1 Dipartimento di Medicina Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in Medicina e
Chirurgia
SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN PATOLOGIA CLINICA E
BIOCHIMICA CLINICA
Determinazione dello ione cloruro nel test del sudore mediante
spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS):
un nuovo test di conferma per la diagnosi di fibrosi cistica
Relatori
Chiar.mo Prof. Aldo Paolicchi
Chiar.mo Dott. Alessandro Saba
Candidata
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Sommario
RIASSUNTO ... 4 INTRODUZIONE ... 5 FIBROSI CISTICA ... 5 Epidemiologia ... 6Mutazioni del gene CFTR ... 7
Classe I: Sintesi proteica difettosa ... 8
Classe II: alterato processamento della proteina ... 8
Classe III: Deficit nella regolazione ... 9
Classe IV: Difettosa conduzione ... 9
Classe V: Ridotta presenza di proteina sulla membrana cellulare ... 9
Classe VI: Ridotta stabilità della proteina ... 9
Funzioni e disfunzioni del CFTR ... 10
Diagnosi ... 15
Screening neonatale ... 19
Analisi genetica ... 20
Correlazione genotipo-fenotipo ... 22
Differenza di potenziale nasale ... 24
Test ausilari ... 25
Test del sudore ... 25
Fisiologia della ghiandola sudoripara ... 26
Stimolazione del sudore ... 27
Raccolta del sudore ... 28
Analisi del sudore ... 30
1. Misure indirette ... 30
2. Misura diretta ... 31
3.Interpretazione dei risultati ... 31
4.Insidie dell'analisi del sudore ... 32
Terapia ... 34
Terapie innovative ... 37
SPETTROMETRIA DI MASSA ... 39
Spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente ... 40
PROGETTO DI RICERCA ... 43
Materiali e metodi ... 45
Reagenti e materiali ... 45
Strumentazione ... 46
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Dati sperimentali ... 51
Risultati ... 52
Validazione del metodo ... 52
Risultati dello studio sperimentale ... 58
Conclusioni ... 61
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RIASSUNTO
Il test del sudore rappresenta attualmente l’esame gold standard per la diagnosi di Fibrosi Cistica. Le attuali linee guida per l'analisi del cloruro nel sudore identificano le procedure per la raccolta del sudore, ma non per il dosaggio del cloruro, che di solito viene eseguito con metodi non sempre sufficientemente sensibili da riuscire a determinare le quantità di cloruro nel sudore di soggetti normali.
Per superare questa limitazione, abbiamo creato, validato e adottato un metodo originale basato sulla spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) per la determinazione del cloruro nel sudore.
Il metodo è stato progettato per renderlo facilmente utilizzabile in un laboratorio clinico. Esso è risultato essere lineare nell'intervallo 8,5-272 μM, la precisione ha mostrato una deviazione standard relativa <6% e l’accuratezza è compresa nell'intervallo 99,7-103,8%. Il limite di bianco (LOB), limite di rilevazione (LOD) e limite di quantificazione (LOQ) sono 2,12 mM, 3,22 mM e 7,01 mM, rispettivamente. Le reali concentrazioni iniettate nello spettrometro di massa corrispondevano a 3,90 μM (0,13 μg / ml) per il limite di rilevazione e 8,50 μM (0,30 μg / ml) per limite di quantificazione.
La concentrazione media di cloruro tra 50 volontari sani è risultata pari a 15,7 mM (25-75 ° percentile 10,1-19,3 mM, intervallo 2,8-37,4 mM); in tre pazienti con sospetta fibrosi cistica è stato rilevato un valore di cloruro nel sudore di 65,6 mM, 81,2 mM e 47mM, rispettivamente. Considerando il carico di lavoro della nostra strumentazione e del personale, il costo per una singola determinazione è di circa 13 euro, quindi compatibile con la routine per diagnosi di fibrosi cistica.
Le prestazioni analitiche e il costo relativamente basso della strumentazione ICP-MS fanno di questa tecnologia il miglior candidato per fornire un metodo di riferimento superiore agli standard attuali per la determinazione di cloruro nel sudore. Un ulteriore vantaggio di questa metodica risiede nella capacità di dosare il cloruro anche in campioni disponibili in piccole quantità, non sufficienti per l’analisi con le metodiche attuali. Eventualità che si verifica frequentemente, per esempio, nel caso di neonati sottoposti al test.
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INTRODUZIONE
FIBROSI CISTICA
La Fibrosi cistica (FC) è stata riconosciuta come un’entità clinica distinta da più di 60 anni.[1] I primi riferimenti includono un motto del folclore del Nord Europa: “Guai a quei bambini che quando li baci sulla fronte hanno un sapore salato. Essi sono stregati e presto moriranno”. La prima descrizione esaustiva della Fibrosi Cistica fu fornita nel 1938 da Dorothy Andersen.[1] Ella descrisse la fibrosi cistica del pancreas in 49 pazienti.[1] Nel 1948, un’ondata di caldo a New York permise a Sant’Agnese di scoprire che i pazienti con Fibrosi Cistica perdono un’eccessiva quantità di sali con il sudore.[2] Questa scoperta storica portò nel 1959 allo sviluppo del test del sudore per la diagnosi, ad opera di Gibson e Cooke.[3] Basandosi su queste osservazioni, Quinton riferì che i dotti delle ghiandole sudoripare dei pazienti affetti da fibrosi cistica erano relativamente impermeabili al cloro.[4] La base genetica fu confermata dalla scoperta del gene CFTR nel 1989.[5]
La fibrosi cistica è una delle più̀ frequenti patologie geneticamente determinate, ad andamento clinico cronicamente evolutivo; è causata da mutazioni a carico del gene Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR), che si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e si estende per oltre 250.000 basi e contiene 27 esoni, il cui prodotto è un canale cAMP-dipendente deputato alla secrezione dello ione cloruro e di altri anioni.[5]
Fig 1: Gene CFTR e sua trascrizione
La trasmissione genetica della FC è autosomica recessiva. Sono state identificate oltre 2000 varianti genetiche, molte delle quali sono state associate alla malattia.[6] Le
6 mutazioni hanno effetti diversi sulla produzione della proteina CFTR, sulla sua funzione e sulla sua stabilità alla membrana cellulare.[7] L’espressività̀ clinica riconosce per alcune manifestazioni una discreta correlazione col genotipo [8], per altre giocano un ruolo importante sia l’intervento di fattori dell’infiammazione[9] che quello di altri fattori esterni al gene CFTR (geni modificatori, fattori ambientali, terapie, etc).[10]
Epidemiologia
L’incidenza della fibrosi cistica varia secondo l’etnia; in Europa è stimata 1:2000 – 1:3000 nati caucasici; le mutazioni del gene CFTR sono più̀ frequenti nelle popolazioni del Nord Europa, ove peraltro sono più̀ omogenee che altrove (predominanza assoluta della DF508), differenziandosi considerevolmente nelle altre regioni europee per la presenza con diversa frequenza di molte altre mutazioni. [11]
L’alta frequenza della mutazione nei caucasici potrebbe essere dovuta a un vantaggio dell’eterozigote, che pare presenti una maggiore resistenza alla diarrea secretoria da colera o da febbre tifoide, maggiore fertilità, ridotti episodi asmatici e resistenza ad una varietà di agenti infettivi [5,12]. Tuttavia, queste teorie mancano di prove confermative. Negli USA la prevalenza alla nascita è 1:2500 – 1:3500 tra i bianchi non ispanici, 1:4000 – 1:10000 tra gli ispanici,1:15000 – 1:20000 tra i neri non ispanici [13, 14], anche se per questi ultimi due gruppi, recentemente, viene segnalata una frequenza più̀ alta [15]. I bianchi non ispanici costituiscono più̀ del 90% dei pazienti USA che ricevono la diagnosi di FC, pur rappresentando solo il 56% delle nascite[16]; l’incidenza di fibrosi cistica in tutti i nati USA è all’incirca 1:3700.[17] Le mutazioni presenti in USA riflettono le origini geografiche dell’attuale popolazione con una forte relazione con gli europei: tra i neri non ispanici la DF508 è la 1° mutazione con frequenza del 48%, la 2° è la 3120+1G>A, rara nelle altre etnie ma presente in Africa ed Arabia dove rara è invece la DF508.
L’incidenza di FC è in genera più̀ alta di quella della fenilchetonuria (1:20.000) e della galattosemia (1: 67.000), più̀ vicina invece a quella dell’ipotiroidismo congenito (1:2500) e della SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (1:2600) [17].
