Moterų, kurioms nėštumo metu nustatytas GD, ištyrimas

Gyvenimo ir šeimyninės anamnezės anketa (anamnezės klausimynas – 9 priedas): apimanti gimimo datą, akušerinę anamnezę, vaikų gimimo ūgių ir svorių informacijas, pacientės ligų bei šeimyninę anamnezę.

Mitybos įpročių, fizinio aktyvumo anketavimas, socialinio statuso verti-nimas (Pagrindinis klausimynas – 10 priedas).

CD rizikos klausimynas – Lietuvoje validizuota anketa FINDRISK (11 priedas). Savo tyrime naudojome atnaujintą FINDRISK klausimyną, kuris parengtas 2001 m. Klausimynas padeda įvertinti CD išsivystymo riziką per ateinančius 10 metų. Pagal balų sumą tiriamasis gali būti priskir-tas vienai iš 5 rizikos grupių: maža rizika, šiek tiek padidėjusi rizika, vidu-tinė rizika, didelė rizika, labai didelė rizika.

3.5.1.2. Objektyvus tyrimas

Ūgis matuotas Harpender stadiometru.

Svoris – tiriamieji pasverti be viršutinių rūbų elektroninėmis

kalibruo-tomis svarstyklėmis.

Juosmens apimtis matuota centimetrine juostele vidurinėje dalyje tarp

paskutinio palpuojamo šonkaulio apatinio krašto ir klubakaulio skiauterės [18].

Klubų apimtis centimetrine juostele per plačiausią vietą sėdmenų srityje

[18].

Juosmens-klubų (JKS) apimties santykis apskaičiuotas:

JKS (cm) = juosmens apimtis (cm) / klubų apimtis (cm) [18].

Kūno masės indeksas apskaičiuotas pagal standartinę formulę:

KMI = svoris (kg) / ūgis (m)².

KMI klasifikacija atlikta remiantis PSO rekomendacijomis, nurodyta 3.5.1.2.1 lentelėje.

AKS matuotas kairėje rankoje, 2 mm Hg tikslumu aneroidiniu

sfigmo-manometru netiesioginiu auskultaciniu Korotkovo būdu. AKS vertintas ra-mybės būsenoje 2 kartus 5 minučių intervalu, praėjus bent 10 min po atsisė-dimo. Manžetė uždėta ant žasto taip, kad jos apatinis kraštas būtų 2 cm virš alkūnės įlinkio. Vertinant AKS, buvo apskaičiuota vidutinė dviejų matavi-mų reikšmė.

3.5.1.2.1 lentelė. Kūno masės klasifikacija pagal KMI remiantis PSO

reko-mendacijomis [20]

Klasifikacija KMI (kg/m²)

Nepakankama kūno masė < 18,5

Normali kūno masė 18,50–24,99

Antsvoris 25,00–29,99

Nutukimas ≥ 30,00

I klasės nutukimas 30,00–34,99

II klasės nutukimas 35,00–39,99

III klasės nutukimas ≥ 40,00

Širdies susitraukimų dažnis (ŠSD) matuotas ramybės būsenoje

tiria-majai sėdint, kairiosios rankos riešo srityje. Suaugusio žmogaus (≥ 18 metų) normalus pulsas ramybės būsenoje laikomas nuo 60 iki 100 tvinksnių per minutę. Mažiau 60 k/min laikyta bradikardija, daugiau 100 k./min. – tachi-kardija. 15–18 m. amžiaus vaikų normalus ŠSD laikomas toks pats kaip ir suaugusiųjų (60–100 k/min.) [110].

Visoms tiriamosioms įvertinti MS komponentų paplitimai pagal NCEP/ATPIII ir TDF rekomendacijas (3.5.1.2.2 lentelė).

3.5.1.2.2 lentelė. MS kriterijai, remiantis Nacionalinės cholesterolio švietimo

programos ekspertų III leidimo (NCEP/ATPIII) ir Tarptautinės diabeto federacijos (TDF) rekomendacijomis [129].

