Ruolo del sistema tachichininergico nella malattia di Parkinson: studio morfologico e farmacologico del compartimento neuromuscolare colico in un modello sperimentale

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UNIVERSITÀ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Farmacia

Tesi di Laurea

RUOLO DEL SISTEMA TACHICHININERGICO NELLA MALATTIA DI

PARKINSON: STUDIO MORFOLOGICO E FARMACOLOGICO DEL

COMPARTIMENTO NEUROMUSCOLARE COLICO IN UN MODELLO

SPERIMENTALE

RELATORE

Chiar.mo Prof. Corrado Blandizzi CORRELATORE

Prof.ssa Nunzia Bernardini

CANDIDATO

Sara Stocchi

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INDICE

ABBREVIAZIONI ... 3 INTRODUZIONE ... 4 La Malattia di Parkinson (MP)... 4 MP e disturbi gastrointestinali... 11 Modello sperimentale di MP ... 14

Aspetti morfofunzionali del compartimento neuromuscolare enterico ... 16

Neurotrasmissione del SNE: il sistema tachichininergico ... 21

Sostanza P e sistema nervoso ... 26

Cellule Gliali e sistema nervoso ... 27

OBIETTIVO ... 31

MATERIALI E METODI ... 32

Animali ... 32

Induzione del modello sperimentale di MP ... 32

Allestimento dei campioni tissutali di colon ... 33

Protocolli per l’indagine immunoistochimica ... 34

Identificazione e analisi quantitativa delle cellule gangliari ... 36

Determinazione quantitativa della immunopositività neuromuscolare di GFAP e SP ... 40

Analisi funzionale dell’attività contrattile intestinale ... 42

Neuroni mienterici ... 45

Cellule gliali mienteriche ... 45

Immunoreattività per SP ... 46

Attività contrattile della muscolatura liscia circolare e longitudinale ... 46

DISCUSSIONE ... 54

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ABBREVIAZIONI

6-OHDA, 6-idrossidopamina

Ach, acetilcolina

AMPc, adenosina monofosfato ciclico

DA, dopamina

DS, deviazione standard

GI, gastrointestinale

GFAP, proteina gliale fibrillare acida

HuC/D, proteine neuronali HuC e HuD

MP, malattia di Parkinson

MPTP, 1-metil-4-fenil 1,2,3,6-tetraidropiridina

NKA, neurochinina A

NKB, neurochinina B

PPP, percentuale di pixel positivi

SN, sostanza nera del Söemmering

SNE, sistema nervoso enterico

SNC, sistema nervoso centrale

SP, Sostanza P

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INTRODUZIONE

La Malattia di Parkinson (MP)

La MP è una patologia multisistemica di natura sconosciuta, che si presenta con disturbi motori quali tremore, rigidità e bradicinesia, associati a degenerazione dei neuroni dopaminergici. La MP è la seconda più comune patologia neurodegenerativa dopo il morbo di Alzheimer e colpisce 4,6 milioni di persone nei paesi più popolati del mondo. La MP presenta una prevalenza dell'1% all'età di 65 anni e una tendenza all'aumento con il progredire dell'età. Nella popolazione anziana si prevede un incremento consistente dei costi sociali per questa malattia. La caratteristica patologica peculiare della MP è rappresentata dalla degenerazione progressiva dei neuroni dopaminergici della sostanza nera del Söemmering (SN) del sistema nervoso centrale (SNC), più precisamente delle vie nigrostriatali, provenienti dalla SN e dirette allo striato (Lebouvier et al., 2009)

.

Tra i sistemi sottocorticali di controllo delle funzioni motorie, la SN (Figura 1) costituisce la maggiore sede d’origine di fibre dopaminergiche del SNC. La SN viene così definita per la presenza in molti neuroni di un pigmento colorato, la melanina, che si forma durante la sintesi della dopamina (DA). La principale stazione di terminazione delle fibre efferenti della SN è lo striato (via nigro-striatale).

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Con il termine striato si indicano due strutture dette nucleo caudato e putamen che fanno parte, insieme al globo pallido, dei gangli della base (Figura 2).

Altre importanti efferenze dopaminergiche si portano al talamo, principalmente ai nuclei ventrali, anteriore e laterale (via nigro-talamica). Inoltre, sempre nell’ambito del sistema dopaminergico, sono state descritte fibre dirette alle regioni basali del telencefalo, cui la SN è anche collegata mediante fibre afferenti.

Gli estesi collegamenti efferenti della SN, sia con formazioni che partecipano nella regolazione di funzioni motorie (striato), sia con formazioni che intervengono con funzioni più complesse, intellettive ed emotivo-istintive (talamo), rendono ragione della possibile associazione, nella sindrome parkinsoniana, dei classici sintomi motori con disturbi

comportamentali ed intellettivi quali iperemotività, instabilità emotiva,

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Figura 1. Schema che mostra le principali caratteristiche di organizzazione della SN. I dendriti di molte cellule della parte compatta si portano nella parte

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Striato

STN

Globo Pallido

SN

Figura 2. Gangli dei nuclei della base. Sezione postmortem illustrante le varie

componenti dei gangli della base. SN, sostanza nera del Söemmering pars compacta; STN, nucleo subtalamico.

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Nei pazienti con MP si osservano caratteristiche modificazioni istopatologiche dei neuroni della SN quali inclusioni citoplasmatiche, eosinofile dette corpi di Lewy (Figura 3), ricche della proteina sinaptica α-sinucleina (Shannon et al., 2012). Sebbene non sia ancora chiaro il meccanismo attraverso il quale queste malformazioni proteiche causino neurodegenerazione, esistono forti evidenze che alterazioni genetiche e molecolari giochino un ruolo cruciale nello sviluppo delle proteine aberranti tipiche della MP (Ebrahimi-Fakhari et al., 2012).

La degenerazione dopaminergica dello striato innesca alterazioni funzionali complesse nel circuito dei gangli della base, che causano la comparsa dei tipici sintomi motori della malattia (tremore, rigidità e bradicinesia) (Blandini et al., 2000; Thornton et al., 2010). La degenerazione dopaminergica nigro-striatale ha una correlazione causale con i classici sintomi motori del MP, quali lentezza dei movimenti, tremore a riposo, rigidità muscolare e instabilità posturale, segni su cui si basa la stessa diagnosi della patologia, che in genere è tardiva rispetto alle lesioni istopatologiche, poiché i sintomi motori appaiono solo quando è già avvenuta una significativa perdita dei neuroni dopaminergici, che corrisponde in genere al 40-60% (Shannon et al., 2012).

9 Figura 3A

Figura 3B Figura 3C

Figura 3. (A) Campioni patologici da un paziente con MP (destra) comparati con

un soggetto normale (sinistra), dimostrano una riduzione della pigmentazione nella SN nel paziente rispetto al controllo, e (B) un ridotto numero di cellule nella MP paragonato al controllo. (C) Corpi di Lewy (frecce) all’interno dei neuroni dopaminergici mielinizzati nella MP (Dan L.Long et al., 2012).