In Italia la prevalenza media della malattia alla nascita, tenendo conto di tutti i dati raccolti dal 1988 al 2014, è di 1:4079 nati vivi, inferiore quindi a quanto riportato in letteratura per la popolazione caucasica (1:2500 –1:3000), con notevoli differenze tra regioni che attuano screening neonatale da molti anni e regioni dove la diagnosi è posta quasi esclusivamente per sintomi [18]. Sulla base dei dati del Registro Italiano dei Pazienti FC (RIFC), al 31.12.2014 erano in vita 4099 pazienti (2125 maschi e 1974 femmine) di età
7 compresa tra 0 e 68 anni. La prevalenza di malattia era pertanto di 7.01/100.000 abitanti, circa il doppio di quanto rilevato al 1° gennaio 1988 (3.62/100 ̇000), data di attivazione del RIFC. Si osserva un incremento nella percentuale di pazienti al di sopra dei 18 anni: nel 2014 i pazienti adulti (≥ 18 anni) erano 1742 (42% del totale) e 172 di questi (90 maschi e 82 femmine) avevano superato i 40 anni [18]. Così come per altre regioni europee [19] in Italia si è verificata una notevole variabilità̀ genetica, come dimostrano i risultati dell’analisi molecolare disponibili per l’82% dei pazienti: la mutazione più̀ frequente (DF508) interessa solo il 49% di tutti i cromosomi FC e il restante è caratterizzato da numerose altre mutazioni, con differenze sensibili in relazione alla Regione di origine [20].
Mutazioni del gene CFTR
Più di 2000 varianti genetiche sono stati definite per il CFTR. Ci sono regioni in cui le mutazioni sono più comuni, come a livello del dominio che lega il nucleotide e a livello del dominio regolatorio [21].
I diversi tipi di mutazione scoperti includono le mutazioni missense (46%), frameshift (22%) splite site (16%), non sense (14%) e frame deletion (2%). La maggior parte di queste mutazioni (83%) è associata alla patologia, mentre la parte restante è classificata come polimorfismi indicati come mutazioni “non patologiche”: un esempio è la DF508C (conversione T-C in posizione 508) che può avere lo stesso aspetto elettroforetico di DF508.68. Altri polimorfismi possono avere una lieve disfunzione che in alcune circostanze può alterare la funzione CFTR in modo da causare la malattia (es M470V). Alterazioni nel gene CFTR per essere designate come mutazioni che causano la malattia dovrebbero soddisfare almeno uno dei criteri suggeriti nella dichiarazione di consenso della fondazione FC [22].
Le mutazioni nel gene CFTR sono state inizialmente classificate in 5 classi in base agli effetti che esse determinano sulla funzione del CFTR e recentemente è stato incluso un sesto gruppo [23-25]. Tuttavia, queste classi non si escludono a vicenda e le mutazioni specifiche possono avere caratteristiche di più di una classe.
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Fig 2. Classi di mutazioni del CFTR
Classe I: Sintesi proteica difettosa
Le mutazioni di questa classe non permettono la sintesi della proteina e includono i fenotipi FC più severi. [23,24] La mutazione più comune di classe I è G542X, che impedisce la sintesi di una proteina stabile o si traduce nella produzione di una proteina troncata a causa della sintesi di un codone di stop prematuro [24].
Classe II: alterato processamento della proteina
Le mutazioni di questa classe si traducono in una proteina CFTR strutturalmente anormale che a causa del ripiegamento errato non riesce a raggiungere una corretta localizzazione cellulare. Questa classe include la più comune e prima mutazione riconosciuta DF508 (eliminazione della fenilalanina in posizione 508). Altre mutazioni missense associate ad errori di processamento sono presenti in tutto il CFTR. Nelle cellule ricombinanti, il CFTR contenente la mutazione DF508 non riesce a maturare fino alla forma completamente glicosilata e quindi viene degradata dalla cellula prima di poter svolgere la sua funzione; la proteina, pertanto, è mancante o presente in quantità ridotte nella membrana apicale degli epiteli intestinale, respiratorio ed epatobiliare. Alcune mutazioni, come P574H, hanno un difetto di piegatura meno grave di DF508 e come risultato la proteina raggiunge la membrana plasmatica e mantiene una qualche funzione [26].
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Classe III: Deficit nella regolazione
Le mutazioni di questa classe producono una proteina che viene trasferita alla membrana cellulare ma non risponde allo stimolo del cAMP.59 Fino ad oggi le mutazioni della classe III determinano un’alterazione a livello del dominio di legame del nucleotide. Poiché l’ATP intracellulare regola l’apertura dei canali del cloruro CFTR attraverso le interazioni dirette con il dominio di legame del nucleotide, non sorprende che le mutazioni in questi domini possano alterare la funzione del canale. In alcune mutazioni, ad esempio G551D, c’è una funzione minima ed in alcuni casi, ad es. S125P, l’ATP è meno potente nell’attività stimolante.
Classe IV: Difettosa conduzione
Molte mutazioni missense che sono state identificate nel gene codificano per alterati domini presenti sulla membrana; in questi casi il gene CFTR codifica per una proteina che giunge correttamente a livello della membrana cellulare e risponde agli stimoli ma genera una ridotta corrente di cloruro [23]. Alcuni esempi includono mutazioni in cui l’arginina viene sostituita dall’istidina al residuo 117 (R117H), triptofano al 334 (R334W) o prolina al 347 (R347P); quando questi CFTR mutanti vengono espressi in cellule epiteliali eterologhe, tutti e tre sono processati correttamente, sono presenti sulla membrana apicale, ma la conduttanza dello ione è ridotta [27]. Ciò è dovuto alla ridotta velocità del flusso ionico attraverso un singolo canale aperto. Inoltre, almeno per R117H, viene ridotta anche la quantità di tempo in cui il canale è aperto [27].
Classe V: Ridotta presenza di proteina sulla membrana cellulare
Le mutazioni in questo gruppo includono mutazioni missense, ad es. A455E (sostituzione di acido glutammico con alanina). Le mutazioni più frequenti sono a livello dell’esone 9 e dell’introne 8. Tuttavia, anche mutazioni a carico del promotore del gene CFTR possono produrre fenotipi patologici riducendo i livelli di trascritto.
Queste mutazioni producono un ridotto quantitativo di trascritto del gene CFTR e bassi livelli di proteina funzionale a livello della membrana cellulare. In alcuni casi viene prodotto un piccolo quantitativo di mRNA di lunghezza normale e questo potrebbe spiegare un fenotipo più lieve.
Classe VI: Ridotta stabilità della proteina
Le mutazioni di questa nuova classe includono le alterazioni della stabilità della proteina dovute principalmente all’assenza dei residui 70-98 all’estremità C-terminale [25, 28].
10 Sebbene questa porzione non sia necessaria per la funzione biologica del canale risulta essere indispensabile per mantenere la stabilità del complesso CFTR glicosilato.
Le mutazioni del CFTR sono classificate come severe o lievi a seconda dell’impatto sulla funzionalità della proteina e del quadro clinico. Generalmente mutazioni severe provocano mancata sintesi o blocco del processo (Classe I, II, III), mentre le mutazioni lievi portano ad un’alterata conduttanza o ad una ridotta sintesi (Classi IV, V, VI).
Funzioni e disfunzioni del CFTR
Il gene CFTR codifica per una glicoproteina transmembrana di 1480 aminoacidi e ha una massa molecolare di 168kDa [29]. CFTR, che si trova sulla membrana apicale delle cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie, l’albero biliare, l’intestino, i dotti deferenti, le ghiandole sudoripare e i dotti pancreatici, è un membro della famiglia di trasportatori che lega ATP.
La Fig.3 mostra che gli amminoacidi di CFTR formano 5 domini: 2 domini presenti a livello della membrana plasmatica, ciascuno dei quali composto da 6 subunità; due domini di legame nucleotidici ed un dominio regolatorio citoplasmatico. I domini presenti a livello della membrana plasmatica sembrano contribuire alla formazione di un poro-canale che permette il passaggio del cloruro: si è visto, infatti, che mutazioni di residui specifici all’interno del primo dominio alterano la selettività anionica del canale [30, 31]. Il dominio di legame nucleotidico di CFTR è responsabile del legame e dell’idrolisi dell’ATP e fornisce l’energia necessaria per l’attività del canale. Il dominio citoplasmatico regolatorio modula l’attività del canale di CFTR e può avere entrambi gli effetti stimolatore ed inibitore.
L’evidenza scientifica ha dimostrato che CFTR è un canale del Cloro cAMP-dipendente. Questo è stato testato direttamente da Bear e colleghi nel 1992; [32].