NCEP/ATPIII TDF

Juosmens

apimtis ^{Moterims ≥ 88 cm,} vyrams ≥ 102 cm ^{Centrinis nutukimas (juosmens} apimtis europietėms moterims ≥ 80 cm, europiečiams vyrams ≥ 94 cm) arba KMI > 30 kg/m² Plazmos Tg ≥ 1,7 mmol/l

ar gaunamas specifinis gydymas ^{≥ 1,7 mmol/l} ar gaunamas specifinis gydymas DTCh

koncentracija ^{< 1,29 mmol/l moterims} < 1,03 mmol/l vyrams ar gaunamas specifinis gydymas

< 1,29 mmol/l moterims < 1,03 mmol/l vyrams

ar gaunamas specifinis gydymas AKS Sistolinis AKS ≥ 130 mm Hg

arba diastolinis AKS ≥ 85 mm Hg ar gaunamas specifinis gydymas

Sistolinis AKS ≥ 130 mm Hg arba diastolinis AKS ≥ 85 mm Hg ar gaunamas specifinis gydymas Plazmos

gliukozės koncentracija

≥ 5,6 mmol/l

ar ankčiau diagnozuotas 2 tipo CD ^{≥ 5,6 mmol/l} ar ankčiau diagnozuotas 2 tipo CD

MS yra nustatomas jei yra 3 ar

daugiau sekančių požymių ^{MS yra nustatomas remiantis} juosmens kriterijumi bei esant 2 kitiems nurodytiems kriterijams

3.5.1.3. Laboratoriniai tyrimai

Veninio kraujo ėminiai gauti punktavus dilbio veną. Tyrimai imti ryte, nuo 8 iki 10 val. Atskirtas serumas užšaldytas −70 °C. Tyrimai atlikti LSMU KK Centrinėje ir radioimuninių tyrimų laboratorijose. Dalis tyrimų atlikti etapiškai, tačiau naudoti tokie patys reagentų rinkiniai.

Glikemija, GTM

Paimtas kraujas (viso 3 ml) iš periferinės venos per 1 valandą pristatytas į laboratoriją necentrifuguotas. Tiriamosioms, nesergančioms CD, atliktas GTM su 75 g gliukoze. Sergančioms CD – ištirta glikemija nevalgius veni-nėje plazmoje.

Standartinis GTM atliktas ryte, nevalgius 8–14 val: 75 g gliukozės iš-tirpinta 250–300 ml vandenyje. Glikemija ir insulino koncentracija tiriama nevalgius ir praėjus 2 val. po 75 g gliukozės suvartojimo.

GTM vertinimas nurodytas 3.5.1.3.1 lentelėje [19].

3.5.1.3.1 lentelė. Gliukozės tolerancijos mėginio vertinimo kriterijai

AV apykaita ^{Glikemija (mmol/l)}

Nevalgius 2 val po 75 g gliukozės

Normali < 6,1 < 7,8

SGN 6,1–6,9 < 7,8

GTS < 7,0 ≥ 7,8 ir < 11,1

CD ≥ 7,0 ≥ 11,1

Insulinas

Kraujas insulino nustatymui (iš viso 3 ml) nucentrifuguotas po 30 min. 4000 aps./min. greičiu 10 min., atskirtas kraujo serumas ir po 0,5–1,0 ml užšaldytas atskiruose Eppendorf tipo mėgintuvėliuose –70 °C. Insulinas tir-tas imunoradiometriniu (IRMA) metodu (analitinis jautrumas ≤ 1,00 uIU/mL (mU/L±SN 2), funkcinis: ≤4,0 μIU/ml, naudojant „DiaSource“ rinkinį, Belgija. Insulino tyrimo normos pagal reagentų gamintojų rekomen-dacijas 4–16 mU/l. Nustatymo ribos: ≤ 5,0 – ≥ 250,0 μIU/ml.

C-peptidas

Kraujas C-peptido nustatymui (iš viso 3 ml) nucentrifuguotas po 30min. 4000 aps./min. greičiu 10 min., atskirtas kraujo serumas ir po 0,5–1,0 ml užšaldytas atskiruose Eppendorf tipo mėgintuvėliuose –70 °C. Tyrimo at-likimo metodas: IRMA. Žymės tipas: I125 žymėti monokloniniai anti-C-pep-tido antikūnai. Jautrumas: analitinis: ≤ 0,006 ng/ml; funkcinis: ≤ 1,0 ng/ml.