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Per quanto riguarda il trattamento farmacologico, fin dal tardo 1960 la levodopa (3,4-diidrossi-l-fenilalanina, L-DOPA) è stata il pilastro della terapia del MP, sulla base della dimostrata una mancanza di DA nello striato dei pazienti parkinsoniani. Vista la incapacità di DA di attraversare la barriera emato-encefalica, iniziarono esperimenti clinici a base di L-DOPA precursore diretto della DA. Nella successiva decade, studi confermarono il valore della L-DOPA e rivoluzionarono il trattamento della MP. Tuttavia, il trattamento prolungato con L-DOPA si associa a diverse complicanze, come oscillazioni “on-off”, episodi di blocco motorio, nonché perdita della risposta terapeutica e movimenti anomali (Obeso et al., 2000). Infatti, sebbene la L-DOPA sia molto efficace nel ridurre i sintomi motori per i primi 5-10 anni di terapia, l’uso prolungato con questo farmaco comporta comprovate complicazioni motorie come la discinesia (Chen et al., 2004). La L-DOPA viene quindi somministrata in combinazione con inibitori delle decarbossilasi periferiche (carbidopa o benserazide), al fine di prevenire la sua metabolizzazione a DA, con il

conseguente sviluppo di nausea e vomito, dovuti all’attivazione dei

recettori dopaminergici dell’area postrema, che non è protetta dalla barriera ematoencefalica. E’ anche disponibile come formulazioni a rilascio controllato in combinazione con inibitori delle catecol o-metil transferasi (COMT). La L-DOPA rimane ad oggi il più efficace trattamento

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sintomatico della MP e il “gold standard” con cui vengono comparate le nuove terapie (Dan L. Long et al., 2012).

MP e disturbi gastrointestinali

La MP si associa a sintomi non motori in particolare di tipo gastrointestinale (GI) quali disfagia, nausea, distensione addominale e costipazione cronica grave. La dismotilità GI peggiora ulteriormente la qualità di vita del paziente con MP, oltre ad interferire con i comuni trattamenti antiparkinson. Tali disturbi rivestono un interesse particolare data la loro precoce comparsa rispetto all’insorgenza della dismotilità somatica. Nonostante che i meccanismi fisiopatologici responsabili dei sintomi digestivi siano poco noti, si ipotizza che alterazioni delle componenti neuromuscolari del tratto GI svolgano un ruolo importante nella comparsa dei sintomi digestivi (Lebouvier et al., 2009).

La disfagia nella MP può essere il risultato di un difetto di coordinazione della muscolatura orale, faringea ed esofagea. Infatti, masticazione e deglutizione richiedono contrazioni e rilassamenti seriali altamente coordinati di diversi muscoli della bocca, della faringe e dell’esofago. Il rallentamento dello svuotamento gastrico per gastroparesi è caratterizzato da una varietà di sintomi quali gonfiore postprandiale, sazietà precoce e nausea. La gastroparesi nel paziente parkinsoniano può avere delle implicazioni farmacocinetiche: un rallentato svuotamentento

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gastrico e di conseguenza un ritardato arrivo della levodopa ai siti di assorbimento può causare un errato responso al farmaco; la ritenzione della L-DOPA nello stomaco, inoltre, aumenta la sua esposizione alle dopa-decarbossilasi presenti nella mucosa gastrica, le quali, convertendo la L-DOPA in DA, rendono il farmaco inadatto all’assorbimento intestinale. Questi difetti di assorbimento possono spiegare lo sviluppo delle fluttuazioni motorie tipiche dei pazienti parkinsoniani.

Per quanto riguarda invece il distretto enterico, in particolare a livello del compartimento colico, si assiste ad una diminuzione della frequenza della peristalsi, cosa che si traduce in un rallentato transito del materiale fecale attraverso il colon. Da recenti sondaggi emerge che il 20% dei pazienti

parkinsoniani soffre di costipazione e, da studi epidemiologici, emerge

una associazione tra deficit di peristalsi intestinale e rischio di sviluppo della MP (Abbott et al., 2001). La costipazione è spesso riferita come precoce manifestazione clinica del morbo stesso o in alternativa può essere considerata come un fattore di suscettibilità a fattori ambientali attivi nella patogenesi, in quanto, un rapido transito intestinale, ridurrebbe l’esposizione ad una eventuale sostanza tossica ingerita (Shannon et al., 2012).

E’ quindi importante prendere in considerazione i sintomi non motori, in particolare quelli GI (specialmente la costipazione), in quanto essi, oltre a compromettere la qualità di vita del paziente, compaiono diversi anni

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prima dei tipici sintomi motori. Questo lascia presupporre che la degenerazione che colpisce il sistema nervoso enterico (SNE) inizi in uno stadio precoce della patologia, probabilmente anche prima del coinvolgimento del SNC (Zhu et al., 2012). Recenti evidenze sperimentali e cliniche hanno dimostrato alterazioni istopatologiche a carico dei neuroni del SNE che controllano la funzione secretoria e motoria del canale alimentare. All’interno del plesso mienterico esofageo sono stati identificati corpi di Lewy, cosa che lascia presupporre che la disfagia parkinsoniana sia in parte dovuta ad un danno diretto di tali neuroni. La costipazione associata alla MP potrebbe essere una diretta conseguenza dei cambiamenti che interessano i neuroni intestinali, oppure il risultato

di alterazioni delle comunicazioni crociate cervello-intestino,

coinvolgendo in primo luogo le strutture neuronali centrali. Infatti, sebbene tali neuroni siano capaci di regolare in mondo autonomo l’attività GI, alterazioni dell’innervazione estrinseca intestinale potrebbero innescare un marcato rimodellamento del coding neurochimico dei neuroni enterici (Colucci et al., 2012). Secondo l’ipotesi di Braak, la presenza di corpi di Lewy nel tratto GI rappresenta uno dei primi segni della malattia (Lebouvier et al., 2009). Nonostante l’importanza e la precocità di comparsa dei disturbi GI nei pazienti con MP, gli aspetti fisiopatologici della dismotilità digestiva associata alla MP sono attualmente poco noti. Pertanto, studi su modelli animali di MP

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rivestono un grande significato per indagare i meccanismi dei disturbi GI associati a questa patologia neurodegenerativa.

Modello sperimentale di MP

I due modelli principali di MP prevedono l’utilizzo delle neurotossine

MPTP (1-metil-4-fenil 1,2,3,6-tetraidropiridina) o 6-OHDA

(6-idrossidopamina), che inducono una degenerazione selettiva delle componenti dopaminergiche, riproducendo il danno tipico della MP. Dato che il modello con MPTP determina solo una neurotossicità transitoria, che non rispecchia completamente il quadro della MP (patologia progressiva, cronica e neurodegenerativa) è stato messo a punto il modello sperimentale realizzato mediante iniezione di 6-OHDA, tossina che induce una perdita di neuroni dopaminergici nigrostriatali e una diminuzione dei livelli proteici di tirosina idrossilasi (TH) (Colucci et al., 2012; Zheng et al., 2011). Analisi immunoistochimiche condotte sui preparati cerebrali degli animali lesionati con 6-OHDA, hanno evidenziato alterazioni nello striato secondarie a stress ossidativo causato dalla formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Animali operati e sacrificati dopo quattro e otto settimane dall’induzione della lesione (Colucci et al., 2012), mostravano una completa perdita dei terminali dopaminergici (TH-positivi) e dei corpi cellulari nello striato, mentre nei

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controlli non sono stati individuati cambiamenti di immunoreattività per TH (Figura 4).