11 Tuttavia, la sola funzione di trasporto di cloruro non può spiegare l’intera patogenesi della malattia; molte altre funzioni che sono state descritte non sono direttamente associate al meccanismo di canalopatia. Il CFTR interagisce infatti, nel suo ruolo di regolatore della conduttanza di membrana, con diversi altri canali di membrana (sodio, potassio e cloro attivato dal calcio), con trasportatori (ATP e glutatione) e con proteine legate al citoscheletro delle cellule epiteliali [33, 34]. Questi ruoli regolatori non possono essere facilmente correlati tra loro ma suggeriscono che il CFTR modula più percorsi cellulari. CFTR co-regola il trasporto di sodio attraverso un canale epiteliale del sodio (ENaC): il CFTR normale inibisce il trasporto mediato da ENaC, mentre quello mutato consente un migliore trasporto di sodio [35]. CFTR stimola anche una conduttanza del cloruro verso l’esterno (ORCC), aumentando la propria attività di trasporto del cloro [36, 37]. Un’ipotesi corrente suggerisce inoltre che questo trasportatore faciliti il rilascio di ATP, che stimola un recettore purinergico; quest’ultimo agisce quindi attraverso una seconda via di messaggistica per regolare l’ORCC [38]. In diversi tessuti, CFTR svolge un ruolo chiave nella modulazione della secrezione di bicarbonato: [38, 39] Choi e colleghi nel 2001 hanno scoperto che i pazienti FC con insufficienza pancreatica non hanno un trasporto misurabile di bicarbonato e quelli che presentano sufficienza pancreatica mostrano un ridotto trasporto di bicarbonato [40]. La membrana apicale epiteliale contiene anche un altro canale del cloro che sembra essere regolato dal calcio intracellulare (CaCC), sebbene la regolazione e la struttura molecolare rimangono da stabilire con certezza [38]. CaCC è presente nelle cellule epiteliali delle vie aeree e delle ghiandole sudoripare; in quest’ultime, gli agonisti muscarinici aumentano la concentrazione di calcio intracellulare e stimolano la produzione di sudore attraverso l’apertura dei canali di cloruro attivati dal calcio presenti a livello della membrana [38]. Il CFTR non è quindi solamente un canale del cloruro, ma è un complesso proteico multifunzionale.
Il principale effetto della mancata funzione del canale è un alterato trasporto di ioni cloruro e bicarbonato [41, 7]. L'interazione tra CFTR e altri canali ionici, in particolare il canale epiteliale del sodio (ENaC), e quella con le vie cellulari correlate all'infiammazione (inflammasoma) potrebbero essere tutte importanti nella fisiopatologia della fibrosi cistica [41].
L'importanza di comprendere la fisiopatologia di questa malattia è data dal fatto che già all'età di 3 anni, quasi un terzo dei bambini con fibrosi cistica presenta alla scansione TC ristagno di muco a livello bronchiale, bronchiectasie e infiammazione mediata da neutrofili, aumento dell’elastasi neutrofila ed episodi ricorrenti di infezione [42-44].
12 L'ipotesi principale che permette di spiegare queste caratteristiche cliniche è la presenza di una compromissione della clearance muco-ciliare causata da un'idratazione anormale del liquido superficiale delle vie aeree.(figura 2) [41, 45-47]. Inoltre l’alterato trasporto dello ione bicarbonato da parte del CFTR mutato modifica il pH del liquido superficiale delle vie aeree [45-50]. Una serie di esperimenti, che hanno analizzato il liquido superficiale delle vie aeree proveniente da modelli suini di fibrosi cistica, ha dimostrato che l'abbattimento batterico dipende fortemente dal pH e quindi un cambiamento nel pH potrebbe causare una compromissione dell’immunità innata riducendo la funzione dei peptidi antimicrobici [51, 52]. Affinché il muco delle vie aeree possa svolgere la sua normale funzione è importante quindi anche la presenza di bicarbonato; concentrazioni ridotte dell'anione potrebbero infine aumentare anche la viscosità del muco.
E’ possibile che la disfunzione del CFTR comporti molteplici conseguenze sull'idratazione, sulla clearance muco-ciliare, sul legame e sulla funzione del muco, sulla compromissione dell’immunità innata, e potrebbe anche predisporre ad un aumento dell'infiammazione cellulare intrinseca. L'impatto relativo di questi effetti potrebbe variare con l'età e la progressione della malattia.
Caratteristiche cliniche
La FC colpisce le cellule epiteliali di diversi organi, tra cui le vie respiratorie, il pancreas esocrino, l’intestino, i dotti deferenti, il sistema epatobiliare e le ghiandole sudoripare esocrine.
Gli epiteli colpiti presentano, nel loro stato originale, funzioni diverse: alcuni sono deputati all’assorbimento di liquidi (come l’epitelio delle vie aeree e quello intestinale distale), altri a quello di sali ma non di liquidi (come l’epitelio dell’intestino prossimale e dei dotti sudoripari), altri ancora sono preposti alla secrezione di liquidi (come l’epitelio dei dotti pancreatici). Data la diversità delle attività native, non è sorprendente che la FC produca effetti organo specifici diversi sul trasporto di elettroliti e di acqua.
Ciò si traduce in una malattia multiorgano caratterizzata da malattia polmonare suppurativa, insufficienza pancreatica, cirrosi biliare multifocale, infertilità maschile e perdita elevata di elettroliti con il sudore.
La maggior parte dei pazienti con FC si presenta con segni e i sintomi della malattia nell’infanzia; all’incirca il 20% dei pazienti presenta ostruzione gastrointestinale, detta ileo da meconio, entro le prime 24 ore di vita, mentre altre modalità comuni di presentazione, entro il primo o i primi 2 anni di vita comprendono sintomi a carico dell’apparato respiratorio, soprattutto tosse persistente e/o infiltrati polmonari ricorrenti
13 e ritardo dell’accrescimento. In una percentuale significativa di pazienti (circa il 5%), tuttavia la diagnosi viene posta dopo i 18 anni di età.
Le manifestazioni polmonari sono le complicanze più gravi della FC.
L’epitelio delle vie aeree FC esprime alterazioni sia nell’assorbimento attivo di Na+ sia nella secrezione attiva di Cl-. Un’osservazione importante è che vi è anche il canale CaCC
espresso sulla membrana apicale che può sostituire il CFTR in relazione alla secrezione di Cloro ed è un potenziale bersaglio terapeutico.
Fig 4.CFTR presente a livello delle vie aeree
L’ipotesi centrale della fisiopatologia delle vie aeree nella FC è che l’alterata regolazione dell’assorbimento di Na e l’inabilità di secernere Cl attraverso il CFTR riducano il volume di liquido sulla superficie delle vie aeree, esse risultino “disidratate”. Sia l’ispessimento del muco sia la deplezione del liquido periciliare conducono all’adesione del muco sulla superficie delle vie aeree. Quest’ultima conduce a un’incapacità di eliminare il muco dalle vie aeree tramite sia le ciglia sia meccanismi dipendenti dal flusso aereo (tosse). Ciò causa ostruzione delle piccole vie aeree e favorisce l’infezione delle stesse. Le infezioni ricorrenti e l’infiammazione risultante portano all’ipertrofia della ghiandola sottomucosa, all’eccessiva secrezione di muco e al danneggiamento delle vie aeree fino alla formazione di bronchiectasie.
All’inizio della vita, i pazienti sono infettati da uno spettro limitato di batteri, più comunemente Staphylococcus aureus ed Haemophilus influenzae non tipizzabile, e con la progressione della malattia Pseudomonas aeruginosa diventa il patogeno più comune [53]. Il primo sintomo dell’interessamento del tratto respiratorio inferiore è la tosse, che con il passare del tempo diventa persistente e si accompagna a un’espettorazione vischiosa e purulenta, spesso di colore verdastro. Inevitabilmente, i periodi di stabilità clinica sono intervallati dalle “riacutizzazioni”, caratterizzate da aumento della tosse e del volume dell’espettorato, da calo ponderale, da febbricola e da una diminuzione della funzione respiratoria. Con il passare degli anni le riacutizzazioni divengono sempre più
14 frequenti ed il recupero delle funzioni polmonari sempre meno completo, con una inevitabile progressione verso l’insufficienza respiratoria ed il cuore polmonare.
La prima alterazione della funzione polmonare che si osserva nel bambino con fibrosi cistica è un aumento del rapporto tra volume residuo e la capacità polmonare totale; ciò suggerisce che la prima alterazione funzionale nella FC sia una malattia delle piccole vie aeree. Quando il processo patologico progredisce, si osservano modificazioni reversibili ed irreversibili della capacità vitale forzata e della FEV1 (volume espiratorio forzato in 1 secondo); la componente reversibile riflette l’accumulo di secrezioni intra luminali e/o l’iperreattività delle vie aeree, il che si verifica nel 40-60% dei pazienti, mentre la componente irreversibile riflette la distruzione cronica della parete delle vie aeree e la bronchiolite. L’alterazione più precoce visibile alla radiografia del torace è l’iperinsufflazione, che riflette l’ostruzione delle piccole vie aeree; in uno stato più avanzato si osservano segni di accumulo luminale di muco, di ispessimento delle pareti bronchiali e, infine, di bronchiectasie (ombre ad anello).
