimento

Gli intervalli di riferimento del cloruro nel sudore che sono attualmente accettati per la diagnosi di CF sono:

• <29 mmol /L: negativo / normale;

• 30-59 mmol/L: borderline (potrebbe essere CF); • >60 mmol / L positivo per CF.

Sembra esserci un normale aumento dei valori di elettroliti nel sudore dall'infanzia all'età adulta e anche se rari sono stati descritti casi di adulti sani con concentrazioni di cloruro di sudore superiori a 60 mmol / L. [68] Quindi occorre cautela nell'interpretazione dei risultati del test del sudore nei pazienti più anziani.

Sebbene la stragrande maggioranza dei pazienti con FC abbia elevate concentrazioni di cloruro di sudore, ci sono molte segnalazioni di pazienti con sintomi clinici indicativi di FC ma con valori di elettroliti normali o al limite. Questi pazienti mantengono spesso la sufficienza pancreatica e hanno uno stato nutrizionale normale, dotti deferenti assenti nei

32 maschi e diagnosi di FC in età avanzata [16, 55]. Alcune mutazioni sono state trovate associate ad un test del sudore "normale".

Anche valori borderline di cloruro nel sudore possono rappresentare un dilemma diagnostico. Va notato che durante l'infanzia, un cloruro di sudore di 30 mmol / L o maggiore ha una bassa probabilità di essere un vero normale e un livello di cloruro nel sudore tra 30-59 mmol / L è probabile che sia diagnostico per CF 21. Pertanto, i bambini con valori di cloruro del sudore borderline necessitano di follow-up, ripetizione del test del sudore e analisi estesa della mutazione CFTR.22

Correlazione elettroliti nel sudore-genotipo-fenotipo

La correlazione tra elettroliti del sudore e genotipo fu inizialmente esplorata da Witt e colleghi.104 Successivamente, con una migliore classificazione delle varie mutazioni geniche, i valori di cloruro nel sudore furono correlati ad alcuni gruppi di mutazioni [100]. Non sono state trovate differenze nei valori di di cloro nel sudore tra pazienti portatori di mutazioni di classe I, di classe II, classe III. L'unica differenza statistica è stata verificata nelle mutazioni di classe IV e V, che avevano un livello medio di cloruro di sudore significativamente più basso di quello dei pazienti omozigoti per ΔF508 e più vicino alla norma rispetto a quello della classe I, II e III.

Alcune mutazioni associate agli elettroliti del sudore normale o borderline sono R117H, D1152H, A455E, G551S e 2789+ 5G. [100]

Un fenotipo interessante, che presenta un'elevata concentrazione di cloruro di sudore in assenza di altri sintomi CF, è stato descritto in un paziente con una mutazione non senso, S1455X. Sulla valutazione clinica dettagliata, questo paziente aveva una normale funzionalità polmonare, una normale flora batterica all’esame dell’espettorato, nessuna manifestazione di malattia pancreatica esocrina e l'IRT sierica non indicativa di CF. I trascritti di mRNA CFTR recanti la mutazione S1455X erano normalmente elaborati e funzionali, il che suggerisce quindi che l'amminoacido C-terminale troncato gioca un ruolo importante solo a livello delle ghiandole sudoripare.

Insidie nell'analisi del sudore

La maggior parte degli errori relativi ai test del sudore sono causati dall'uso di metodologia inaffidabile, inadeguata raccolta di sudore, errori tecnici e, occasionalmente, errata interpretazione dei risultati. Gli aspetti tecnici dell'esecuzione di un test del sudore sono impegnativi e questi errori si verificano più spesso in laboratori che fanno relativamente pochi test, di solito non conformi alle linee guida pubblicate [68].

33 Circa il 98% dei pazienti con FC hanno concentrazioni di cloruro di sudore superiori a 60 mmol/L [100]. Vi sono una varietà di condizioni ben descritte, sebbene rare, associate all'elevazione degli elettroliti del sudore [68, 101]. Queste condizioni sono generalmente facili da differenziarsi dalla CF e non devono essere considerati veri falsi positivi. Includono: l'eczema atopico, il morbo di Addison non trattato, la displasia ectodermica, alcuni tipi di malattie da accumulo di glicogeno e l'ipotiroidismo non trattato.11,17,106 Gli elettroliti nel sudore misurati entro le prime 24 ore dalla nascita possono anche essere elevati in modo transitorio. Fino al 25% dei neonati normali mostra una concentrazione di cloro nel sudore superiore a 65 mmol / L al giorno 1, ma essa diminuisce rapidamente il secondo giorno dopo la nascita [20].

