TSC1/2
:il complesso TSC è generalmente considerato come un eterodimero, costituito da TSC1 (detto anche hamartin) e TSC2 (detto anche tuberina) (A.R. Tee, D.C. Fingar et al. 2002)126. Recenti studi hanno rivelato anche una terza subunità del complesso TSC, detta TBC1D7 (tre2-bub2-cdc16 dominio familiare c1, membro 7) (C.C. Dibble, W. Elis et al. 2012)127. Sotto stimolazione fisiologica innescata da amminoacidi, fattori della crescita, stress, ossigeno, TSC2 è fosforilata a monte da varie chinasi, Akt compresa, (K. Inoki, Y. Li et al. 2002)128, ERK (L. Ma, Z. Chen et al. 2005)129 oppure RSK (P.P. Roux, B.A. Ballif et al. 2004)130, per rilasciare la sua inibizione come un GAP per il Rheb (ras omologo arricchito nel cervello) GTPasi e, per convertire Rheb nella sua forma attiva per l’attivazione dell’mTORC. Nel frattempo, la fosforilazione Akt-mediata di TSC2 comporta anche la dissociazione del complesso TSC dai lisosomi e la conseguente attivazione di mTORC1 (S. Menon, C.C. Dibble et al. 2014)131. D’altra parte, AMPK (chinasi) può fosforilare TSC2, determinando la
soppressione di mTORC1 in condizioni di privazioni energetiche (K. Inoki, T. Zhu et al. 2003 )132. Oltre alla fosforilazione-mediata dall’attivazione di mTORC1, uno
studio recente condotto dal gruppo Sabatini, ha rilevato un meccanismo di attivazione dell’mTORC1 indotto da un aminoacido e Rag-dipendente (R. Zoncu, L. Bar-Peled et al. 2011)133. In particolare le variazioni dei livelli di aminoacidi lisosomiali possono guidare le proteine Rag nel rilascio del complesso TSC1/2 dai lisosomi, nonché reclutare mTORC1 sulla superficie lisosomiale e determinarne l’attivazione (C. Demetriades, N. Doumpas et al. 2014)134. In particolare, la sclerosi tuberosa è una patologia genetica autosomica dominante, definita da mutazioni del TSC1 o TSC2 ed è caratterizzata dalla formazione di amartomi nel cervello, sulla pelle, nei reni, nei
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polmoni, sugli occhi ed a livello cardiaco. Patologicamente, la perdita di eterozigosi del gene del TSC1 o TSC2 è stata riscontrata in molti pazienti affetti da TSC ed è stato osservato che ciò rappresenta un punto di forza per la malattia (J. Jozwiak, S. Jozwiak et al. 2008 )135. Tuttavia, non è stata identificata alcuna mutazione del TSC1 o TSC2, evidenziando un possibile ruolo soppressore per TSC1 o TSC2 nel tumore. Il fenotipo dei topi TSC1/2KO sono riassunti nella tabella 3.
Figura 11: tabella 3
In particolare, più modelli murini supportano chiaramente l’idea che sia TSC1 che TSC2 abbiano la funzione di soppressori tumorali. In particolare i topi 𝑇𝑆𝐶1−/−
muoiono intorno a E10.5-11.5, a causa di alterazioni a livello del tubo neurale, mentre il 64% dei topi 𝑇𝑆𝐶1+/− sviluppano tumori renali ed il 71% dei topi TSC1+/− sviluppano emangiomi epatici (T. Kobayashi, O. Minowa et al. 2011 )136. In aggiunta, i topi 𝑇𝑆𝐶2−/− muoiono di aplasia epatica in E9.5-12.5, mentre i topi 𝑇𝑆𝐶2+/− mostrano il 100% di incidenza di tumori multipli renali bilaterali, il 50% di incidenza di emangiomi epatici ed un’incidenza del 32% di adenomi polmonari (H. Onda, A. Luecket al. 1999)137. Un altro studio indipendente ha osservato i topi 𝑇𝑆𝐶1+/− in
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diversi backgrounds genetici ed ha riportato che il 95% dei topi 𝑇𝑆𝐶1+/−𝐶3𝐻 sviluppa tumori renali macroscopicamente visibili, mentre l’80% dei topi TSC1+/−
mostrano carcinomi a cellule renali all’età di 15-18 mesi (C. Wilson, S. Idziaszczyk et al. 2005)138. Inoltre, le lesioni tumorali extrarenali nel fegato, milza ed utero sono stati osservati in entrambi i topi C3H e Balb/c. Presi questi modelli murini sostengono fortemente che TSC2 e TSC1 abbiano un ruolo fisiologico come soppressori tumorali. Per aggirare il problema della letalità embrionale per i topi TSC1/2 omozigoti, sono stati sviluppati un serie di modelli di topo KO condizionali. In particolare, i topi TSC1 KO sviluppano neoplasia intraepiteliale all’età di 6 mesi, che può svilupparsi anche in carcinoma all’età di 16-22 mesi (R.D. Kladney, R.D. Cardiff et al. 2010)139.