Gli effetti gastrointestinali della FC sono svariati. Nel pancreas esocrino l’assenza del canale del Cl- nella membrana apicale degli epiteli pancreatici duttali altera la funzione
di uno scambiatore Cl-HCO3- della membrana apicale nel portare a termine la secrezione
del bicarbonato e del Na+ (con un processo passivo) nel dotto; il deficit della secrezione
di Na+HCO3- e dell’acqua porta alla ritenzione degli enzimi nel pancreas e, alla fine,
conduce alla distruzione pressoché totale del tessuto pancreatico. L’insufficienza pancreatica esocrina è presente nell’85% dei pazienti con fibrosi cistica ed è l’unica caratteristica clinica che ben correla con il genotipo. 30 L’insufficiente rilascio di enzimi pancreatici dà origine al tipico quadro di malassorbimento proteico e lipidico con steatorrea e scarsa nutrizione; oggi superate con la dieta e la sostituzione degli enzimi pancreatici. Le cellule beta-pancreatiche sono risparmiate nelle fasi precoci, ma la loro funzione diminuisce con l’età. Questo effetto, più la resistenza all’insulina indotta dalla flogosi, causa iperglicemia con necessità di somministrare insulina in più del 15% dei pazienti più anziani con FC (>35anni di età). Pazienti pancreatici sufficienti (15%) possono presentarsi in età avanzata e di solito presentano una malattia polmonare più lieve e valori di elettrolita nel sudore normale o borderline [54, 55].
Nella FC l’epitelio intestinale, a causa della mancata secrezione di Cl- e acqua, non è in
grado di rimuovere le mucine e le altre macromolecole secrete dalle cripte intestinali. La diminuita secrezione mediata da CFTR di liquido può essere esacerbata dall’eccessivo assorbimento di liquido, che riflette alterazioni della regolazione mediata da CFTR dell’assorbimento di Na+. Entrambe le disfunzioni conducono ad una disidratazione del
15 contenuto del lume intestinale e a ostruzione sia dell’intestino tenue che dell’intestino crasso. La sindrome da ileo da meconio si verifica nel 10-20% dei neonati con fibrosi cistica e presenta una vasta gamma di presentazioni dal passaggio ritardato di meconio all’ostruzione intestinale franca[56].[57] La stitichezza ricorrente e la sindrome dell’ostruzione intestinale distale sono più frequentemente presenti nei pazienti con fibrosi cistica più anziani.
Un inizio ritardato della pubertà è comune sia nei maschi che nelle femmine con FC; il quadro di sviluppo ritardato è verosimilmente secondario agli effetti della malattia polmonare cronica e a quelli di una funzione riproduttiva endocrina alterata secondaria alla nutrizione inadeguata. Circa il 97% dei maschi affetti da FC presenta azoospermia, legata all’obliterazione dei vasi deferenti dovuta ad un’alterata secrezione di liquidi (CBAVD). L’infertilità può essere la presentazione iniziale per alcuni maschi con malattia lieve, la diagnosi di FC in questi uomini è problematica [58].
Il 20% circa delle femmine affette da fibrosi cistica è sterile a causa degli effetti della malattia polmonare cronica sul ciclo mestruale, della presenza di muco cervicale spesso che blocca la migrazione degli spermatozoi e, forse, di alterazioni del trasporto dei liquidi a livello della parete delle tube uterine e dell’utero. La maggior parte delle gravidanze conduce a neonati sani e le donne con FC sono in grado di allattare normalmente.
Il difetto di riassorbimento del sodio e del cloro nelle ghiandole sudoripare porta ad un sudore eccessivamente salato ed in certi casi allo squilibrio elettrolitico, con alcalosi metabolica, disidratazione e rischio di morte [57]. I neonati affetti da FC sono molto più sensibili al caldo[59]. Una volta però fatta la diagnosi, con l’assunzione aggiuntiva di sali, questo problema si manifesta raramente.
Sebbene la FC sia una malattia multi-sistemica, il coinvolgimento polmonare è la maggiore causa di morbilità e più del 90% di mortalità.
Con un’aspettativa di vita inferiore ad un anno nel 1940, la sopravvivenza mediana è aumentata a più di 35 anni. Nonostante questi progressi, le terapie attuali trattano nella maggior parte dei casi i sintomi piuttosto che la causa primaria della malattia; di conseguenza la FC rimane una malattia mortale e letale.
Diagnosi
Fino alla scoperta del gene CFTR avvenuta nel 1989 la diagnosi di FC era basata su criteri clinici definiti ed un’accurata analisi di elettroliti nel sudore [60]. Lo sviluppo del test del sudore di Gibson and Cooke nel 1959 fu una pietra miliare per la diagnosi di FC, da allora
16 la misurazione degli elettroliti nel sudore mediante iontoforesi pilocarpinica è rimasto il test diagnostico principale per la malattia.
La scoperta del gene CFTR e di tecniche di laboratorio in grado di rilevare le mutazioni dello stesso ha facilitato la diagnosi di fibosi cistica e ha ampliato notevolmente lo spettro clinico della malattia permettendo l’inclusione anche di forme più miti e atipiche [61]. Nel 1998 [62], è stata data una nuova definizione di fibrosi cistica basata su criteri multipli:
-presenza di almeno una delle caratteristiche fenotipiche o una storia di FC in un fratello o uno screening neonatale positivo,
-con riscontro di anormalità̀ del CFTR documentate da almeno una delle seguenti condizioni:
1) concentrazioni elevate di cloro nel sudore,
2) identificazione di 2 mutazioni CFTR associate con fibrosi cistica o
3) dimostrazione in vivo di anormalità̀ del potenziale elettrico a livello della mucosa nasale.
Questi criteri sono stati aggiornati dalla Cystic Fibrosis Foundation CFF che ha pubblicato nel 2008 le Linee Guida per la diagnosi di fibrosi cistica sia in epoca neonatale che in età̀ adulta. I nuovi criteri diagnostici tengono conto non solo delle forme di fibrosi cistica con insufficienza e sufficienza pancreatica, ma anche delle forme fenotipicamente meno classiche classificate come disordini correlati a CFTR. Nel 2015 la CF Foundation ha deciso di rivedere le linee guida diagnostiche del 2008 [63]: ha convocato un comitato internazionale di esperti nella diagnosi della FC per aggiornare la guida diagnostica e ottenere la standardizzazione nelle definizioni in tutto il mondo. La missione di questo comitato era di sviluppare linee guida chiare e attuabili per il consenso sulla diagnosi di CF e altre condizioni associate a mutazioni nel gene CFTR come la sindrome metabolica correlata alla CFTR (CRMS)[64] o lo screening positivo per CF, la diagnosi inconclusiva (CFSPID) [65] e disturbi correlati al CFTR [66]. Il comitato ha approvato 27 dichiarazioni di consenso (Tab 1) in 4 categorie sovrapposte che si applicano a: (1) popolazioni selezionate e non; (2) popolazioni e feti sottoposti a screening neonatale e a test prenatali; (3) bambini con diagnosi incerta e pazienti con CRMS o CFSPID (ora considerati uguali); e (4) pazienti presentano manifestazioni cliniche tipiche della FC che non hanno eseguito lo screening neonatale, compresi soggetti più anziani, i bambini nati a casa o nati in regioni dove non veniva eseguito l’ NBS, quelli con test di screening falsi negativi.
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Tab. 1: Raccomandazioni di Consenso per la diagnosi di FC
La figura 5 fornisce un algoritmo semplificato per come queste affermazioni di consenso dovrebbero essere applicate agli individui con sospetto di CF a causa di un risultato NBS positivo, la presenza di segni o sintomi tipici della patologia, o il riconoscimento di una storia familiare di FC (il più delle volte fratello). Va notato che un risultato NBS positivo non significa che il bambino abbia la FC; la probabilità di una diagnosi CF dopo un risultato positivo varia notevolmente a seconda del metodo NBS utilizzato.
Anche se molti individui entrano in questo algoritmo per mezzo di uno screening neonatale positivo in cui sono stati condotti successivamente i test genetici CFTR, la diagnosi di CF si basa principalmente sulla dimostrazione diretta della funzione CFTR anormale misurando la concentrazione di cloruro nel sudore [67]. Sebbene riuscire ad ottenere un campione di sudore adeguato alle misurazioni del cloruro può essere difficile, in particolare nei bambini molto piccoli, l'esperienza e gli studi hanno dimostrato che ciò è spesso fattibile nei neonati a termine durante il primo mese post-natale (cioè durante il periodo neonatale) [68, 69].
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Fig.5. Algoritmo semplificato per la diagnosi di FC
Sebbene il NBS sia ora ampiamente implementato, la diagnosi di CF non è sempre chiara. Per confermare la diagnosi di fibrosi cistica è necessaria l’esecuzione di un test del sudore: un livello di cloruro nel sudore ≥60 mmol / L indica una diagnosi di FC e un livello di cloruro di sudore <30 mmol/L indica che la CF è improbabile. Negli individui che cadono nel livello intermedio di 30-59 mmol / L, è richiesta un'analisi genetica. Ulteriori test per valutare la funzione CFTR come NPD (differenza di potenziale nasale) e ICM (misura della corrente intestinale) possono anche essere indicati, ma devono essere eseguiti in un centro specializzato approvato per tali studi. Alcuni bambini con NBS positivo e livelli di cloruro di sudore da 30 a 59 mmol / L o persino ≤29 mmol / L e test genetici non conclusivi possono essere designati come CRMS / CFSPID. Sono necessarie ulteriori ricerche per determinare la loro prognosi e devono essere sottoposti a ristretto follow up.