Una concentrazione di cloruro di sudore superiore a 160 mmol / L è fisiologicamente impossibile e suggerisce errore di laboratorio o sindrome di Munchausen. Errori tecnici quali evaporazione e contaminazione, fatta eccezione per la mancata diluizione del campione, tendono a produrre valori falsi positivi [16].

Falsi negativi nel test del sudore

La causa più importante di un test del sudore falso negativo è l'edema [68, 102]. L'edema è comunemente presente nei lattanti con ipoproteinemia, che può essere secondaria all'insufficienza pancreatica esocrina, prima della diagnosi e del trattamento con enzimi pancreatici sostitutivi.

L'uso di mineralcorticoidi può anche ridurre le concentrazioni di elettrolito nel sudore. Da un punto di vista tecnico, il tasso di sudorazione è importante per ottenere risultati accurati poiché la concentrazione di elettrolito nel sudore è correlata alla velocità del sudore. A bassi livelli di sudore, la concentrazione di elettrolita nel sudore diminuisce e aumenta l'opportunità di evaporazione del campione. La velocità media del sudore dovrebbe superare 1 g / m2 _{/ min.}

Campioni insufficienti possono essere dovuti a diversi fattori come età, condizione della pelle, stato di idratazione e sistema di raccolta.

Come regola generale, i test del sudore possono essere attendibili se eseguiti dopo le 2 settimane di età nei lattanti di età superiore a 2 kg e occasionalmente il test del sudore può essere tentato in neonati a termine dopo 7 giorni di età. I sistemi di raccolta variano, comunque è stata riscontrata una percentuale di errore dello 0,7% nel caso di raccolta del sudore su garza o carta da filtro rispetto a un tasso di fallimento del 6,1% associato all'uso delle bobine di Wescor Macroduct [68, 102].

Un test del sudore eseguito in un laboratorio affidabile è ancora una buona misura della funzione CFTR nella maggior parte dei casi. L'analisi della mutazione ci informa sul

34 gene, ma non sul prodotto genico (mRNA o proteina) o sulla sua funzione e spesso risulta essere un mezzo diagnostico meno utile quando la diagnosi è dubbia.

Terapia

La fibrosi cistica viene di solito identificata dopo lo screening neonatale o durante i primi anni di vita [103]. Le persone diagnosticate dopo i 20 anni di solito presentano una mutazione associata a una funzione CFTR residua come Arg117His (noto anche come R117H) [103, 104]. Questi individui potrebbero avere sintomi respiratori lievi durante l'infanzia e sviluppare bronchiectasie, pancreatite o presentare infertilità in epoca più tardiva. La diagnosi viene fatta con un test del sudore e con l’analisi del DNA [105, 106]. Gli individui con una diagnosi tardiva hanno una buona sopravvivenza, che riflette la maggiore prevalenza di mutazioni associate alla funzione residua e un fenotipo meno grave [105, 106].

I principali obiettivi della terapia della FC sono quelli di promuovere la clearance delle secrezioni, controllare le infezioni polmonari, fornire un’alimentazione adeguata e prevenire l’ostruzione intestinale. In futuro, le terapie che ristabiliscono il processamento del mutante CFTR o la terapia genica potranno essere i trattamenti di scelta.

Il trattamento della malattia polmonare nella fibrosi cistica è fondamentale per la gestione clinica [107, 108]. La clearance delle vie aeree è quasi universalmente insegnata ai genitori di neonati con diagnosi di fibrosi cistica ed è incoraggiata per tutta la vita dell'individuo [109, 110].

Gli antibiotici orali sono usati profilatticamente in alcuni paesi per prevenire l'infezione da S. aureus, nonostante le preoccupazioni di un aumentato rischio di infezione da P. aeruginosa [111]. Nei bambini, le infezioni ripetute sono trattate con antibiotici per via orale diretti contro S. aureus e H. influenzae. In caso di positività alla coltura dell’espettorato per P aeruginosa o per altri microrganismi Gram-negativi sarà necessario un trattamento antibiotico con l'obiettivo di eradicazione [111]. Un regime di ciprofloxacina orale e colistina per via inalatoria per 3 mesi è efficace per l’eradicazione di questi batteri [112]. Può avere la stessa efficacia nel debellare P. Aeruginosa la somministrazione di tobramicina inalatoria per 1 mese [113, 114]. Entrambi i regimi sono raccomandati per la terapia antibiotica di eradicazione. Garantire l'eradicazione della P aeruginosa è una priorità importante nella cura della fibrosi cistica e molti centri pediatrici riportano una prevalenza di infezione cronica da P aeruginosa inferiore al 10% nelle loro cliniche [115].