In tale modello di MP è stata riportata anche la presenza di modificazione dell’espressione di TH nel tratto digerente (Tian et al., 2008; Ungerstedt

et al., 1974), così come costipazione grave (Blandini et al., 2009).

A

B

Figura 4. (A) striato - lato non lesionato; (B) striato - lato lesionato. Si osserva la

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Aspetti morfofunzionali del compartimento neuromuscolare

enterico

Il colon è la porzione più estesa dell’intestino crasso, riceve il contenuto dell’intestino tenue e riassorbe la gran parte dell’acqua e degli elettroliti, formando e accumulando le feci. La parete del colon è organizzata in diversi strati: dall’interno all’esterno si osservano la tonaca mucosa, la tonaca sottomucosa, la tonaca muscolare e la tonaca avventizia o sierosa. La tonaca mucosa ha una superficie liscia, non presentando né pieghe né villi. L’epitelio di rivestimento si dispone sulla superficie mucosa, interrotto soltanto dagli sbocchi di numerose ghiandole (dette ghiandole di Lieberkühn). La sottomucosa, ospita vasi sanguigni, linfatici e fibre nervose, come pure plessi nervosi, ma non presenta strutture ghiandolari. La tonaca muscolare presenta uno strato interno di fasci circolari e uno esterno di fasci longitudinali (Balboni G., 1990). Il colon, come tutto il canale digerente, è caratterizzato dalla presenza di una estesa rete di circuiti neurali incorporati nelle sue pareti, che viene definita nel suo insieme SNE. Esso è coinvolto nel controllo di molte delle funzioni dell’intestino e regola l’attività della muscolatura liscia, che consente l’avanzamento e il mescolamento del contenuto lungo il colon. Il SNE contiene approssimativamente lo stesso numero di cellule nervose del midollo spinale ed è connesso al SNC tramite vie afferenti sensitive ed efferenti (o effettrici) simpatiche e parasimpatiche (Simon Brookes and

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Marcello Costa, 2002). Esso è costituito da cellule neuronali e gliali riunite in piccoli raggruppamenti detti gangli (Figura 5-8) che sono interconnessi da fasci di fibre. I processi di queste cellule nervose, oltre a connettersi con altri neuroni, innervano il muscolo, l’epitelio secretorio e i vasi. Un importante aspetto del SNE è la sua capacità di dirigere le funzioni del sistema digestivo per via riflessa, senza dipendere dai comandi dell’encefalo o del midollo spinale, anche se è comunque presente un ricco interscambio di segnali tra il SNE e SNC ad azione modulatoria. La maggior parte delle cellule nervose sono contenute in due gruppi distinti di gangli, che sono definiti come plesso sottomucoso, o plesso di Meissner, e plesso mienterico, o plesso di Auerbach (Figura 5-6). Il plesso sottomucoso è localizzato al di sotto della mucosa, percorre insieme al plesso mienterico tutta la lunghezza dell’intestino, ed è costituito da fibre di interconnessione fini e da gangli di dimensioni ridotte rispetto a quelli del plesso mienterico. Il plesso mienterico è costituito da un network continuo di fibre nervose e piccoli gangli che percorrono tutto il tratto GI e che giacciono tra la muscolatura longitudinale esterna e la muscolatura circolare interna (Figura 7). Sebbene i due plessi siano stati qui descritti come due entità separate, in realtà essi sono interconnessi da numerosi e sottili fasci di fibre nervose (John Barton Furness, 2006).

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Figura 5. Distribuzione dei gangli enterici nel canale digerente. Il tratto GI è

rappresentato schematicamente in sezione longitudinale per evidenziare i gangli mienterici (in rosso) e sottomucosi (in blu) che formano due plessi continui a partire dalla regione esofagea fino allo sfintere anale (John Barton Furness, 2006).

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Figura 6. (A-B) Struttura e localizzazione del SNE e sua organizzazione in plessi

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Figura 7. Rappresentazione schematica del plesso mienterico.

La struttura primaria (1) comprende i gangli e le fibre internodali (connessioni intergangliari), mentre la struttura secondaria (2) è costituita da fibre nervose disposte parallelamente allo strato di muscolatura circolare. La struttura terziaria (3) si ritrova solo nei tratti con muscolatura longitudinale sottile (John Barton Furness, 2006).

Figura 8. Ganglio del plesso mienterico di colon di ratto, colorazione

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Il trasporto, la conservazione e l’evacuazione del contenuto colonico sono compiuti dalla coordinazione dell’attività della muscolatura liscia, che a sua volta è regolata da complesse interazioni tra meccanismi miogenici e neurogenici.

La motilità colica è regolata dal SNE, che svolge le sue funzioni tramite riflessi semplici e stereotipati. Essa è controllata dal SNC grazie a connessioni neuronali, che comprendono componenti simpatiche (inibitorie) e parasimpatiche (eccitatorie) (Simon Brookes and Marcello Costa, 2002).

Neurotrasmissione del SNE: il sistema tachichininergico

Le vie motorie del SNE, che possono essere divise funzionalmente in inibitorie ed eccitatorie, sono localizzate nel plesso mienterico. I più importanti neurotrasmettitori inibitori sono l’Ossido Nitrico (NO) e il peptide intestinale vasoattivo (VIP), i quali sono rilasciati e agiscono come neurotrasmettitori inibitori non-adrenergici non-colinergici (NANC), mentre tra i neurotrasmettitori eccitatori il più rappresentativo è l’acetilcolina (ACh). La DA, invece, è stata recentemente proposta come modulatore negativo della motilità GI, agendo tramite l’inibizione del rilascio di ACh dai neuroni colinergici, che esprimono il recettore dopaminergico D2 (Colucci et al., 2012).

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Per quanto riguarda la trasmissione eccitatoria non colinergica, il sistema tachichininergico riveste un ruolo importante. Le tachichinine costituiscono una delle più numerose famiglie di peptidi presenti negli organismi animali. Il loro nome (da ταχύς = veloce, κίνησις = movimento) deriva dalla loro proprietà di indurre rapidamente la contrazione della muscolatura del tratto GI (Werge, 2007).

Le tachichinine sono neuropeptidi che mostrano una comune sequenza carbossi-terminale che è essenziale per l’interazione e l’attivazione dei recettori tachichininergici, mentre le diverse sequenze ammino-terminali determinano la specificità nei confronti dei vari sottotipi recettoriali. Nei mammiferi sono stati identificati cinque peptidi della famiglia delle

tachichinine: Sostanza P (SP), Neurochinina A (NKA), Neuropeptide- γ,

Neuropeptide K e Neurochinina B (NKB).

