6-OHDA 56 giorni
Densità49
b
a: p<0.05 vs Controllo; b: p<0.05 vs 6-OHDA 28 giorni
Figura 16. Gangli mienterici di sezioni a tutto spessore di colon distale di ratto controllo e con Parkinson sperimentale.
(A) Immagine rappresentativa della immunoreazione con il marcatore gliale GFAP (marrone) nei gangli mienterici in ratti controllo. (B-C) Animali trattati con 6OHDA a 28 e 56 giorni, rispettivamente. Dal confronto con i controlli, si evidenzia l’aumento significativo del GFAP a livello dei gangli mienterici a 28 giorni e il ritorno a valori controllo a 56 giorni. (D) Il grafico a colonne mostra la percentuale dei pixel positivi (PPP) ± DS delle cellule gliali GFAP positive nei gangli mienterici e nella neuromuscolare di ciascun gruppo.
A B
C D a
6-OHDA 28 giorni
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Figura 17. Gangli mienterici di sezioni a tutto spessore di colon distale di ratto controllo e con Parkinson sperimentale.
(A) Immagine rappresentativa della immunoreazione con il marcatore specifico per la SP nei gangli mienterici in ratti controllo. (B-C) trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni, rispettivamente. Dal confronto con i controlli, si evidenzia l’aumentata positività della SP a livello dei gangli mienterici e della tonaca muscolare sempre maggiore nei due tempi. (D) Il grafico a colonne mostra la percentuale dei pixel positivi (PPP) ± DS della SP nei gangli mienterici e nella neuromuscolare di ciascun gruppo.
A B C D a b a: P<0.05 vs Controllo; b: P<0.01 vs Controllo
PPP
6-OHDA 28 giorni
6-OHDA 56 giorni
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Controllo Controllo Controllo 6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni
6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni
Controllo 6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni
6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni Frequenza (Hz) Frequenza (Hz) Tensione (g/g tessuto) Tensione (g/g tessuto) *P<0.05 vs controllo Figura 18.
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Figura 18. Preparati di muscolatura liscia longitudinale (a) e circolare (b) isolati
da animali controllo e ratti trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni e mantenuti in soluzione di Krebs, contenente L-NAME (100 µM), guanetidina (10 µM), atropina (1 µM). Le risposte contrattili sono state indotte da stimolazione elettrica (ES. 0.5 ms, 30 mA, 10 s, 1-20 Hz). Ciascuna colonna riporta la media ± DS, valore ottenuto da 3 esperimenti. *P<0.05; differenza significativa verso il controllo.
Figura 19. Preparati di muscolatura liscia colica isolati da ratti controllo o
trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni e mantenuti in soluzione di Krebs standard, contenente tetrodotossina (1 µM). La risposta contrattile dei preparati di muscolatura liscia longitudinale (a) e circolare (b) indotta da crescenti concentrazioni di SP esogena (0.01-10 µM). Ciascun punto presenta la media ± DS, valore ottenuto da 8 esperimenti. *P< 0.05; differenza significativa rispetto al controllo.
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Controllo Controllo
6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni
Controllo 6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni
6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni Sostanza P (M) Tensione (g/g tessuto) Tensione (g/g tessuto) *P<0.05 vs controllo Figura 19. Sostanza P (M)
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DISCUSSIONE
La MP si presenta come patologia neurologica multisistemica caratterizzata da disturbi della motilità somatica e, molto spesso, anche viscerale (disfagia, gastroparesi, costipazione). Tali fenomeni in particolare il rallentamento dello svuotamento gastrico e la dismotilità intestinale, contribuiscono direttamente alla morbosità della MP poiché possono interferire sulla farmacocinetica dei comuni trattamenti antiparkinson, complicando la gestione clinica della patologia (Annerino et al., 2012). Inoltre è stato recentemente osservato che tali disfunzioni digestive possono precedere anche di molti anni la comparsa dei primi sintomi della MP. Nonostante la rilevanza clinica dei disturbi GI nei pazienti con MP, poco si sa sulla loro eziopatogenesi e fisiopatologia. Pertanto, abbiamo ritenuto interessante studiare gli aspetti morfo- funzionali del compartimento neuromuscolare del colon in un modello sperimentale di MP indotto nel ratto con iniezioni intracerebrali di 6- OHDA. In particolare, abbiamo effettuato uno studio morfo-funzionale su neuroni e glia dei gangli mienterici e sulla tonaca muscolare del colon. Infatti, i neuroni enterici e le cellule gliali rappresentano i principali regolatori delle funzioni motorie della parete intestinale, garantendo uno svolgimento coordinato dell’attività motoria della muscolatura liscia (Quigley, 2010; Wood, 2008). Di conseguenza, alterazioni morfologiche
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e/o funzionali di tali strutture si traducono in un alterato controllo della motilità intestinale con conseguente comparsa di disturbi digestivi.