In un altro studio, dei topi TSC1 KO fegato-specifico manifestano un carcinoma epatocellulare sporadico accompagnato dall’infiammazione del fegato, necrosi e rigenerazione. Considerando che in base alla disponibilità dei nutrienti il TSC1 regola l’attivazione di mTORC1, questo modello ci consente di comprendere che l’attivazione di mTORC1 potrebbe essere il ponte tra dieta e cancro. Inoltre, è stato introdotto recentemente un sistema di eliminazione inducibile TSC1, introducendo nei topi cellule tumorali mammarie primarie (𝑇𝑠𝑐1𝑓𝑙/𝑓𝑙/𝑀𝑀𝑇𝑉 − 𝑃𝑦𝑀𝑡), che dimostra che la delezione di TSC1 promuove la crescita delle cellule cancerose del seno, in vivo (Y. Chen, H. Wei et al. 2014)140. È stato creato inoltre un altro gruppo di fenotipi
cancerosi di confronto, ossia topi 𝑇𝑠𝑐1𝑓𝑙/𝑓𝑙/𝑃𝑡𝑒𝑛𝑓𝑙/𝑓𝑙/𝐴𝑙𝑏𝐶𝑟𝑒 con topi 𝑇𝑠𝑐1𝑓𝑙/𝑓𝑙/ 𝐴𝑙𝑏𝐶𝑟𝑒oppure topi 𝑃𝑡𝑒𝑛𝑓𝑙/𝑓𝑙/𝐴𝑙𝑏𝐶𝑟𝑒. In particolare, i topi 𝑇𝑠𝑐1𝑓𝑙/𝑓𝑙/𝑃𝑡𝑒𝑛𝑓𝑙/𝑓𝑙/ 𝐴𝑙𝑏𝐶𝑟𝑒 sviluppano tumori al fegato più rapidamente ed in misura maggiore rispetto agli altri ceppi, che indica che la perdita di TSC1 e Pten può lavorare sinergicamente per promuovere la tumorogenesi ( H.L. Kenerson, M.M. Yeh et al. 2013)141. D’altra parte, il ruolo di soppressore tumorale TSC2 è supportato dal rapporto che i topi 𝑇𝑆𝐶2−/−uterini-specifici sviluppano leiomiomi uterini all’età di 3 mesi e la
proliferazione del miometrio all’età di 6 mesi (H. Prizant, A. Sen et al. 2013)142.
Tuttavia, rispetto ai topi 𝑃𝑡𝑒𝑛+/−, i topi 𝑃𝑡𝑒𝑛+/−/𝑇𝑆𝐶2+/− non mostrano alcun vantaggio nello sviluppo del adenocarcinoma prostatico, né ne facilitano la progressione (J. Blando, M. Portis et al. 2009)143. Questo suggerisce che TSC2 potrebbe esercitare la sua funzione come oncosoppressore, funzionando in maniera differenziale rispetto a TSC1, garantendo ulteriori indagini per il meccanismo di base.