Gli effetti tachichininergici endogeni sulle cellule target sono regolati da almeno tre specifici recettori: neurokinin 1 receptor (NK1R) , NK2 e NK3 (O'Connor et al., 2004), che hanno alcune affinità preferenziali, rispettivamente per SP, NKA e NKB. Tali interazioni preferenziali sono a volte trascurabili: poiché NKB non è espressa nel tratto GI, i recettori NK3 di questo distretto interagiranno con SP e NKA (Maggi, 1995). I recettori tachichinergici NK1 e NK2 sono localizzati sia sulle cellule della muscolare liscia, dove mediano la contrazione, sia sulle cellule neuronali. (Figura 9). Nel colon i recettori NK1 e NK2 producono una eccitazione da

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stimolazione nervosa non adrenergica non colinergica della muscolatura circolare, che mostra una notevole specializzazione. I recettori NK1 mediano una trasmissione eccitatoria “veloce”, che dipende

dall’attivazione dei canali del Ca++ _{voltaggio dipendenti, mentre i recettori}

NK2 mediano una trasmissione eccitatoria “lenta” indipendente dai canali del Ca++ _{(Maggi et al., 1994b). L’attivazione del recettore della SP NK1,}

recettore accoppiato a proteina G, attiva una cascata biochimica che porta ad un aumentato turnover di inositolo 1,4,5-trifosfato intracellulare

e un aumento degli ioni Ca++ _{intracellulari. Sul recettore NK1 è localizzata}

una proteina legante l’AMPc che risponde all’elevata concentrazione di

AMPc o Ca++ _{aumentando la trascrizione genica, creando quindi un}

feedback positivo per la SP. (Maggi et al., 1990; Maggi et al., 1994a). La SP, peptide di 11 amminoacidi, è presente nei neuroni afferenti primari e nei plessi nervosi della parete del tratto GI (Berne Levy, 1995). Infatti, sebbene le tachichinine (SP e neurochinine) siano presenti nelle cellule immunitarie ed enterocromaffini intestinali, sono state anche trovate nei neuroni eccitatori motori che proiettano sia alla muscolatura circolare che alla longitudinale, in interneuroni ascendenti ed in neuroni afferenti primari.

SP e NKA sono raccolte in vescicole sinaptiche nei neuroni enterici che operano un co-rilascio di ACh: infatti è noto che, la maggior parte dei

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neuroni enterici SP positivi coesprimono colina acetiltransferasi (Figura 9).

SP e NKA sono espresse nei neuroni intrinseci con corpi cellulari nel sistema enterico (plessi mienterico e sottomucoso) e fibre nervose estrinseche afferenti primarie originate dai gangli della radice dorsale che raggiungono l’intestino tramite nervi simpatici e gangli prevertebrali. I peptidi contenuti nella componente intrinseca, costituiscono la maggiore porzione delle tachichinine intestinali (Simon Brookes and Marcello Costa, 2002). L’eccitazione e quindi la depolarizzazione di questi neuroni provoca esocitosi di tachichinine.

Una delle più affermate funzioni fisiologiche del sistema tachichininergico nell’intestino è il suo potere eccitatorio ed effetto spasmogenico sulla muscolatura liscia del tratto GI. Tuttavia anche stimoli come stress, anafillassi, infezione o infiammazione possono provocare il rilascio di tachichinine dai neuroni enterici o dai neuroni afferenti e causare disturbi sulla motilità intestinale (Holzer, 1998; Holzer and Holzer-Petsche, 1997). Infatti, la diminuzione del PH e la presenza di mediatori infiammatori possono causare il rilascio selettivo di peptidi dai nervi estrinseci. L’infiammazione GI è stata infatti associata con alterazioni del contenuto peptidergico, spesso in modo dipendente dallo stato e dalla genesi della patologia. Infatti la modificazione della SP riscontrata nelle malattie infiammatorie intestinali è probabilmente un fenomeno secondario,

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correlato con il grado di infiammazione dei tessuti interessati. Qualunque sia il meccanismo, la alterata concentrazione del peptide nel microambiente locale può giocare un ruolo importante nella patogenesi di queste malattie (Evangelista, 2001).

Figura 9. Schema illustrativo delle vie neuronali che regolano i riflessi e la peristalsi nel tratto GI. La distensione radiale della parete dell’intestino dovuta

ad un bolo intraluminale eccita le vie ascendenti e discendenti, portando a riflessi eccitatori ed inibitori. Tutti i sottotipi di recettori tachichinergici sono espressi sui neuroni dove mediano effetti eccitatori (+) o inibitori (-) sulla propulsione. I recettori tachichininergici localizzati sulle cellule della muscolatura liscia appartengono ai sottotipi NK1 e NK2 e sono di tipo eccitatorio (Simon Brookes and Marcello Costa, 2002).

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Sostanza P e sistema nervoso

Il neuropeptide SP è stato trovato a livello dello striato, ed è particolarmente espresso nella SN. Qui la SP è coinvolta nel rilascio di DA dal legame preferenziale con il recettore tachichininergico NK1 localizzato sui neuroni dopaminergici. Inoltre, DA può potenziare il rilascio di SP all’interno della SN, tramite il legame col suo recettore D1 localizzato sulle proiezioni dei neuroni nigrostriatali. Quindi la regolazione della DA e della SP nei gangli della base avviene tramite un meccanismo di feedback positivo. Di conseguenza si assiste ad una diminuzione dell’espressione di SP a livello della SN in seguito alla perdita della stimolazione dopaminergica striatale (De Ceballos and Lopez-Lozano, 1999; Mauborgne et al., 1983).

È stato supposto che questa perdita di SP possa essere coinvolta nella comparsa dei sintomi parkinsoniani (Wade and Schneider, 2001). In particolare queste osservazioni sono state fatte in tessuti post-mortem di pazienti con MP, che quindi invariabilmente presentavano una tarda MP, cioè uno stadio molto avanzato della patologia. Poco è conosciuto invece sull’ espressione di SP durante una più precoce degenerazione dopaminergica. È noto che la produzione elevata di SP si traduce direttamente in morte cellulare (Castro-Obregon et al., 2004), così come più recentemente si è rivelata essere dannosa per le funzioni motorie che

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seguono un lesione traumatica cerebrale o un ictus (Thornton et al., 2010).

Cellule Gliali e sistema nervoso

Le cellule gliali (chiamate anche nevroglia o glia) sono cellule non-neuronali che svolgono un ruolo di supporto nel trasferimento di sostanze nutritive dai capillari ai neuroni, partecipano alla formazione e al mantenimento della barriera emato-encefalica, regolano l’ambiente intercellulare, forniscono l’isolamento mielinico degli assoni, forniscono un supporto meccanico ai neuroni, agiscono come fagociti per rimuovere gli agenti patogeni e neuroni morti, giocano un ruolo nel presentare gli antigeni al sistema immunitario. Recenti evidenze suggeriscono che le cellule gliali partecipano anche ad alcuni aspetti della trasmissione sinaptica. Si pensa che il numero di cellule gliali nel sistema nervoso sia ben 10 volte superiore ai neuroni. I tipi principali di cellule gliali nel SNC sono gli astrociti, oligodendrociti (che producono mielina), e microglia (che agiscono come i fagociti del sistema immunitario) (Dogmei Cui, 2012, Figura 10). Negli ultimi anni molte evidenze sono state raccolte sul possibile ruolo delle cellule gliali nelle dinamiche funzionali di network neuronali a livello del SNC (Haydon and Carmignoto, 2006). In particolare, la sottopopolazione gliale astrocitaria interviene nella modulazione della trasmissione sinaptica e portano sulla loro superficie recettori per la SP,

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cosa che lascia intravedere un ruolo importante di questa tachichinina nelle interazioni tra sistema nervoso e sistema immunitario (Volterra and Meldolesi, 2005). La generazione da parte delle cellule gliali di componenti pro infiammatori e immunoregolatori in risposta all’attivazione dei recettori della SP, può essere rilevante per le risposte infiammatorie del SNC ed enfatizzare il concetto di neuromodulazione (Hartung et al., 1988).