35 Una gamma di terapie riduce la frequenza delle riacutizzazioni polmonari: Dornase alfa è stato il primo trattamento indicato per ridurre le esacerbazioni; successivamente, antibiotici per via inalatoria, tobramicina, colistina e aztreonam, inalazione di levofloxacina, soluzione salina ipertonica, mannitolo e azitromicina orale hanno anche dimostrato di ridurre le esacerbazioni. Queste terapie sono incluse nelle linee guida per il trattamento della FC di tutto il mondo [111, 116] e generalmente portano ad un modesto miglioramento del FEV1 del 3-5% e ad una sostanziale riduzione della frequenza delle riacutizzazioni polmonari.

I pazienti cronicamente infetti da P aeruginosa o altri batteri Gram-negativi di solito richiedono un trattamento con antibiotici per via endovenosa. Questo trattamento di solito consiste in una penicillina ad azione estesa, cefalosporina di terza generazione o carbapenem in combinazione con un aminoglicoside o una polimixina [111]. Il trattamento è raccomandato per 14 giorni, sebbene non vi sia una solida base di evidenze a supporto di questa durata del trattamento [111]. Alcune persone si ammalano molto durante questi episodi e richiedono supporto con nutrizione e ossigeno supplementare e in alcune occasioni possono richiedere un supporto ventilatorio non invasivo. Un trattamento efficace delle riacutizzazioni è importante, poiché circa il 25% delle riacutizzazioni non si risolve e l'aumento della frequenza delle esacerbazioni è associato a un declino più marcato della funzionalità polmonare, a una ridotta qualità della vita e a una scarsa sopravvivenza complessiva [117, 118].

Anche le cellule epiteliali nei dotti pancreatici e biliari sono interessate dalla disfunzione CFTR [118], provocando in alcuni pazienti una pancreatite ostruttiva cronica. Al contrario, gli individui con mutazioni di classe IV, V o VI presentano una normale funzionalità pancreatica alla nascita, anche se alcuni di loro svilupperanno insufficienza pancreatica nel corso della vita [119, 120].

L'insufficienza pancreatica può essere trattata con la terapia sostitutiva mediante l’assunzione di enzimi pancreatici [121, 118].

L'aumento del metabolismo nei pazienti affetti è causato da una combinazione di fattori tra cui la mutazione genetica sottostante e le conseguenze metaboliche dell’infezione cronica [122]. Una gestione ottimale della nutrizione richiede un apporto energetico maggiore oltre alla terapia sostitutiva con enzimi pancreatici [121]. La fibrosi cistica è anche associata alla cirrosi biliare, sebbene ciò avvenga in meno del 10% dei pazienti.[120] Più comunemente, le persone con fibrosi cistica hanno test di funzionalità epatica alterati in modo anomalo. Una piccola parte di tali pazienti sviluppa cirrosi o

36 ipertensione portale e, quando ciò si verifica, deve essere presa in considerazione per il trapianto di fegato.

Lo sviluppo del diabete mellito correlato alla fibrosi cistica è un problema crescente, che si verifica in oltre il 40% degli adulti, ed è associato a rischi di sopravvivenza, in particolare nelle donne [123]. Il trattamento è solitamente insulinico; molto importante è anche l’impostazione di una dieta ad alta energia [124]. Spesso sono evidenti le complicanze del diabete correlato alla fibrosi cistica e si manifestano con malattia macrovascolare e microvascolare [124]. L’ uso di aminoglicosidi per via endovenosa e il diabete contribuiscono alla disfunzione renale nelle persone con fibrosi cistica.

L'osteopenia è comune nei pazienti affetti, a causa del ritardo puberale, delle conseguenze della mutazione CFTR, dell'infiammazione cronica e dell'inattività [125]. Il rischio di osteopenia deve essere preso in considerazione nella dieta e nello stile di vita consigliato, che dovrebbe incoraggiare un buon apporto di calcio ed esercizio con un'integrazione adeguata di vitamina D. Se si sviluppa l'osteoporosi si raccomanda la terapia con bisfosfonati [126].

La disfunzione renale è un problema crescente nei pazienti con fibrosi cistica ed è comunemente causata dall'uso di aminoglicosidi per via endovenosa; in particolare, la gentamicina è stata associata a insufficienza renale acuta e cronica.