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Rheb
:dopo aver stabilito TSC1/2 a monte come regolatore negativo della mTORC1, gli studi successivi, per determinare il legame molecolare tra il complesso TSC e il complesso mTORC1, hanno consentito di identificare il Rheb, una piccola GTPasi144,145,146. Rheb è un membro della superfamiglia Ras di GTP-legante proteine, che è presente in due isoforme (Rheb1 e Rheb2), localizzate sul sistema di endomembrane. Tuttavia, solo il lisosoma membrana associato al Rheb ha dimostrato di possedere capacità attivanti. Modelli murini Rheb KO sono stati stabiliti ed hanno consentito di dimostrare principalmente il ruolo fondamentale di Rheb nel processo di sviluppo. I topi 𝑅ℎ𝑒𝑏−/− muoiono intorno alla metà del periodo della gestazione a
causa di difetti nello sviluppo della struttura cardiovascolare (S.M. Goorden, M. Hoogeveen-Westerveld et al. 2011)147. I disturbi nello sviluppo sono confermati dalle dimensioni del corpo ridotte ed una ridotta capacità di proliferazione dei topi 𝑅ℎ𝑒𝑏−/−/𝑀𝐸𝐹 rispetto a quelli di tipo 𝑀𝐸𝐹 selvatici. Per quanto riguarda i topi con
isoforma specifica knockout, i topi 𝑅ℎ𝑒𝑏1−/− muoiono tra E10.5-11.5, mentre i topi 𝑅ℎ𝑒𝑏2−/− si sviluppano normalmente, non evidenziando difetti evidenti fino all’età adulta, dimostrando così che Rheb1 è essenziale per la sopravvivenza embrionale e la segnalazione mTORC1 (J. Zou, L. Zhou et al. 2011)148. Per esaminare ulteriormente il ruolo fisiologico di Rheb1 in vari tessuti, sono state generate delle cellule progenitrici neurali Rheb1 e consentono l’osservazione di compromissioni a livello della mielinizzazione nel cervello nel periodo postnatale; in particolare, nei primi mesi postnatale non si osservano difetti evidenti nello sviluppo del cervello, suggerendo, così che Rheb1 ha un ruolo fondamentale nell’adattamento selettivo cellulare. Un altro studio con topi Rheb KO fegato-specifico ha dimostrato che questi presentano un maggiore contenuto di mitocondri nel fegato e l’ulteriore localizzazione del Rheb a livello mitocondriale, laddove promuove la mitofagia e contribuisce a mantenere in condizioni ottimali la produzione di energia mitocondriale (S. Melser, E.H. Chatelain et al. 2013)149. Una serie di modelli di topo ed evidenze cliniche supportano anche
l’idea che Rheb possa agire come un oncogene in vari tipi di cancro, potendo così essere considerato come un potenziale target terapeutico per alcuni tipi di tumore150,151,152.
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RAG
:Simile al Rheb, la cui famiglia è un sottogruppo di Ras-GTPasi, di cui i mammiferi presentano quattro isoforme RagA, RagB, RagC e RagD. A differenza di altri membri della famiglia Ras, le GTPasi Rag formano degli eterodimeri, costituiti da RagA o RagB con RagC o RagD (T. Sekiguchi, E. Hirose et al. 2011)153. Il complesso Rag- Ragulator è essenziale nel rilevare i livelli intracellulari di amminoacidi per facilitare la successiva attivazione di mTORC1 (E. Kim, P. Goraksha-Hicks et al. 2008)154, (Y. Sancak, T.R. Peterson et al. 2008)155. Considerando solo RagA/B, questo può attivare la chinasi mTORC1 anche in assenza di amminoacidi; in particolare l’azione di RagA/B sembra essere predominante rispetto a quella di RagC/D, per cui la maggior parte degli studi genetici condotti sui modelli murini sono più concentrati sulla manipolazione di RagA e RagB. Al fine di illustrare il ruolo fisiologico di RagA, è stato generato un modello murino che esprime la forma attiva costitutiva di RagA(Q66L), nel quale si osservano dei difetti di omeostasi del glucosio ed autofagia; questi muoiono dopo la nascita (A. Efeyan, R. Zoncu et al. 2013)156. Inoltre, i topi 𝑅𝑎𝑔𝐴−/− mostrano la perdita dell’attività di mTORC1, profondi difetti nello sviluppo e muoiono intorno ad E10.5, mentre i topi 𝑅𝑎𝑔𝐵−/− non mostrano lo sviluppo di palesi anomalie e non dimostrano una riduzione dell’attività di mTORC1, indicando così che RagA è più importante per l’attività dell’mTORC1(Efeyan, L.D. Schweitzer et al. 2014)157. Dato che i topi 𝑅𝑎𝑔𝐴−/−/𝑅𝑎𝑔𝐵−/−corpo e fegato specifici mostrano
una notevole diminuzione dell’attività di mTORC1, le differenze fenotipiche tra i topi 𝑅𝑎𝑔𝐴−/− e 𝑚𝑇𝑂𝑅−/− (o 𝑅𝑎𝑝𝑡𝑜𝑟−/−) potrebbero essere dovute agli effetti di compensazione di RagB. È interessante notare che i topi 𝑅𝑎𝑔𝐴−/−/𝑅𝑎𝑔𝐵−/− cuore specifici non mostrano una perdita nell’attività dell’mTORC1, ma manifestano ipertrofia cardiaca, difetti di autofagia ed alterazioni della funzione dei lisosomi, ma nessun topo mostra ipertrofia prostatica (Y.C. Kim, H.W. Park et al. 2014)158. Fino ad ora nessun modello genetico Rag è stato associato allo sviluppo di forme tumorali.