A livello del SNE i neuroni e i loro prolungamenti sono supportati da numerose cellule gliali. Furono descritte da Dogiel (1899) cellule satelliti nucleate (cellule gliali) che circondano il corpo cellulare dei nervi dei gangli enterici, ed in seguito studi microscopici hanno mostrato la loro presenza sia nei gangli che nei processi nervosi dei plessi GI intramuscolari (cellule di Schwann) (John Barton Furness, 2006).

La glia enterica esprime la proteina gliale fibrillare acidica (GFAP) (Figura 11) (Jessen and Mirsky, 1980), come la glia del SNC (figura 12), e svolge un ruolo importante intervenendo nei complessi meccanismi di modulazione della risposta infiammatoria intestinale, come la produzione di interleuchine e di antigeni di istocompatibilità di classe II.

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Figura 10 . Tipi di cellule gliali.

Le cellule gliali hanno funzione di sostegno, protezione e trofismo per i neuroni, ed assicurano il loro isolamento (Dogmei Cui, 2012).

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Figura 11 Marcatura immunoistochimica delle cellule gliali (GFAP) di ganglio

mienterico in campione di colon umano (Ippolito et al., 2009).

Figura 12. Cellule Gliali di SNC di ratto (GFAP) (microfotografia da Orchinik Lab,

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OBIETTIVO

Sulla base delle scarse conoscenze sulla fisiopatologia della dismotilità intestinale associata alla MP, il nostro studio si pone l’obiettivo di

esaminare le alterazioni morfo-funzionali del compartimento

neuromuscolare colico in un modello sperimentale di MP. A questo proposito sono stati studiati i processi di riarrangiamento del compartimento neuromuscolare e la funzione contrattile del colon analizzando in particolare la componente eccitatoria tachichininergica.

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MATERIALI E METODI

Animali

Ratti Sprague-Dawley albini, 200-250g di peso corporeo, sono stati usati per tutto lo studio. Gli animali sono stati alloggiati, tre per gabbia, in camere a temperatura controllata con un ciclo di luce di 12 ore a 22-24 °C e al 50-60% di umidità e sono stati nutriti con mangime standard e acqua del rubinetto ad libitum. La stabulazione degli animali è stata condotta in ottemperanza alle norme contenute nella direttiva n° 86-60 della Comunità Economica Europea, riconosciuta ed adottata in Italia.

Induzione del modello sperimentale di MP

Gli animali sono stati anestetizzati con 50 mg/kg di sodio tiopentale e introdotti nello stereotaxic frame (Stoeling, Wood Dale, IL, USA). In un gruppo di ratti, è stata iniettata 6-OHDA (7.5 μg/3 μL, misurati come base libera) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) disciolta in soluzione salina contenente 0.02% di acido ascorbico (Sigma-Aldrich), unilateralmente in due siti del fascio destro mediale prosencefalico, alle seguenti coordinate (mm): (i) AP=−4.0, ML=−0.8, DV=−8.0, tooth bar at +3.4 (9 μg/3 μL); (ii)

AP=−4.4, ML= −1.2, DV= −7.8, tooth bar at −2.4 (Blandini et al., 2009). Le

iniezioni sono state fatte a 1 μL/min, usando una siringa Hamilton da 10 μL con un ago di misura 26. Dopo l’iniezione l’ago è stato lasciato nel

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posto per 5 minuti prima di essere ritratto, per permettere la completa diffusione del mezzo, e le ferite sono state chiuse con clip. L’area controlaterale (tratto nigrostriatale destro) serve da controllo interno. Ratti controllo (n=10) sono stati sottoposti a operazione stereotassica di tipo sham. Gli animali sono stati sacrificati a 28 (n=10) e 56 (n=10) giorni dall’infuzione di 6-OHDA. I campioni intestinali sono stati trattati per esperimenti immunoistochimici e funzionali come segue.

Allestimento dei campioni tissutali di colon

I campioni di colon raccolti sono stati ridimensionati in piccoli frammenti ed immediatamente fissati in soluzione fredda di formaldeide 4% per 24h. Successivamente sono stati lavati con soluzione PBS 1% (4v) e disposti in etanolo al 70%. Quindi sono stati processati con gradazioni di alcool crescenti fino all’assoluto, disposti in xilene e quindi inclusi in paraffina. In seguito sono stati tagliati al microtomo in fette di 5 micrometri, trasversalmente all’asse maggiore del lume intestinale per ottenere sezioni longitudinali dello strato di muscolatura circolare e dei gangli mienterici. L’aspetto morfologico dei campioni di colon è stato valutato su sezioni colorate con ematossilina ed eosina.

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Protocolli per l’indagine immunoistochimica

I campioni di colon sono stati esaminati tramite reazioni di immunoistochimica per i seguenti parametri: a) densità dei neuroni

mienterici HuC/D+_{, con anticorpi specifici per le proteine neuronali HuC e}

HuD, membri della famiglia delle proteine Elav, utilizzati come marcatori neuronali; b) distribuzione ed espressione quantitativa della glia mienterica con anticorpi specifici per la proteina fibrillare acidica gliale (GFAP), marcatore delle cellule gliali; c) espressione di anticorpi specifici per SP (Tabella 1).

Prima dell’utilizzo le sezioni sono state sparaffinate, reidratate quindi processate al fine di smascherare i siti antigenici con tampone citrato in microonde (GFAP) o bagnetto a 90°C (SP). Quindi sono state bloccate le perossidasi endogene con perossido d’idrogeno 1% in metanolo (HuC/D, GFAP) o con perossido d’idrogeno 3% in acqua distillata (SP). In seguito sono stati bloccati i siti aspecifici con incubazione a 37°C con siero di capra, quindi sono stati incubati overnight a 4°C con i rispettivi anticorpi primari, diluiti in opportune soluzioni (Tabella 1). Successivamente i campioni sono esposti a immunoglobuline biotinate, a complesso streptavidina-perossidasi, infine trattati con il substrato cromogeno 3-3’diamminobenzidina tetraidrocloruro, al fine di ottenere una reazione di colorazione marrone. I campioni sono stati quindi controcolorati con

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ematossilina e quindi esaminati al microscopio ottico LEICA DMRB (Leica Mycrosem, Cambridge, UK), acquisendo le immagini con camera digitale (Leica Mycrosem, Cambridge, UK).