Dai risultati del nostro studio è emerso che, in seguito a denervazione nigrostriatale dopaminergica, si assiste ad un rimodellamento sia morfologico che funzionale del compartimento neuromuscolare colico. In particolare al 28° giorno dall’induzione della lesione abbiamo osservato un aumento significativo della componente gliale a livello dei gangli mienterici con parallela tendenza all’incremento, anche se non significativo, dei neuroni. La positività per SP ha presentato un progressivo aumento, raggiungendo valori di significatività al 28° giorno e di alta significatività al 56°. Questo incremento è risultato in accordo con i dati funzionali di incremento del tono tachichininergico ottenuti negli animali con MP, dato che può essere tra le cause scatenanti i disturbi GI nella MP.
A seguito dell’aumento dell’attività del sistema tachichininergico, ci attenderemmo una downregulation dei recettori per SP a livello della componente muscolare. Dai dati ottenuti nel nostro studio si evidenzia invece una aumentata densità recettoriale per SP nel colon degli animali con MP, come mostrato dalla risposta contrattile a SP esogena in presenza di tetrodotossina, che risulta significativamente esaltata negli animali lesionati.
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Pertanto le osservazioni raccolte dal presente studio sull’incremento del
controllo motorio tachichininergico, associato all’aumento
dell’espressione di SP e della densità recettoriale tachichininergica nel compartimento neuromuscolare colico, possono essere compatibili con le disfunzioni motorie intestinali associate alla MP.
Per quanto concerne lo studio morfologico dei neuroni mienterici le valutazioni sono state condotte impiegando come marcatori gli antigeni HuC e HuD. Tali proteine, essenziali nell’istogenesi dei neuroni enterici (Perrone-Bizzozero and Bolognani, 2002), sono coinvolte anche nelle loro funzioni trofiche e di sopravvivenza (De Giorgio et al., 2003). La densità dei neuroni mienterici negli animali con MP non ha presentato variazioni significative rispetto ai controlli, in accordo con la letteratura ed i dati raccolti da Colucci et al. (2012). Questo dato, insieme all’aumento dell’espressione di neuronale di SP, suggerisce che gli animali con MP presentano una variazione del coding neurochimico in una popolazione neuronale stabile, aprendo nuove prospettive di studio.
L’incremento dell’attività del sistema tachichininergico riscontrato nel nostro studio è in accordo anche con osservazioni in vitro su neuroni striatali di ratto, trattate con 6-OHDA, che presentavano un aumento dell’espressione di SP (Thornton et al., 2010). Il trattamento con 6-OHDA provoca quindi aumento di SP nei neuroni sia a livello centrale che enterico. Una spiegazione di tale variazione a livello centrale è stata data
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sulla base del meccanismo d’azione della DA che controlla il release di SP attraverso un meccanismo di feedback positivo. Il trattamento con 6- OHDA, meccanisticamente simile alla DA, potrebbe indurre una attivazione dei recettori dopaminergici D1 sulle proiezioni neuronali striatali contenenti SP, inducendone così il rilascio. In più, I neuroni dopaminergici esprimono NK1, perciò la SP endogena rilasciata da queste proiezioni neuronali può legare i recettori NK1 e ponteziare eventualmente il rilascio di DA. L’aumento di SP causato dalla 6-OHDA può essere quindi spiegato sulla base di questo meccanismo di feedback positivo.