Linee guida sono state sviluppate da molti gruppi per standardizzare la procedura di raccolta del sudore e garantire la qualità dei risultati del test [70, 71]. Il test del sudore è un test affidabile per la diagnosi di fibrosi cistica in circa il 98% dei pazienti affetti. Tuttavia, sono stati segnalati casi di pazienti con manifestazioni cliniche caratteristiche della FC ma valori di elettroliti nel sudore normali o al limite [19, 13, 14]; questo si
19 presenta solo nell’1-2% dei casi [19, 14, 68]. I dati disponibili suggeriscono che adulti sani potrebbero avere valori di elettroliti nel sudore equivalenti a quelli presenti nei pazienti affetti da FC, ma non sono stati raccolti dati sui valori di riferimento normali degli adulti [17].18 L’esecuzione del test durante l’infanzia presenta dei limiti, a causa dell’insufficiente raccolta di sudore e dell’aumento transitorio dei livelli di cloruro nel sudore durante le prime 24 ore di vita [17, 20].
Screening neonatale
Lo screening neonatale (NBS) per la fibrosi cistica divenne concretamente fattibile con l’avvento di un test radioimmunologico [72, 73] per il dosaggio della tripsina immunoreattiva (IRT) su sangue adsorbito su carta da filtro e disidratato (Guthrie card), procedura già usualmente utilizzata fin dagli anni ’60 per l’esecuzione di altri screening neonatali.
Il razionale per l’impiego di tale test per selezionare alla nascita i pazienti affetti da FC deriva dal riscontro di valori elevati di questo enzima nel sangue dei neonati con FC nei primi mesi di vita, probabilmente da attribuire al reflusso della tripsina verso il circolo ematico per un’ostruzione dei dotti pancreatici. Valori elevati di IRT si possono comunque trovare anche in soggetti non FC e proprio per superare il problema della ridotta specificità̀ del test nei primi giorni di vita (il primo campione di sangue viene infatti raccolto in 3a-5a giornata di vita), si esegue nei soggetti risultati positivi al primo test, un secondo prelievo di sangue a 20-30 giorni di vita per confermare la condizione di ipertripsinemia. Nei soggetti non FC infatti l’IRT tende nel primo mese a normalizzarsi, mentre nei soggetti FC tale parametro tende a permanere elevato nel tempo.
A partire dagli anni ’80 nei laboratori di screening si iniziano a utilizzare saggi immunoenzimatici (EIA, ELISA, DELFIA, ecc.) per il dosaggio dell’IRT implementati su analizzatori automatizzati o semiautomatizzati: questi saggi, confrontati con i convenzionali saggi radioimmunologici, offrono i vantaggi di una riduzione degli errori dovuti alla manipolazione dei campioni, impiego di reagenti non radioattivi, riduzione dei tempi di lavoro e più̀ elevate specificità̀ e sensibilità̀. Il test del sudore può essere praticato già 2-3 settimane di vita ma alcuni bambini non riescono a quest’età a produrre quantità̀ sufficienti di sudore, per cui il test richiede spesso di essere ripetuto.
In Italia, dopo lo step iniziale del dosaggio dell’IRT, nella prima settimana di vita, nelle regioni dove si attua lo screening neonatale per la fibrosi cistica sono in vigore i protocolli indicati nella tabella 2.
20 Tab 2: Protocolli di screening neonatale nei programmi di diverse regioni italiane
Nei programmi di screening neonatale del Veneto-Trentino-Alto Adige e Toscana si impiega da molto tempo, nei casi IRT positivi, in concomitanza con il test genetico, il saggio di lattasi su meconio essiccato, inviato assieme alla card per IRT, con apprezzabile incremento di sensibilità e soprattutto di specificità del sistema. Per l’analisi genetica vengono impiegate diverse tecniche di biologia molecolare e diversi kit commerciali che indagano 30-31 mutazioni del gene CFTR.
I programmi di NBS per FC presentano un tasso di falsi negativi di circa il 5% dei casi inattesi di FC, che deriva da una IRT neonatale falsamente bassa o dalla presenza di mutazioni CFTR non presenti nel pannello di mutazioni selezionate. [73, 74]. C’è anche un tasso di “falsi positivi” con una maggiore identificazione di portatori sani di FC [74, 75]. Questo è riportato nell’ordine di 1,5-1,8 volte il tasso previsto ed è probabilmente un riflesso di una distribuzione distorta (più alta) di IRT tra i portatori di FC [74, 76]. Si raccomanda generalmente che tutti i bambini positivi all’NBS (anche con due mutazioni CFTR) abbiano un test del sudore per escludere errori di laboratorio con lo screening.
Analisi genetica
L’analisi genetica si effettua come secondo o terzo step (a seconda dei protocolli usati per lo screening neonatale) e in questo caso non vi sono criteri univoci per definire il pannello delle mutazioni da indagare (ricerca solo della DeltaF508 o di mutazioni multiple). A tutt’oggi sono note più di 2000 mutazioni del gene CFTR e non di tutte è certo il ruolo causale per la malattia. Tra queste la più diffusa è la DF508, con una frequenza relativa variabile nelle diverse popolazioni: rappresenta infatti circa il 50% delle mutazioni nell’Europa meridionale, mentre è presente nell’80-90 % circa dei Paesi del Nord Europa. Il pannello delle altre mutazioni copre una frequenza variabile a seconda della
21 popolazione di appartenenza; d’altra parte, alcune mutazioni sono rappresentate in particolari popolazioni (un esempio è rappresentato dalla T338I nella popolazione di origine sarda o dalla R1162X, presente in alta frequenza quasi esclusivamente nel Nordest italiano), altre sono estremamente rare. Recentemente è stata trovata una mutazione S737F tipica dei pazienti originari della regione Toscana [77].
Per tutti questi motivi non esiste al momento attuale un test genetico ideale in grado di identificare tutte le mutazioni; le tecniche utilizzate devono soddisfare criteri di sensibilità, riproducibilità e rapidità e per questo sono disponibili kit commerciali standard correlati ad un grado crescente di complessità e di estensione del test genetico, a fronte di tecniche prodotte in laboratorio che non sempre soddisfano i suddetti criteri. Generalmente ogni laboratorio dovrebbe utilizzare un pannello di mutazioni più comuni nella propria area di utenza che consenta un buon tasso di identificazione (detection rate). La presenza di due mutazioni consente di porre diagnosi di malattia, mentre, in caso di identificazione di una sola mutazione, il test del sudore può discriminare, ma non sempre, tra portatori e malati con una sola mutazione identificabile.
Il primo step di analisi genetica (mediante tecniche quali RDB - Reverse Dot Blot - o OLA - Oligonucleotide Ligation Assay) vanta una minore copertura ma consente la ricerca di mutazioni note (circa una trentina in Italia), ed è in grado di identificare in Italia circa il 75% delle mutazioni più frequenti nella regione di riferimento del laboratorio e può essere integrata nel protocollo di screening neonatale come secondo livello.
L’analisi genetica ulteriore identifica mediante scanning tutti gli esoni e le regioni limitrofe, riconosce variazioni di sequenza e può portare di seguito al sequenziamento di una specifica regione del gene CFTR. Le tecniche più utilizzate per lo scanning sono DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Cromatography).
Attualmente lo scanning del gene non è integrato nei protocolli di screening neonatale, sia per la sua complessità tecnica sia perché l’identificazione di varianti non conosciute (non obbligatoriamente mutazioni causa di malattia) rende difficile la loro interpretazione e la loro correlazione con il fenotipo. È quindi da riservare a casi mirati, di difficile inquadramento diagnostico, quando il test del sudore non è conclusivo, in presenza di una sola mutazione o di nessuna mutazione nell’analisi genetica di primo livello, con ipertripsinemia persistente [78]. Il terzo livello di indagini è quello che mira a scoprire le mutazioni non identificate dalle indagini di primo e secondo livello: queste mutazioni sono talora il frutto di cambiamenti molto vasti e complessi nella sequenza del gene (riarrangiamenti genomici) e la tecnica QMPSF (quantitative multiplex Polymerase
22 Chain Reactions of Short Fluorescent Fragments) per identificarle è stata messa a punto negli ultimi anni.
Il fatto di usare una tecnica di primo o secondo o terzo livello dipende dallo scopo per cui il test genetico FC viene eseguito: se deve servire come “screening”, sia screening della malattia alla nascita fra tutti i neonati, sia screening del portatore nelle coppie che vogliono avere figli, si usa una tecnica di primo livello, perché più rapida e meno costosa. Se si usasse una tecnica di secondo o terzo livello, è vero che si potrebbero identificare un maggior numero di mutazioni (che sono comunque mutazioni più rare), ma bisognerebbe accettare tempi più lunghi e costi più elevati. E anche il rischio non piccolo che siano diagnosticate, invece che mutazioni, “varianti” dal significato sconosciuto, con risultati molto confondenti per chi ha eseguito il test.