Specifiškumas: l. aukšto specifiškumo fiziologinėse ir aukštesnėse koncent-racijose; privalo nebūti kryžminės reakcijos su insulinu ir proinsulinu arba kryžminė reakcija kuo mažesnio aktyvumo (proc.). Preciziškumas: rinkinio viduje: ≤ 5,0 proc.; tarp rinkinių: ≤ 6,0 proc..

Nustatymo ribos: ≤ 0,25 – ≥ 30,0 ng/ml.

HOMA indeksas

HOMA-IR (angl. The homeostatic model assessment) yra skaičiuojamas standartine formule atsparumo insulinui nustatymui [220]:

HOMA-IR = [insulino koncentracija nevagius (μU/ml) × gliukozes kon-centracija nevalgius (mmol/l)]/22,5.

Lipidograma

Lipidogramos atlikimui kraujas (viso 7 ml) paimtas iš periferinės venos necentrifuguotas per 1 val. pristatytas į laboratoriją. Lipidų koncentracijos normos pateikiamos 3.5.1.3.2 lentelėje. Dislipidemija nustatyta, jei bent vienas lipidų apykaitos rodiklis neatitiko normos ribų.

3.5.1.3.2 lentelė. Lipidų koncentracijos normos rodikliai

Rodiklis Norma (mmol/l)

Bendras cholesterolis (BCh) 0–5,2

Mažo tankio lipoproteinų cholesterolis (MTCh) 0–2,59 Didelio tankio lipoproteinų cholesterolis (DTCh) ≥ 1,55

Trigliceridai (Tg) 0–1,95

Aterogeniškumo koeficientas (AK) 0–3,5

Adipocitokinai

Kraujas inkretinų nustatymui nucentrifuguotas po 30 min. 4000 aps./min. greičiu 10 min., atskirtas kraujo serumas ir po 0,5–1,0 ml užšaldytas atski-ruose Eppendorf tipo mėgintuvėliuose –70 °C. Prieš tiriant užšaldytas krau-jo serumas atšildytas kambario temperatūroje, sumaišytas.

Adiponektino nustatymo metodas: radioimuninis (RIA). Žymės tipas:

I¹²⁵ žymėtas adiponektinas. Jautrumas: analitinis: ≤ 1,0 ng/ml; funkcinis: ≤ 3,0 ng/ml. Specifiškumas: l.aukšto specifiškumo fiziologinėse ir aukštes-nėse koncentracijose; privalo nebūti kryžminės reakcijos su kitomis pana-šios stuktūros medžiagomis (pvz., C1q) arba kryžminė reakcija kuo mažesnio aktyvumo (proc.). Preciziškumas: rinkinio viduje: ≤ 6,0 proc.; tarp rinkinių: ≤ 10,0 proc. Nustatymo ribos: ≤ 0,80 – ≥ 200,0 ng/ml.

Leptino nustatymo metodas: RIA. Žymės tipas: I125 žymėtas leptinas. Jautrumas: analitinis: ≤ 0,10 ng/ml; funkcinis: ≤ 0,50 ng/ml. Specifiškumas: l.aukšto specifiškumo fiziologinėse ir aukštesnėse koncentracijose; privalo

nebūti kryžminės reakcijos su kitomis panašios stuktūros medžiagomis arba

kryžminė reakcija kuo mažesnio aktyvumo (proc.). Preciziškumas: rinkinio viduje: ≤ 4,5 proc.; tarp rinkinių: ≤ 5,5 proc. Nustatymo ribos: ≤1,0 – ≥60,0 ng/ml.

Inkretinai

GLP-1 (aktyvus) – ELISA reagentų rinkinys, skirtas kiekybiškai

nusta-tyti GLP-1(7-36) ir GLP-1 (7-37) žmogaus plazmoje. Standartinė kreivė su-daryta iš 8 taškų (0–80 pmol/L). Standartinių taškų sudarymui naudojamas skiedžiamas standartas, tiekiamas su rinkiniu. Tiekiamo standarto koncent-racija 160 pg/ml. Tyrimo jautrumas – 0,10 pmol/L. Optinio tankio nuskai-tymui naudojama 450 nm bangos ilgis. Automatizacija „Gemini“ ELISA tyrimų analizatoriumi. ELISA (96 tyrimai)

GIP (aktyvus) – ELISA reagentų rinkinys, skirtas kiekybiškai nustatyti

GIP (1-42) žmogaus plazmoje. Standartinė kreivė sudaryta iš 8 taškų (0–20 pmol/L). Standartinių taškų sudarymui naudojamas skiedžiamas standartas, tiekiamas su rinkiniu. Tiekiamo standarto koncentracija 200 pg/ml. Tyrimo jautrumas – 1,2 pg/mL. Optinio tankio nuskaitymui naudojama 450 nm ban-gos ilgis. Automatizacija „Gemini“ ELISA tyrimų analizatoriumi.