Per quanto riguarda il coinvolgimento della componente gliale, possiamo dire che gli animali con MP al 28° giorno hanno presentato incrementi significativi della glia mienterica. Questa risposta è interpretabile come gliosi reattiva, fenomeno che si presenta a seguito di lesioni della parete GI di vario tipo, ma può essere vista anche in chiave di neurogenesi, dato il potenziale staminale della glia enterica, ampiamente dimostrato anche in modelli animali (Laranjeira et al., 2011). È nota inoltre una attività gliale di neuroprotezione, svolta mediante la riduzione del glutatione (Abdo et al., 2010). È da notare che nel nostro modello di MP la risposta gliale è concomitante all’aumento di SP, cosa che può rivestire un ruolo di rilievo nella fisiopatologia della MP. Infatti questa tachichinina induce fenomeni di infiammazione neurogenica: questa è una reazione
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infiammatoria secondaria alla stimolazione di fibre nervose, le quali, rilasciando SP, inducono aumento della permeabilità microvascolare, con formazione di edemi (Hokfelt et al., 2000). Questo processo, già descritto nel danno in strutture periferiche (Turner et al., 2011), è stato recentemente descritto anche nel SNC (Donkin et al., 2009; Nimmo et al., 2004; Vink and van den Heuvel, 2010). L’infiammazione neurogenica è stata correlata anche alla perdita dell’integrità della barriera emato- encefalica (BEE) ed è stata quindi proposta come una possibile causa della progressione della MP (Kortekaas et al., 2005; Rite et al., 2007). A tal riguardo, studi sul microambiente dei plessi mienterici, in particolare sulla barriera vascolare neuro enterica dei gangli, potrebbero aprire interessanti linee di ricerca per la comprensione della fisiopatologia dei disturbi motori GI associati alla MP.
A livello del SNC nella MP sono coinvolti anche molti altri fenotipi cellulari, oltre ai neuroni, come ad esempio la microglia, cellule che appartengono al sistema monocita-macrofagico. Una attivazione di tale popolazione cellulare è stata osservata nel SNC di animali con MP (Depino et al., 2003), così come nelle PET scans e nei campioni post- mortem di pazienti parkinsoniani (McGeer and McGeer, 2008; Mosley et al., 2006). La microglia attivata può danneggiare le cellule limitrofe tramite il rilascio di citochine pro-infammatorie, ossido nitrico (NO) e specie reattive dell’ossigeno, oltre a svolgere deposizione di α-sinucleina
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(Croisier et al., 2005) e fagocitosi di neuroni dopaminergici (McGeer et al., 1988).
Accanto alla microglia anche gli astrociti sono coinvolti nella risposta cellulare del SNC in modelli animali di MP. In particolare, è stata dimostrata una attivazione gliale, ma il ruolo specifico degli astrociti nella patogenesi dei disturbi della MP rimane ancora oscuro (Takagi et al., 2007, Chung et al., 2010). La capacità degli astrociti di sintetizzare glutatione, mirata alla neuro protezione e dimostrata in condizioni di stress ossidativo (Desagher et al., 1996), potrebbe essere un meccanismo a favore di neuroni del SNC in degenerazione nella MP. Dato che le cellule gliali dei plessi enterici sono l’equivalente periferico degli astrociti centrali, la gliosi reattiva osservata nel nostro studio è in accordo con i dati soprariportati a livello centrale; pertanto, analoghi meccanismi di neuro-protezione da parte della glia potrebbero essere suggeriti anche a livello del sistema nervoso enterico in corso di MP.
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CONCLUSIONI
Dai risultati ottenuti in questo studio possiamo concludere che il modello di MP sperimentale, indotto tramite iniezioni nigrostriatali di 6-OHDA, è associato con modificazioni neurochimiche funzionali e istopatologiche del compartimento neuromuscolare colico.
Questi dati possono rappresentare il punto di partenza sia per studi volti a comprendere più a fondo i meccanismi fisiopatologici della dismotilità intestinale associata alla MP, che per la messa a punto di nuove strategie terapeutiche volte a migliorare i disturbi digestivi e la qualità della vita del paziente con MP.
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