Gli effetti progressivi dell'infezione e dell'infiammazione delle vie respiratorie portano a vaste bronchiectasie e bronchiolite obliterante, che inevitabilmente si traducono in insufficienza respiratoria. A tutti i pazienti con fibrosi cistica che sviluppano insufficienza respiratoria dovrebbe essere offerta l'opzione del trapianto di polmone quando presentano un declino della funzione polmonare ed esacerbazioni frequenti [127]. Il trapianto polmonare ha sempre più successo con una sopravvivenza del 60-70% a 5 anni [128]. Sfortunatamente, nei paesi in cui la disponibilità di organi è inferiore al numero di potenziali riceventi, i pazienti possono morire mentre aspettano un trapianto. Ci sono alcune controindicazioni al trapianto; molti centri non eseguono la procedura in pazienti con B cenocepacia e alcuni non effettuano trapianti in pazienti con ascessi M cronici. [109]

La gestione dello stadio terminale della malattia è molto importante per l'individuo, per la famiglia e gli amici. Laddove possibile, una famiglia o un partner appropriati dovrebbero essere coinvolti nel processo decisionale su come viene gestito l'ultimo periodo di vita [129].

37 Terapie innovative

Il recente sviluppo di farmaci che correggono il difetto di base della funzione CFTR ha sostanzialmente migliorato la prospettiva di vita dei pazienti affetti. La prevenzione della malattia polmonare con terapie che correggono la funzione CFTR può essere intrapresa efficacemente il prima possibile durante la diagnosi mediante screening neonatale. Sono stati sviluppati due differenti approcci terapeutici: il primo è l'uso di piccole molecole in grado di modulare la proteina CFTR e ripristinare il trasporto funzionale degli ioni; il secondo approccio è l'uso di terapia molecolare o genica per correggere la mutazione, a livello di RNA o DNA e produrre una proteina CFTR normale che corregga la disfunzione CFTR mutata aggirandola.

La prima piccola molecola sintetizzata che si è dimostrata efficace è ivacaftor [130]. Ivacaftor corregge il trasporto di cloruro mediato da CFTR nella maggior parte delle mutazioni di classe III, mutazioni di classe IV, e alcune altre mutazioni che presentano funzione residua del CFTR [131]. E’ stata inoltre dimostrata anche una significativa efficacia di ivacaftor nelle mutazioni di classe III, in particolare nei pazienti con Mutazione Gly551Asp (nota anche come G551D). Il trattamento con ivacaftor ha migliorato la funzione polmonare (FEV1) di circa il 10%, ridotto le concentrazioni di cloruro nel sudore a concentrazione di circa 60 mmol / L, migliorato la qualità della vita dei pazienti e ridotto la frequenza delle riacutizzazioni polmonari.[132] Questo farmaco è stato anche testato in pazienti con mutazioni di classe IV, in particolare quelli con la mutazione Arg117His; nei pazienti con questa mutazione non si ha un effetto significativo sulla funzionalità polmonare, sebbene ivacaftor abbia ridotto la concentrazione di cloruro di sudore di circa 25 mmol / L.

La seconda strategia farmacologica è mirata ai pazienti che sono omozigoti per la mutazione DF508 e deriva da una combinazione di un farmaco correttore, in grado di ripristinare il traffico di CFTR e un farmaco potenziatore che lo rende funzionale. La combinazione di lumacaftor e ivacaftor migliora il FEV1 e riduce la frequenza delle riacutizzazioni polmonari [133]. Inoltre i pazienti trattati presentano un modesto miglioramento dei punteggi di qualità della vita. Circa il 10% dei pazienti ha riportato oppressione toracica con broncocostrizione associata. Tuttavia, questo effetto sembra essersi stabilizzato dopo alcune settimane di trattamento. Il miglioramento del FEV1 dopo il trattamento con lumacaftor e ivacaftor pare sia inferiore a quello osservato dopo il trattamento con ivacaftor in pazienti con mutazione Gly551Asp (3% vs 10%); tuttavia, l'effetto sulla frequenza delle riacutizzazioni polmonari era simile (riduzione del 30% rispetto alla riduzione del 40%). Le concentrazioni di cloruro nel sudore hanno mostrato

38 una modesta riduzione, di circa 9 mmol / L, dopo trattamento di associazione con lumacaftor e ivacaftor. Nel complesso, la funzione CFTR può essere trattata con piccole molecole. Un altro famaco correttivo come VX-661 (Vertex Pharmaceuticals, Boston) è stato utilizzato ma si è visto interferire con l’azione di ivacaftor, riducendo così gli effetti funzionali su CFTR.