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Identificazione e analisi quantitativa delle cellule gangliari

I neuroni mienterici, immunoreattivi per HuC/D sono stati valutati quantitativamente secondo il protocollo seguente. Per ciascuna sezione sono stati considerati 15 campi microscopici selezionati in modo random, focalizzati sulla linea dei gangli mienterici. I campi sono stati acquisiti e valutati in sequenza fino ad un massimo di 15. Le sezioni sono state esaminate all’ingrandimento del x400 con microscopio ottico equipaggiato di fotocamera digitale per l’acquisizione, che ha permesso di digitalizzare le immagini e di esaminarle con il sistema di analisi di immagine (Image Analysis System Quantiment, Cambridge Instruments, Cambridge UK) (Figura 13).

Le cellule neuronali HuC/D+ _{presenti nei gangli sono state contate e}

rapportate alla rispettiva area gangliare, esprimendole quindi come percentuale rispetto all’area stessa. L’area gangliare è stata stimata delimitandone i confini utilizzando il sistema di analisi d’immagine sopracitato.

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Tabella 1. Anticorpi usati in questo studio

Anticorpi primari

Clone

Specie Animale

Diluizione Codice e Ditta Bibliografia

HuC/D MAb Mouse 1:250

A-21271, Molecular

Probes, Eugene, USA

Bernardini N, et al. 2012

GFAP PAb Rabbit 1:100

Z0334,

Dakocytomation,

Glostrup, Denmark

Van Ginneken C, et al. 2011

SP MAb Rat 1:2000 Sc-21715, Santa Cruz Biotech, California, USA Crowe R, et al. 1986 Anticorpi secondari Specie Animale

Diluizione Codice e Ditta Bibliografia

Biotinylated anti-mouse IgG (H+L) Goat 1:200 BA-9200, Vector Lab, Burlingame, USA Bernardini N, et al. 2012. Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) Goat 1:200 BA-1000, Vector Lab, Burlingame, USA Bernardini N, et al. 2012

HuC/D, proteine neuronali umane C e D; GFAP, proteina gliale fibrillare acidica; SP, sostanza P ; H+L, catene

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I risultati ottenuti per ciascun campione sono stati espressi come media ± deviazione standard (DS) del rapporto tra la sommatoria del numero di cellule immunoreattive e la sommatoria delle aree gangliari (∑ n°cellule/∑ area gangliare) dei 15 campi di ciascuna delle sezioni analizzate per ciascun campione.

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Figura 13. Esempio di analisi per gangli mienterici di colon.

Linea neuromuscolare al confine tra muscolatura circolare e longitudinale di colon umano con gangli mienterici marcati per HuC/D (colorazione marrone) lungo la quale sono stati acquisiti i campi microscopici.

a

. Esempio di una sequenza di sette campi fotografici acquisiti (CM, muscolatura circolare; MY, gangli mienterici; LM, muscolatura longitudinale).

b

. Esempio di campo microscopico ad ingrandimento x400 con la rispettiva area gangliare marcata in rosso. Barra 50 µm (Ippolito et al., 2009).

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Determinazione

quantitativa

della

immunopositività

neuromuscolare di GFAP e SP

Per valutare la positività per GFAP e SP nel compartimento neuromuscolare, sono stati catturati 20 campi microscopici per ciascuna sezione, ad un ingrandimento x200 ed analizzati con sistema di analisi d’immagine Image System Quantiment (Qwinv 500 plus). Ciascun campo fotografico è stato sottoposto ad un livello soglia d’intensità (da 150/255 a 185/255 a seconda del rapporto segnale/rumore di fondo) per evidenziare l’area immunoreattiva che è stata poi espressa come percentuale dell’area tissutale totale esaminata (percerntuale di pixel positivi [PPP]) secondo Bettolli et al. (2008) (Figura 14).

Per ciascun campione la percentuale di area positiva è stata espressa come media ± DS dell’area positiva dei 20 campi esaminati per sezione. Per ciascun gruppo il valore dell’area positiva è stata espressa come media ± DS delle singole percentuali d’area valutate in tutti i campioni patologici a 28 o 56 giorni, o campioni di controllo.

Per stimare le differenze statistiche tra i gruppi, è stato utilizzato il test T di Student (a due code). Un valore di P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Figura 14. Esempio di analisi d’immagine, evidenziata zona di immunoreattività

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Analisi funzionale dell’attività contrattile intestinale

Il colon rimosso è stato immerso in soluzione di Krebs, e da esso sono stati prelevati campioni di muscolatura longitudinale e circolare di approssimativamente 3 mm di spessore e 20 mm di lunghezza. I preparati sono stati allestiti in bagni per organi isolati contenenti soluzione di Krebs, mantenuta ad una temperatura di 37°C e gorgogliata con una miscela al 95% di O2 e 5% di CO2. I preparati sono stati orientati lungo

l’asse longitudinale e circolare rispettivamente, e sono stati connessi con trasduttori di forza isometrici (2Biological Instruments, Besozzo, VA, Italy). La soluzione di Krebs presentava la seguente composizione (mM): NaCl 113, KCl 4,7, CaCl2 2,5, KH2PO4 1,2, MgSO4 1,2, NaHCO3 25 e glucosio 11,5 (pH 7,4 ± 0,1). A ciascun preparato è stato permesso di equilibrarsi per almeno 30 min, intervenendo con lavaggi a intervalli di 10 minuti. I campioni sono stati mantenuti tra due elettrodi coassiali di platino posizionati ad una distanza di 10 mm dall’asse longitudinale del preparato, capaci di evocare una stimolazione elettrica transmurale (SET) tramite stimolatore BM-ST6 (Biomedica Mangoni, Pisa, Italy).

Gli stimoli elettrici sono stati applicati come segue: singoli treni di 10 secondi (sSET), costituiti da impulsi d’onda quadra (0.5 millisecondi, 30 mA). Alla fine del periodo di incubazione, ciascun preparato è stato sottoposto a stimolo elettrico (10 Hz) ogni 20 minuti, fino all’ottenimento di risposte contrattili riproducibili (di solito dopo 2 o 3 stimolazioni). Le

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curve di risposta in frequenza, nel range di frequenze da 1 a 20 Hz, sono state costruite secondo le condizioni dei diversi esperimenti in vitro qui riportati.

Nella prima serie di esperimenti i preparati di colon distale sono stati mantenuti in soluzione di Krebs standard. Le risposte contrattili sono state evocate mediante l’applicazione di treni di impulsi elettrici della durata di 10 secondi, alla frequenza di 1, 5, 10 e 20 Hz (0,5 ms, 30 mA), applicati ad intervalli di 20 minuti. Nella seconda serie di esperimenti, gli impulsi elettrici sono stati applicati a preparati mantenuti in soluzione di Krebs contenente L-NAME 100 μM (inibitore della NO sintetasi), guanetidina 10 μM (bloccante adrenergico), atropina (1 μM), GR159897 (antagonista dei recettori NK2, 1 μM) e SB218795 (antagonista recettori NK3, 1 μM), al fine di esaminare i patterns delle vie eccitatorie tachichininergiche della neuromuscolare del colon. Nella terza serie, le risposte contrattili sono state indotte da attivazione farmacologica diretta dei recettori tachichininergici localizzati sulle cellule muscolari lisce. A questo proposito, i preparati colici sono stati mantenuti in soluzione di Krebs contenente tetrodotossina (1 μM) e stimolati con SP esogena (SP, 0.001-10 μM). I risultati sono stati espressi come percentuale dei valori dei dati controllo ed espressi con valore medio ± DS. La significatività delle differenze è stata valutata su dati originali, prima della normalizzazione percentuale, tramite il test T di Student per

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dati spaiati, e i valori P <0.05 sono stati considerati significativi; n indica il numero di esperimenti. I calcoli sono stati eseguiti con software commerciale (GraphPad Prism, version 0.3 from GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

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RISULTATI

Neuroni mienterici

I corpi cellulari dei neuroni mienterici dei colon degli animali di controllo hanno presentato un diverso grado di reattività al marcatore HuC/D. In particolare, i pirenofori dei neuroni sono stati identificati grazie alla colorazione positiva del loro nucleo e/o citoplasma. Gli animali con MP

non hanno presentato alterata espressione HuC/Dnei gangli mienterici.