Per queste ragioni le indagini di secondo e terzo livello sono riservate a particolari situazioni, per esempio quando vi sono diagnosi incerte di malattia fibrosi cistica oppure quando la coppia che vuole figli ha un rischio molto alto di avere figli con FC, come nel caso della coppia formata da una donna malata e un soggetto della popolazione generale. Un’altra implicazione dell’analisi della mutazione CFTR è la capacità di implementare la diagnosi prenatale. La diagnosi prenatale può essere eseguita mediante prelievo dei villi coriali nel primo trimestre o mediante amniocentesi nel secondo o terzo trimestre [79]. Tale test di solito viene effettuato in una famiglia che ha avuto un figlio precedentemente colpito dalla patologia o a causa dell’identificazione dell’intestino fetale iperecogeno durante l’ecografia di routine [80].
Correlazione genotipo-fenotipo
La correlazione tra il genotipo CFTR e il fenotipo della patologia è estremamente variabile. Ed è meglio definita per le manifestazioni pancreatiche e meno bene per le altre manifestazioni, in particolare per la malattia polmonare[25]. In generale, i pazienti che hanno due gravi mutazioni (Classe I-III) possono aspettarsi sin dall’infanzia l’insorgenza della malattia polmonare suppurativa e l’insufficienza pancreatica, mentre i pazienti con almeno una mutazione lieve (Classe IV-VI) presentano solitamente sufficienza pancreatica con malattia polmonare suppurativa ad insorgenza tardiva. Tuttavia l’esito di individui con le stesse mutazioni CFTR, anche se appartenenti alla stessa famiglia può essere significativamente diversa [24]. Ciò suggerisce un’influenza di fattori ambientali (inquinanti inalati, agenti patogeni infettivi e fumo) e forse fattori genetici secondari che possono agire come modificatori della funzione CFTR [25, 81]. Tuttavia, non esistono geni CFTR regolatori che sono stati scoperti in grado di influenzare la funzione
23 polmonare. Mutazioni genetiche per citochine associate a infiammazione polmonare sono state studiate senza associazioni trovate [24, 82, 83]. Un’altra variabile da considerare per quanto riguarda l’effetto delle mutazioni di CFTR sul fenotipo è che lo splicing di mRNA CFTR può essere diverso tra i tessuti, con alcuni tessuti come i dotti deferenti che sono più sensibili alle mutazioni CFTR rispetto ad altri tessuti come l’epitelio delle vie aeree [84], esiste dunque una gerarchia della responsività dei tessuti ai difetti di funzionamento del CFTR.
Il fenotipo della fibrosi cistica è una complessa interazione di: mutazioni del gene CFTR, geni regolatori, trasporto del cloruro attraverso il CFTR e interazione con altri canali ionici, funzione del CFTR intracellulare, espressione tissutali di CFTR e responsività tissutale alle mutazioni del CFTR in combinazione con l’esposizione ambientale ad una gamma di possibili agenti.
Ci sono molti casi descritti in cui le caratteristiche cliniche, il genotipo CFTR e le misurazioni elettrofisiologiche sono contraddittorie rispetto alla diagnosi di FC. Warren e colleghi hanno descritto un paziente in cui lo screening neonatale e l’analisi delle mutazioni suggerivano una diagnosi di fibrosi cistica, tuttavia le manifestazioni cliniche e il test del sudore non erano coerenti con la diagnosi.68 Il sequenziamento diretto del DNA genomico del paziente mostrava una condizione di eterozigosi composta per DF508 e DF508C, un polimorfismo non associato a malattia clinica. Un report di Chmiel e colleghi ha presentato un caso in cui a una bambina asintomatica (3 settimane di vita) è stata fornita la diagnosi di FC basata esclusivamente sull’analisi del DNA da sangue cordonale, positiva per entrambe le mutazioni DF508 e R117H.88 Nonostante qualsiasi altra presentazione e una normale quantità di cloruro nel sudore, ricevette supplementi di enzimi pancreatici. A 2 mesi di età, è stata valutata per test del sudore, differenza di potenziale nasale (NPD), broncoscopia e lavaggio broncoalveolare, tutti negativi per fibrosi cistica. Questa diagnosi iniziale di FC ha influito negativamente sullo stato emotivo, occupazionale e finanziario della famiglia.
Questi casi illustrano le potenziali insidie dell’utilizzo dell’analisi genetica come unico criterio diagnostico della FC. La valutazione completa dovrebbe includere una valutazione clinica approfondita e la misurazione della funzione CFTR (mediante test del sudore o NPD) prima di effettuare la diagnosi ed improntare una terapia [85].
All’altro estremo ci sono pazienti con FC clinica ma senza mutazioni CFTR, nonostante il completo sequenziamento del gene [28]. La diagnosi di FC era basata sulle concentrazioni elevate di cloruro nel sudore in presenza di sintomi polmonari simil-FC ma la genetica CFTR e i risultati di NPD non hanno fornito evidenza di CFTR difettoso
24 e nessuna lesione molecolare è stata identificata. [86]. Presi insieme questi dati suggeriscono che fattori diversi dalla disfunzione CFTR possono causare un fenotipo non classico. Ulteriori studi su questi pazienti potrebbero rivelare ulteriori percorsi che contribuiscono ai fenotipi FC.
Differenza di potenziale nasale
L’alterato trasporto di ioni nei pazienti con FC a livello degli epiteli respiratori può essere studiato in vivo misurando la differenza di potenziale nella mucosa nasale [87]. Questo è un test significativamente più complesso rispetto alla misurazione degli elettroliti nel sudore. La misura dei potenziali transepiteliali della mucosa nasale consiste nel valutare la differenza di potenziale che si stabilisce tra un elettrodo posto sulla mucosa nasale ed uno sulla cute, attraverso un rilevatore di potenziale elettrico (voltmetro). Questa differenza di potenziale nasale (NPD), che è sempre a segno negativo, è fortemente dipendente dal movimento di ioni (cloro e sodio) che si ha a livello dell’epitelio nasale e quindi dal grado di funzionamento della proteina CFTR, che regola la massima parte dei movimenti di cloro e sodio. Il protocollo per NPD è ben descritto e standardizzato, ma viene eseguito solo in centri specializzati.48 I pazienti con FC hanno ridotto trasporto di cloro con iperassorbimento di sodio, misurata con una più negativa differenza di potenziale nasale. In condizioni normali NPD si aggira intorno ai -20 millivolt (mV), nella FC classica oscilla prevalentemente tra -40 e -60 mV. Oltre alla misura basale di NPD, altre misure vengono condotte dopo aver perfuso la mucosa con alcune sostanze in grado di modificare la NPD di partenza in dipendenza dal grado di funzionalità di CFTR: dapprima si perfonde con amiloride per vedere di quanto viene corretto il riassorbimento di base (di molto nella FC classica, perché in quaesta è molto aumentato il riassorbimento di base); poi con una soluzione priva di cloro, che nel normale stimola la secrezione di cloro attraverso CFTR (nessuna correzione o quasi in FC classica); poi con isoproterenolo, una sostanza che attiva il canale del cloro CFTR (nessuna attivazione o quasi in FC classica).
NPD può integrare il test del sudore e l’analisi delle mutazioni genetiche. Tuttavia, può anche produrre risultati indeterminati, particolarmente nei casi “borderline”.[88] La misura del NPD è tecnicamente difficoltosa e richiede una vasta esperienza per una corretta interpretazione [89].
La presenza di infiammazione nasale, come nella rinite allergica o nell’infezione virale, può alterare il trasporto degli ioni e dare risultati falsamente negativi [89]. Per i pazienti
25 nei quali sia il test del sudore sia l’analisi genetica non sono conclusivi, un’anormale differenza di potenziale nasale può essere utilizzata come prova della disfunzione del CFTR.
Test ausilari
Ci sono altri test in grado di predire della funzione CFTR, come la misura della corrente intestinale (ICM).Si tratta di misurare la corrente elettrica di corto circuito che si genera attraverso uno strato di mucosa intestinale. Anche questo test si basa sul trasporto di ioni e quindi sulla concentrazione di cloro e sodio a livello della superficie dell’epitelio intestinale (in gran parte dipendente dalla funzione della proteina-canale CFTR), che determina una differenza di potenziale rispetto agli strati profondi della parete. E’ questa differenza di potenziale che permette di misurare con sofisticati e miniaturizzati congegni un passaggio di corrente elettrica attraverso la parete dell’intestino. Purtroppo, questa misura, a differenza del NPD, non si può ottenere direttamente “in vivo” ma è ottenibile invece utilizzando un frammento di mucosa dell’ultima porzione del retto che viene montata viva (“ex vivo”) in uno speciale microstrumento chiamato “camera di Ussing”. In pratica si asporta con biopsia per suzione un frammento di mucosa rettale di 2-3 mm di diametro, lo si inserisce nella camera di Ussing e si fanno le misure elettriche usando diversi stimoli nei confronti del canale [90].