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AMPK
:La AMPK appartenente alla famiglia delle serina-treonina chinasi; sensore che consente di mantenere l’omeostasi energetica a livello cellulare (D.G. Hardie, D.R. Alessie tal. 2013)159, (M.M. Mihaylova, R.J. Shaw et al. 2011)160. Una volta attivato, in condizioni di basso consumo energico, AMPK inibisce alcuni processi anabolici, quali la biosintesi di proteine e lipidi, promuove alcuni percorsi catabolici, compresa l’ossidazione di acidi grassi ed il processi di glicolisi, con conseguente generazione di ATP. L’AMPK è un complesso costituito da tre tipi di subunità α, β e γ; la prima è una subunità catalitica, mentre le altre due sono di tipo normativo. Nei mammiferi sono state identificate diverse isoforme per ogni subunità (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2 e γ3) (D.G. Hardie 2007)161. È stato stabilito che AMPK potrebbe regolare negativamente l’attivazione del complesso mTORC1, indirettamente, in parte attraverso la fosforilazione del regolatore a monte mTORC1 oppure direttamente tramite fosforilazione della componente normativa ed essenziale, Raptor, per innescare la sua interazione con i fattori di dissociazione di mTOR (D.M. Gwinn, D.B. Shackelford et al. 2008)162. Dato che AMPK agisce come un regolatore chiave del metabolismo cellulare, sono stati generati dei modelli di topi AMPK KO per esaminare da vicino il ruolo fisiologico delle subunità AMPK sul metabolismo. La perdita completa dell’attività della chinasi AMPK non è tollerata a livello dell’intero organismo in vivo, che è ben supportata dall’osservazione che i topi 𝐴𝑚𝑝𝑘𝛼1−/−/𝐴𝑚𝑝𝑘𝛼2−/−
presentano mortalità embrionale durante la E.10.5. (B. Viollet, Y. Athea 2009)163. Tuttavia, il muscolo scheletrico dei topi 𝐴𝑚𝑝𝑘𝛼1−/−/𝐴𝑚𝑝𝑘𝛼2−/− subisce un aumento della massa con miofibre grandi rispetto agli altri topi selvatici ( L. Lantier, R. Mounier et al. 2010)164, che indica appunto un ruolo fisiologico dell’AMPK nel governo dell’attività muscolare. D’altra parte, è ammissibile la perdita di un’isoforma delle subunità catalitiche α1 o α2, nei topi 𝐴𝑚𝑝𝑘𝛼2−/− sono presenti alti livelli di
glucosio e quindi hanno elevate probabilità di sviluppare l’obesità con una dieta ricca di grassi (B. Viollet, F. Andreelli et al. 2003)165. In questo modo AMPKα1 e AMPKα2 possono non svolgere ruoli eccessivi in vivo. Questa nozione è ulteriormente sostenuta dall’osservazione a livello osseo, laddove i topi 𝐴𝑚𝑝𝑘𝛼1−/−
mostravano un tasso di rimodellamento osseo elevato, mentre i topi Ampkα2−/− sono
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l’eliminazione di varie subunità regolatorie dell’AMPK sembra non avere effetti significativi sulla sopravvivenza del topo. I topi 𝐴𝑚𝑝𝑘𝛾3−/− un’alterazione nella ri- sintesi del glicogeno dopo l’esercizio (B.R. Barnes, S. Marklund et al. 2004)167.
Inoltre i topi 𝐴𝑚𝑝𝑘𝛽1−/−/𝐴𝑚𝑝𝑘𝛽2−/− muscolo specifici sono fisicamente inattivi e la visualizzazione dei contenuti mitocondriali è ridotta a livello delle cellule muscolari (H.M. O'Neill, S.J. Maarbjerg et al. 2011)168, che sottolinea un possibile ruolo dell’AMPKβ nella regolazione dell’energia a livello muscolare. Queste considerazioni hanno aperto la strada per l’applicazione clinica della Metformina, un farmaco che consente l’attivazione dell’AMPK, nel trattamento del diabete di tipo II, poiché determina un aumento dell’assorbimento del glucosio e l’ossidazione degli acidi grassi nei muscoli scheletrici (G. Zhou, R. Myers et al. 2001)169. È interessante notare che, studi di follow-up indicano che la Metformina può anche ridurre l’incidenza del cancro, in particolare a livello del colon e del fegato nei pazienti diabetici; da questo si ricava un possibile ruolo oncosoppressore dell’AMPK (J.M. Evans, L.A. Donnelly 2005)170.
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