L’analisi quantitativa non ha riportato variazioni significative della densità neuronale nei gangli degli animali patologici, sia nel gruppo di 28 giorni che nel gruppo di 56 giorni (Figura 15). È stata osservata solo una lieve tendenza all’aumento della densità neuronale ad entrambi i tempi negli animali con MP.

Cellule gliali mienteriche

La componente gliale dei gangli mienterici è risultata altamente reattiva a GFAP e significativamente aumentata nei ratti con MP a 28 giorni. Il gruppo di ratti trattati sacrificati al 56° giorno mostra un recupero significativo rispetto al gruppo 28 giorni, ritornando ai valori di controllo (Figura 16).

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Immunoreattività per SP

La positività per l’anticorpo anti-SP è stata riscontrata sia nei gangli che nelle fibre presenti nella tonaca muscolare. Gli animali con lesione nigrostriatale mostrano un aumento dell’espressione di SP rispetto al controllo: in particolare al 28° giorno si osserva un incremento significativo rispetto al controllo, che aumenta ulteriormente negli animali con MP a 56 giorni (Figura 17).

Attività contrattile della muscolatura liscia circolare e

longitudinale

Durante il tempo di stabilizzazione, la maggiorparte dei preparati colici ha mostrato una rapida attività spontanea, generalmente stabile in tutti gli esperimenti. Le risposte elettricamente evocate consistevano in contrazioni fasiche, seguite in alcuni casi da post-contrazioni di variabile ampiezza (non mostrato). In preparati colici longitudinali (a) e circolari (b) mantenuti in soluzione di Krebs contenente L-NAME 100 μM (inibitore della NO sintetasi), guanetidina 10 μM (bloccante adrenergico), atropina (1 μM), GR159897 (antagonista dei recettori NK2, 1 μM) e SB218795 (antagonista recettori NK3, 1 μM), le contrazioni tachichininergiche elettricamente evocate, sensibili ad L-732.138, sono aumentate in entrambi i gruppi MP, in confronto con il controllo (Figura 18a, 18b). L’esposizione dei preparati colici circolari e longitudinali alla SP esogena

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(0.001-10 μM) in presenza di tedrototossina (1 μM), evoca effetti contrattili concentrazione-dipendenti, che appaiono aumentati nei ratti a 28 e 56 giorni dopo l’iniezione di 6-OHDA, in confronto con il controllo (Figura 19a, 19b).

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Figura 15. Gangli mienterici di sezioni a tutto spessore di colon distale di ratto controllo e con Parkinson sperimentale.

(A) Immagine rappresentativa della immunoreazione con il marcatore specifico neuronale HuC/D (marrone) nei gangli mienterici in ratti controllo. (B-C) Animali trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni, rispettivamente. Dal confronto con i controlli, i neuroni mostrano una morfologia intatta, una forte immunoreattività HuC/D ed una simile densità a livello dei gangli mienterici in tutti i gruppi di animali. (D) Il grafico a colonne mostra la densità neuronale (neuroni/mm2_{) ± DS dei gangli mienterici di ciascun gruppo.}

D B A

C

6-OHDA 28 giorni

6-OHDA 56 giorni

Densità

49

b

a: p<0.05 vs Controllo; b: p<0.05 vs 6-OHDA 28 giorni

Figura 16. Gangli mienterici di sezioni a tutto spessore di colon distale di ratto controllo e con Parkinson sperimentale.

(A) Immagine rappresentativa della immunoreazione con il marcatore gliale GFAP (marrone) nei gangli mienterici in ratti controllo. (B-C) Animali trattati con 6OHDA a 28 e 56 giorni, rispettivamente. Dal confronto con i controlli, si evidenzia l’aumento significativo del GFAP a livello dei gangli mienterici a 28 giorni e il ritorno a valori controllo a 56 giorni. (D) Il grafico a colonne mostra la percentuale dei pixel positivi (PPP) ± DS delle cellule gliali GFAP positive nei gangli mienterici e nella neuromuscolare di ciascun gruppo.

A B

C D a

6-OHDA 28 giorni

50

Figura 17. Gangli mienterici di sezioni a tutto spessore di colon distale di ratto controllo e con Parkinson sperimentale.

(A) Immagine rappresentativa della immunoreazione con il marcatore specifico per la SP nei gangli mienterici in ratti controllo. (B-C) trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni, rispettivamente. Dal confronto con i controlli, si evidenzia l’aumentata positività della SP a livello dei gangli mienterici e della tonaca muscolare sempre maggiore nei due tempi. (D) Il grafico a colonne mostra la percentuale dei pixel positivi (PPP) ± DS della SP nei gangli mienterici e nella neuromuscolare di ciascun gruppo.

A _B C D a b a: P<0.05 vs Controllo; b: P<0.01 vs Controllo

PPP

6-OHDA 28 giorni

6-OHDA 56 giorni

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Controllo Controllo Controllo 6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni

6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni

Controllo 6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni

6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni Frequenza (Hz) Frequenza (Hz) Tensione (g/g tessuto) Tensione (g/g tessuto) *P<0.05 vs controllo Figura 18.

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Figura 18. Preparati di muscolatura liscia longitudinale (a) e circolare (b) isolati

da animali controllo e ratti trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni e mantenuti in soluzione di Krebs, contenente L-NAME (100 µM), guanetidina (10 µM), atropina (1 µM). Le risposte contrattili sono state indotte da stimolazione elettrica (ES. 0.5 ms, 30 mA, 10 s, 1-20 Hz). Ciascuna colonna riporta la media ± DS, valore ottenuto da 3 esperimenti. *P<0.05; differenza significativa verso il controllo.

Figura 19. Preparati di muscolatura liscia colica isolati da ratti controllo o

trattati con 6-OHDA a 28 e 56 giorni e mantenuti in soluzione di Krebs standard, contenente tetrodotossina (1 µM). La risposta contrattile dei preparati di muscolatura liscia longitudinale (a) e circolare (b) indotta da crescenti concentrazioni di SP esogena (0.01-10 µM). Ciascun punto presenta la media ± DS, valore ottenuto da 8 esperimenti. *P< 0.05; differenza significativa rispetto al controllo.