Un altro test in grado di valutare la funzione del CFTR è la stimolazione pancreatica per la secrezione di elettroliti del condotto pancreatico [90, 91]. Questi test sono disponibili solo in alcuni centri. È possibile raccogliere ulteriori informazioni cliniche utilizzando test per la valutazione dei seni paranasali (radiografia o TC), valutazione della funzione esocrina pancreatica (ad es. Elastasi fecale, analisi del grasso fecale in 3 giorni) e microbiologia del tratto respiratorio (espettorato o lavaggio bronco alveolare). Anche la valutazione uro-genitale (analisi dello sperma) può essere utile nella diagnosi di FC.
Test del sudore
L'associazione delle anomalie elettrolitiche del sudore con la fibrosi cistica fu stabilita durante l'ondata di caldo che nel 1948 colpì New York [2]. Nel 1956 Shwachman e Gahm usarono l'analisi dell'elettrolito del sudore per la diagnosi nella loro clinica, 90 ma solo nel 1959 Gibson e Cooke descrissero il loro metodo di raccolta del sudore basato sulla iontoforesi pilocarpinica ed esso fu accettato come test standardizzato [3]; da allora è rimasto il test diagnostico principale per malattia. Ci sono stati, da allora, progressi significativi nella comprensione dell'analisi dell'elettrolito del sudore come
26 misura della funzione del CFTR e perfezionamenti nell'uso del test del sudore per la diagnosi di CF.
Fisiologia della ghiandola sudoripara
Fig.6. CFTR nella Ghiandola sudoripara
La ghiandola sudoripara è composta da due diverse regioni: la spirale secretoria e il condotto riassorbibile [92]. Il sudore primario è contenuto nella spirale secretoria ed è isotonico con siero. Mentre le secrezioni isotoniche viaggiano dall'acino della ghiandola sudoripare attraverso il condotto impermeabile all'acqua, il sodio e il cloruro vengono assorbiti con conseguente sudore ipotonico. Il trasporto di sodio stabilisce la concentrazione di ioni e i gradienti di tensione che guidano l'assorbimento passivo di cloruro. Il cloruro viene trasportato dal lume del canale mediante CFTR e un distinto canale di cloruro attivato dal calcio (CaCC). Il sodio viene trasportato attraverso il canale epiteliale del sodio, l'ENaC, anch'esso sottoregolato dal CFTR attraverso un meccanismo che non è completamente compreso. Il trasporto degli elettroliti nel condotto della ghiandola e il trasporto dell'acqua sono mostrati nella Figura 4.
Le ghiandole sudoripare nei pazienti con FC non mostrano anomalie istologiche ma presentano anomalie pronunciate nell'omeostasi del cloruro di sodio a causa della funzione CFTR difettosa. L'assenza di CFTR funzionante infatti è responsabile dell’inibizione del riassorbimento del cloruro nel dotto secretore della ghiandola
27 sudoripara. Nonostante le vie per l'assorbimento del sodio, in assenza di un co-ione, anche il sodio viene scarsamente riassorbito. Le conseguenze di questo sono:
1) il sudore risultante ha una concentrazione relativamente elevata di cloruro e sodio rispetto al normale sudore
2) elevato rapporto cloro / sodio (> 1) è spesso visto nei pazienti CF rispetto alla popolazione normale
3) la differenza di potenziale transepiteliale tra il fluido extracellulare e il sudore all'apertura del dotto sudoriparo delle ghiandole di pazienti con CF è circa il doppio rispetto a quella presente nelle ghiandole sudoripare di pazienti sani [4, 93, 94].
I valori di cloruro e di sodio sono solitamente superiori a 60 mmol / L nei pazienti con CF e possono raggiungere anche i 120 mmol / L. Questo si confronta con i valori per soggetti normali che variano da 10-50 mmol / L.
Linee guida per l'esecuzione appropriata della procedura del test del sudore, che sono complementari l'una all'altra, sono state pubblicate da un certo numero di organizzazioni, tra cui:
1) il Comitato nazionale per gli standard clinici di laboratorio (NCCLS): test del sudore: raccolta dei campioni e analisi quantitativa;
2) Associazione dei biochimici clinici: linee guida del Regno Unito; e
3) Associazione australiana di biochimici clinici: le linee guida australiane per l'esecuzione del test del sudore per la diagnosi di CF [95, 16].
I test del sudore devono essere eseguiti in conformità con queste linee guida; le procedure alternative non sono più accettabili per la diagnosi di CF.
La raccolta del sudore oggi può essere eseguita con 2 diversi metodi: – metodo Gibson-Cooke
– metodo conduttivimetrico (o Wescor)
In entrambi, il test del sudore ha generalmente tre parti tecniche: stimolazione del sudore, raccolta e analisi [68]. L'analisi del sudore viene quindi seguita dall'interpretazione dei risultati.
Stimolazione del sudore
Il sito preferito per la raccolta del sudore è la superficie flessoria dell'avambraccio [16, 96]. Altri siti utilizzati con successo includono la parte superiore del braccio, la coscia e il polpaccio. La sudorazione localizzata è prodotta dalla iontoforesi del farmaco colinergico, nitrato di pilocarpina, nella zona selezionata della pelle.11 Si consiglia la somministrazione di soluzioni acquose o dischi di gel di Wescor contenenti nitrato di
28 pilocarpina a 2-5 g / L a livello dell'elettrodo positivo. [96, 16] L'elettrodo negativo può contenere una soluzione elettrolitica diluita uguale o alternativa (ad es. Solfato di magnesio o solfato di potassio) .13 Gli elettrodi utilizzati sono solitsmente in rame o in acciaio inossidabile. Viene applicata una corrente di 0,5 mA e viene aumentata gradualmente fino a un massimo di 4 mA [16]. Con la corrente applicata gli ioni di pilocarpina caricati positivamente si allontanano dall'elettrodo positivo e penetrano nella pelle dove aumentano la concentrazione di calcio intracellulare e stimolano la produzione di sudore aprendo il canale di cloruro attivato dal calcio [16]. Il volume di sudore prodotto in risposta agli agonisti muscarinici non è alterato nella FC, consentendo un'adeguata raccolta dello stesso per l'analisi biochimica. Una volta raggiunti i 4 mA, la corrente deve essere applicata per non più di 5 minuti [16]. Gli elettrodi vengono quindi rimossi e la pelle viene pulita con acqua distillata.
La possibilità di orticaria o ustioni sulla pelle del paziente dopo ionoforesi è rara (<1%) [68]. Può verificarsi un'ustione della pelle se la corrente è superiore a 4 mA, se il metallo nudo dell'elettrodo tocca la pelle, se l'interfaccia del reagente non è sufficientemente umida o se l'elettrodo è danneggiato o ossidato [16]. L'orticaria localizzata può verificarsi se il paziente ha una reazione alla pilocarpina o al fenomeno della stimolazione elettrica [68]. In entrambe le circostanze, il sudore non deve essere raccolto sul sito interessato [16, 68].
Raccolta del sudore
Immediatamente dopo la stimolazione, una garza pre-pesata/carta da filtro o un dispositivo di raccolta Wescor viene posta direttamente sul sito dell'elettrodo positivo. Le questioni critiche relative alla raccolta di sudore includono l'evitare l'evaporazione o la contaminazione del campione e la garanzia di un'adeguata percentuale di sudore. Alla fine della raccolta, la garza / filtro o il collettore Wescor vengono rimossi e il peso o il volume vengono determinati rispettivamente.
Per garantire risultati accurati è necessaria una velocità minima di 1 g / m2 / min. Poiché la velocità del sudore è correlata alla concentrazione di elettrolita nel sudore, è necessario un peso / volume minimo accettabile.
Il peso / volume minimo accettabile può essere calcolato utilizzando la formula mostrata nella Figura 7.
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Fig 7. Calcolo del peso accettabile di campione
Se il laboratorio utilizza una garza da 2x2 pollici o una carta da filtro, il peso minimo del sudore dovrebbe essere di 75 mg raccolti in 30 minuti [16].
Utilizzando il sistema Macroduct, gli elettrodi e l'area di stimolazione sono più piccoli e il campione minimo accettabile è 15 μL raccolti in 30 minuti [68]. Pertanto, il volume / peso minimo accettabile del sudore dipende dalle dimensioni dell'elettrodo utilizzato, dal tipo e dalla dimensione del materiale di raccolta utilizzato e dalla durata della raccolta del sudore [97].