Un ulteriore approccio farmacologico è stato sviluppato per le mutazioni di classe I. Ataluren è una piccola molecola, progettata da PTC Therapeutics, capace di rendere i ribosomi meno sensibili ai codoni di stop prematuri.[134]. Questo farmaco ha indicazione anche nelle distrofie muscolari. Negli studi di fase 2, questo farmaco ha mostrato la correzione elettrofisiologica della funzione CFTR e qualche miglioramento nel FEV1 dei pazienti FC.

Dalla clonazione del gene CFTR, si ha una grande aspettativa sulle terapie geniche e molecolari. Alcuni studi hanno dimostrato che la funzione CFTR può essere ripristinata nel naso di persone con fibrosi cistica. Recentemente è stato riportato il primo studio importante sul ripristino della funzione del CFTR a livello polmonare che ha mostrato alcuni effetti su importanti parametri clinici del FEV1 e alcune misure sulla TAC [135]. Alcuni altri composti sono attualmente in fase di sviluppo con effetti correttori e potenzianti, e probabilmente entreranno in sperimentazione clinica quest'anno. Un farmaco oligonucleotidico, PQR-010 (QR-010, ProQR, Leida, Paesi Bassi), è stato sviluppato per riparare il difetto genetico nell'RNA ed è attualmente in fase 1 di studi clinici.

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SPETTROMETRIA DI MASSA

La spettrometria di massa è uno strumento analitico indispensabile, considerato il ‘golden standard analitico’ in chimica, biochimica, farmacia, tossicologia, medicina, e in molti campi della scienza.

La spettrometria di massa è utilizzata per analizzare basi di dati combinatoriali, sequenza di biomolecole, per contribuire a esplorare singole cellule o oggetti provenienti dallo spazio. Tutti si affidano in larga misura alla spettrometria di massa per avere informazioni strutturali di composti sconosciuti, in campo ambientale e analitico forense, per il controllo di qualità di farmaci, alimenti e polimeri [136].

Il principio di base della spettrometria di massa è quello di generare ioni sia da composti inorganici che organici, utilizzando qualsiasi metodo idoneo per separare gli ioni sulla base del loro rapporto massa su carica (m/z) e rilevarli qualitativamente e quantitativamente sulla base dei rispettivi valori di m/z e di abbondanza.

L’analita può essere ionizzato termicamente, da campi elettrici o da interazione con elettroni energetici, ioni o fotoni a varia lunghezza d’onda [137].

Questa tecnica si deve in primo luogo all’ingegno e al lavoro del fisico J. J. Thomson (1847-1940), al quale si attribuisce, non solo la scoperta dell’elettrone ma anche la misurazione delle masse degli isotopi stabili degli elementi. Nel suo spettrometro di massa Thomson generò ioni attraverso ionizzazione elettronica, tuttora utilizzata, ne studiò le traiettorie sotto l’influenza di campi magnetici e/o elettrici e ne misurò il rapporto massa/carica (m/z).

Da Thomson ad oggi è stata percorsa molta strada. Sono stati progettati molti tipi di spettrometri di massa, sempre più sofisticati, e sono fiorite strategie d’uso e applicazioni, anche nel campo della biomedicina [138].

Nonostante i continui avanzamenti tecnologici, tutti gli spettrometri di massa sono strutturati secondo uno schema generale, che prevede una sorgente di ioni, un

analizzatore di massa, e un rilevatore, questi ultimi operante in condizioni di alto vuoto.

In ogni caso l’analisi in spettrometria di massa prevede una fase di preparazione del campione, che deve precedere l’introduzione dello stesso nello strumento, che deve essere compatibile con la piattaforma utilizzata, specifica per il tipo di analita e di matrice (una fase acquosa oppure organica), e compatibile con il tipo di ionizzazione utilizzata. Soltanto attraverso un’opportuna preparazione del campione è possibile produrre ioni con elevata efficienza (elevata sensibilità) che, attraverso una serie di lenti, vengono veicolati verso gli analizzatori, dove possono essere opportunamente selezionati sulla base del loro

40 rapporto massa/carica e rivelati.

I passaggi fondamentali di un esperimento in spettrometria di massa sono quindi:

- ionizzazione degli analiti: all’interno della sorgente ionica tutte le specie chimiche, tra quelle presenti nel campione, che possono essere ionizzate nelle condizioni in cui