Inkretinų tyrimai atlikti dviem etapais (tokiais pačiais reagentų rinki-niais). Ištyrus kraują pirmaisiais inkretinų tyrimo reagentais ir nustačius labai aukštas ar žemas reikšmes, tyrimas atliktas pakartotinai – reikšmės skyrėsi neženkliai (galimos paklaidos ribose).

3.5.1.4. DNR išskyrimas ir genotipavimo analizė

Tyrimo dalyviams buvo išskirta DNR, vėliau ištirti 5 TCF7L2 VNP ir įvertintos jų galimai patologinės reikšmės. TCF7L2 reikšmės palygintos su bendrosios populiacijos moterų VNP paplitimais.

Genominė DNR buvo išskirta iš tyrimo objekto, 0,2 ml periferinio ve-ninio kraujo, naudojant PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Uni-ted States) DNR išskyrimo rinkinį. Išskirtos DNR kokybiniai ir kiekybiniai parametrai buvo vertinami naudojant ultravioletiniuose spinduliuose ma-tomą spektrofotometrą (NanoDrop, United States). DNR mėginiai laikyti −20 °C temperatūroje iki panaudojimo analizei.

Analizėje buvo tiriamas TCF7L2 (T-cell specific, HMG-box) introno po-limorfizmas T > C (rs7901695), C > T (rs7903146), G > A (rs7895340),

G > C (rs11196205) ir G > T (rs12255372). Pradmenų sekos yra nurodytos 3.5.1.4.1 lentelėje. VNP buvo genotipuojami naudojant gamintojo sukurtus TaqMan pradmenis (Life Technologies, United States) su TaqMan Univer-sal PCR Master Mix, No UNG (Life Technologies, United States) ir 1– 20 ng šulinėliui DNR mėginio. Amplifikacija buvo vykdoma naudojant ABI 7500 fast Real-Time PCR sistemą (Applied Biosystem). Universali polime-razės grandininės reakcijos mikstūra ir amplifikacijos nustatymai yra pa-teikti 3.5.1.4.2 ir 3.5.1.4.3 lentelėse. Programinis genotipo priskyrimas buvo patvirtinamas tikrinant vizualiniu būdu su SDS 2.0.5 programa, suderinta su TaqMan® sistema. Po pirminio genotipavimo, 5 proc. iš visų mėginių kiek-vienoje grupėje buvo atlikta pakartotinė analizė, kuri parodė 100 proc. Ati-tikimą. Abejotini mėginiai buvo analizuojami tris kartus.

3.5.1.4.1 lentelė. Pradmenų sekos

Sekos numeris (rs) Seka

rs7901695 CATATAAATGGTATCATAAAATCTA[C/T] GGGCTTTTGTGTCTGTCTGCTTTCA rs7903146 TAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGATA[C/T] TATATAATTTAATTGCCGTATGAGG rs7895340 CAGTTCTAGACACCTAGAGAGTAAA[A/G] TGAAGAAGCCTGTTTTCAGGTTTCC rs11196205 GAAAGTTCTCAACATTTATAACTAC[C/G] AGCAGTATGTAAGAGAGTTATGGTT rs12255372 TGCCCAGGAATATCCAGGCAAGAAT[G/T] ACCATATTCTGATAATTACTCAGGC

3.5.1.4.2 lentelė. Amplifikacijos reagentų tūris 1 reakcijai.

Reakcijų komponentai Tūris 1 reakcijai

TaqMan Universal PCR Master mix, No UNG 12,5 µl

20x TaqMan Assay 1,25 µl

DNR 11,25 µl

3.5.1.4.1 lentelė.Amplifikacijos reakcijos nustatymai

Žingsnis ^VNP

Temp. Trukmė Ciklai

Aktyvacija 95 °C 10 min Laikymas

Denaturacija 95 °C 15 s 40