Il sistema Nanoduct prevede la determinazione diretta, nel sito di stimolazione, della concentrazione di equivalenti di NaCl (concentrazione molecolare di cloruro di sodio) nel sudore.
Il tempo di raccolta del sudore non deve essere più di 30 minuti e non meno di 20 minuti [68]. I campioni non sufficienti non devono essere analizzati e l'intero test deve essere ripetuto.
Le Linee Guida Internazionali a tutt’oggi classificano i metodi sopra elencati nel seguente modo:
– Il metodo Gibson-Cooke è validato come TEST DI CONFERMA, intendendo per test di conferma un test quantitativo che tiene conto della quantità di sudore raccolto e in cui viene determinata la concentrazione di ioni cloro (o cloro + sodio) nel sudore
– Il metodo conduttimetrico o Wescor è validato come TEST DI SCREENING, intendendo per test di screening un test qualitativo che può o non può tenere conto della quantità di sudore raccolto. Le Linee Guida americane definiscono questo metodo di misura come ‘misura non selettiva’ degli ioni presenti nel sudore, in quanto la conduttività di una soluzione dipende dalla concentrazione e dalla mobilità di tutti gli ioni presenti. La misura della conduttività nel sudore, proseguono le Linee Guida americane, non è equivalente alla misura della concentrazione degli ioni cloro (metodo Gibson-Cooke) perché è influenzata dalla presenza di altri ioni. Questo metodo in definitiva è stato approvato dalla Cystic Fibrosis Foundation solo al di fuori dei Centri di Cura per la
30 Fibrosi Cistica accreditati. Infine i risultati dubbi o positivi devono essere confermati con un test di conferma.
Analisi del sudore
L'analisi del sudore può essere eseguita in due modi:
• metodi indiretti basati sulle proprietà chimico-fisiche colligative di ioni o soluti nel sudore quali conduttività e osmolarità;
• la misurazione diretta degli elettroliti cloruro e sodio. 1. Misura indiretta
Per motivi teorici ci si può aspettare che l'osmolarità e la misura della conduttività forniscano un'ottima discriminazione tra le concentrazioni di elettroliti nel sudore normale e in quello CF. Sodio, potassio e cloruro, i costituenti elettrolitici predominanti del sudore, sono tutti aumentati in CF e il contributo incrementale di ciascuno sarebbe additivo in virtù della natura colligativa della misurazione [98]. Il contributo di altri soluti ed elettroliti presenti nel sudore, in concentrazione variabile e non specificamente aumentata in CF, diminuirebbe in modo prevedibile il potere discriminante di queste misurazioni indirette[98].
A. Osmolalità
L'osmolalità del sudore riflette la concentrazione totale di soluto del sudore che misura i cationi e gli anioni totali insieme ad altri soluti come l'urea e gli amminoacidi.[67] Quindi l'osmolalità ha una scarsa capacità discriminatoria rispetto al cloruro nella distinzione tra pazienti affetti da CF e individui normali e come tale non è raccomandato per l'analisi del sudore per la diagnosi di CF[98].
B. Conduttività
La US CF Foundation ha approvato l'uso del Wescor Macroduct Sweat Chek per misurare la conduttività come test di screening. Quando si valutano i risultati della conduttività del sudore, i medici devono essere consapevoli che la conduttività del sudore è di circa 15 mmol / L superiore rispetto al cloruro nel sudore a causa della presenza di anioni non misurati come il lattato e il bicarbonato [68, 98]. Secondo la US CF Foundation, la conduttività del sudore ≥50 mmol / L deve essere indirizzata a un centro di cura CF accreditato per la misurazione del cloruro di sudore mediante ionoforesi pilocarpina quantitativa. [68, 97, 98]
Recentemente, un nuovo analizzatore di conducibilità, il sistema Nanoduct ("nuovo sistema") è stato sviluppato per l'uso soprattutto nella popolazione neonatale in quanto richiede solo 3 μL di sudore [99]. Tuttavia, l'accuratezza del nuovo sistema rispetto al test
31 del sudore che valuta l’effettiva quantità di cloro nella discriminazione tra CF e individui normali deve ancora essere studiata. Ad oggi le attuali linee guida internazionali pubblicate non supportano l'uso della conduttività come test di conferma [99].
2. Misura diretta A. Cloruro
Il cloruro nel sudore è l'analita più direttamente correlato alla funzione anormale del CFTR e mostra una maggiore discriminazione rispetto al sodio. Le tecniche di misurazione accettabili per misurare il cloruro sono colorimetria, coulometria o elettrodo iono selettivo.
B. Sodio
Le tecniche di misurazione accettabili per misurare il sodio sono la fotometria a fiamma, la spettrofotometria ad assorbimento atomico o l'elettrodo ionico selettivo. Il sodio nel sudore è elevato nella FC ma è meno discriminante rispetto al cloruro per la diagnosi e quindi non dovrebbe essere usato da solo per la diagnosi di CF [68].
Interpretazione dei risultati
La concentrazione di cloruro nel sudore deve essere interpretata in relazione alla presentazione clinica del paziente, alla storia familiare, all'età e alla consapevolezza che alcune mutazioni del gene CFTR sono associate a una concentrazione di cloruro di sudore borderline o negativo.
Intervalli di riferimento
Gli intervalli di riferimento del cloruro nel sudore che sono attualmente accettati per la diagnosi di CF sono:
• <29 mmol /L: negativo / normale;
• 30-59 mmol/L: borderline (potrebbe essere CF); • >60 mmol / L positivo per CF.
Sembra esserci un normale aumento dei valori di elettroliti nel sudore dall'infanzia all'età adulta e anche se rari sono stati descritti casi di adulti sani con concentrazioni di cloruro di sudore superiori a 60 mmol / L. [68] Quindi occorre cautela nell'interpretazione dei risultati del test del sudore nei pazienti più anziani.
Sebbene la stragrande maggioranza dei pazienti con FC abbia elevate concentrazioni di cloruro di sudore, ci sono molte segnalazioni di pazienti con sintomi clinici indicativi di FC ma con valori di elettroliti normali o al limite. Questi pazienti mantengono spesso la sufficienza pancreatica e hanno uno stato nutrizionale normale, dotti deferenti assenti nei
32 maschi e diagnosi di FC in età avanzata [16, 55]. Alcune mutazioni sono state trovate associate ad un test del sudore "normale".
Anche valori borderline di cloruro nel sudore possono rappresentare un dilemma diagnostico. Va notato che durante l'infanzia, un cloruro di sudore di 30 mmol / L o maggiore ha una bassa probabilità di essere un vero normale e un livello di cloruro nel sudore tra 30-59 mmol / L è probabile che sia diagnostico per CF 21. Pertanto, i bambini con valori di cloruro del sudore borderline necessitano di follow-up, ripetizione del test del sudore e analisi estesa della mutazione CFTR.22
Correlazione elettroliti nel sudore-genotipo-fenotipo
La correlazione tra elettroliti del sudore e genotipo fu inizialmente esplorata da Witt e colleghi.104 Successivamente, con una migliore classificazione delle varie mutazioni geniche, i valori di cloruro nel sudore furono correlati ad alcuni gruppi di mutazioni [100]. Non sono state trovate differenze nei valori di di cloro nel sudore tra pazienti portatori di mutazioni di classe I, di classe II, classe III. L'unica differenza statistica è stata verificata nelle mutazioni di classe IV e V, che avevano un livello medio di cloruro di sudore significativamente più basso di quello dei pazienti omozigoti per ΔF508 e più vicino alla norma rispetto a quello della classe I, II e III.
Alcune mutazioni associate agli elettroliti del sudore normale o borderline sono R117H, D1152H, A455E, G551S e 2789+ 5G. [100]
Un fenotipo interessante, che presenta un'elevata concentrazione di cloruro di sudore in assenza di altri sintomi CF, è stato descritto in un paziente con una mutazione non senso, S1455X. Sulla valutazione clinica dettagliata, questo paziente aveva una normale funzionalità polmonare, una normale flora batterica all’esame dell’espettorato, nessuna manifestazione di malattia pancreatica esocrina e l'IRT sierica non indicativa di CF. I trascritti di mRNA CFTR recanti la mutazione S1455X erano normalmente elaborati e funzionali, il che suggerisce quindi che l'amminoacido C-terminale troncato gioca un ruolo importante solo a livello delle ghiandole sudoripare.
Insidie nell'analisi del sudore
La maggior parte degli errori relativi ai test del sudore sono causati dall'uso di metodologia inaffidabile, inadeguata raccolta di sudore, errori tecnici e, occasionalmente, errata interpretazione dei risultati. Gli aspetti tecnici dell'esecuzione di un test del sudore sono impegnativi e questi errori si verificano più spesso in laboratori che fanno relativamente pochi test, di solito non conformi alle linee guida pubblicate [68].