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Controllo Controllo

6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni

Controllo 6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni

6-OHDA 28 giorni 6-OHDA 56 giorni Sostanza P (M) Tensione (g/g tessuto) Tensione (g/g tessuto) *P<0.05 vs controllo Figura 19. Sostanza P (M)

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DISCUSSIONE

La MP si presenta come patologia neurologica multisistemica caratterizzata da disturbi della motilità somatica e, molto spesso, anche viscerale (disfagia, gastroparesi, costipazione). Tali fenomeni in particolare il rallentamento dello svuotamento gastrico e la dismotilità intestinale, contribuiscono direttamente alla morbosità della MP poiché possono interferire sulla farmacocinetica dei comuni trattamenti antiparkinson, complicando la gestione clinica della patologia (Annerino et al., 2012). Inoltre è stato recentemente osservato che tali disfunzioni digestive possono precedere anche di molti anni la comparsa dei primi sintomi della MP. Nonostante la rilevanza clinica dei disturbi GI nei pazienti con MP, poco si sa sulla loro eziopatogenesi e fisiopatologia. Pertanto, abbiamo ritenuto interessante studiare gli aspetti morfo-funzionali del compartimento neuromuscolare del colon in un modello sperimentale di MP indotto nel ratto con iniezioni intracerebrali di 6-OHDA. In particolare, abbiamo effettuato uno studio morfo-funzionale su neuroni e glia dei gangli mienterici e sulla tonaca muscolare del colon. Infatti, i neuroni enterici e le cellule gliali rappresentano i principali regolatori delle funzioni motorie della parete intestinale, garantendo uno svolgimento coordinato dell’attività motoria della muscolatura liscia (Quigley, 2010; Wood, 2008). Di conseguenza, alterazioni morfologiche

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e/o funzionali di tali strutture si traducono in un alterato controllo della motilità intestinale con conseguente comparsa di disturbi digestivi.

Dai risultati del nostro studio è emerso che, in seguito a denervazione nigrostriatale dopaminergica, si assiste ad un rimodellamento sia morfologico che funzionale del compartimento neuromuscolare colico. In particolare al 28° giorno dall’induzione della lesione abbiamo osservato un aumento significativo della componente gliale a livello dei gangli mienterici con parallela tendenza all’incremento, anche se non significativo, dei neuroni. La positività per SP ha presentato un progressivo aumento, raggiungendo valori di significatività al 28° giorno e di alta significatività al 56°. Questo incremento è risultato in accordo con i dati funzionali di incremento del tono tachichininergico ottenuti negli animali con MP, dato che può essere tra le cause scatenanti i disturbi GI nella MP.

A seguito dell’aumento dell’attività del sistema tachichininergico, ci attenderemmo una downregulation dei recettori per SP a livello della componente muscolare. Dai dati ottenuti nel nostro studio si evidenzia invece una aumentata densità recettoriale per SP nel colon degli animali con MP, come mostrato dalla risposta contrattile a SP esogena in presenza di tetrodotossina, che risulta significativamente esaltata negli animali lesionati.

56

Pertanto le osservazioni raccolte dal presente studio sull’incremento del

controllo motorio tachichininergico, associato all’aumento

dell’espressione di SP e della densità recettoriale tachichininergica nel compartimento neuromuscolare colico, possono essere compatibili con le disfunzioni motorie intestinali associate alla MP.

Per quanto concerne lo studio morfologico dei neuroni mienterici le valutazioni sono state condotte impiegando come marcatori gli antigeni HuC e HuD. Tali proteine, essenziali nell’istogenesi dei neuroni enterici (Perrone-Bizzozero and Bolognani, 2002), sono coinvolte anche nelle loro funzioni trofiche e di sopravvivenza (De Giorgio et al., 2003). La densità dei neuroni mienterici negli animali con MP non ha presentato variazioni significative rispetto ai controlli, in accordo con la letteratura ed i dati raccolti da Colucci et al. (2012). Questo dato, insieme all’aumento dell’espressione di neuronale di SP, suggerisce che gli animali con MP presentano una variazione del coding neurochimico in una popolazione neuronale stabile, aprendo nuove prospettive di studio.

L’incremento dell’attività del sistema tachichininergico riscontrato nel nostro studio è in accordo anche con osservazioni in vitro su neuroni striatali di ratto, trattate con 6-OHDA, che presentavano un aumento dell’espressione di SP (Thornton et al., 2010). Il trattamento con 6-OHDA provoca quindi aumento di SP nei neuroni sia a livello centrale che enterico. Una spiegazione di tale variazione a livello centrale è stata data

57

sulla base del meccanismo d’azione della DA che controlla il release di SP attraverso un meccanismo di feedback positivo. Il trattamento con 6-OHDA, meccanisticamente simile alla DA, potrebbe indurre una attivazione dei recettori dopaminergici D1 sulle proiezioni neuronali striatali contenenti SP, inducendone così il rilascio. In più, I neuroni dopaminergici esprimono NK1, perciò la SP endogena rilasciata da queste proiezioni neuronali può legare i recettori NK1 e ponteziare eventualmente il rilascio di DA. L’aumento di SP causato dalla 6-OHDA può essere quindi spiegato sulla base di questo meccanismo di feedback positivo.

Per quanto riguarda il coinvolgimento della componente gliale, possiamo dire che gli animali con MP al 28° giorno hanno presentato incrementi significativi della glia mienterica. Questa risposta è interpretabile come gliosi reattiva, fenomeno che si presenta a seguito di lesioni della parete GI di vario tipo, ma può essere vista anche in chiave di neurogenesi, dato il potenziale staminale della glia enterica, ampiamente dimostrato anche in modelli animali (Laranjeira et al., 2011). È nota inoltre una attività gliale di neuroprotezione, svolta mediante la riduzione del glutatione (Abdo et al., 2010). È da notare che nel nostro modello di MP la risposta gliale è concomitante all’aumento di SP, cosa che può rivestire un ruolo di rilievo nella fisiopatologia della MP. Infatti questa tachichinina induce fenomeni di infiammazione neurogenica: questa è una reazione

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infiammatoria secondaria alla stimolazione di fibre nervose, le quali, rilasciando SP, inducono aumento della permeabilità microvascolare, con formazione di edemi (Hokfelt et al., 2000). Questo processo, già descritto nel danno in strutture periferiche (Turner et al., 2011), è stato recentemente descritto anche nel SNC (Donkin et al., 2009; Nimmo et al., 2004; Vink and van den Heuvel, 2010). L’infiammazione neurogenica è stata correlata anche alla perdita dell’integrità della barriera emato-encefalica (BEE) ed è stata quindi proposta come una possibile causa della progressione della MP (Kortekaas et al., 2005; Rite et al., 2007). A tal riguardo, studi sul microambiente dei plessi mienterici, in particolare sulla barriera vascolare neuro enterica dei gangli, potrebbero aprire interessanti linee di ricerca per la comprensione della fisiopatologia dei disturbi motori GI associati alla MP.

A livello del SNC nella MP sono coinvolti anche molti altri fenotipi cellulari, oltre ai neuroni, come ad esempio la microglia, cellule che appartengono al sistema monocita-macrofagico. Una attivazione di tale popolazione cellulare è stata osservata nel SNC di animali con MP (Depino et al., 2003), così come nelle PET scans e nei campioni post-mortem di pazienti parkinsoniani (McGeer and McGeer, 2008; Mosley et al., 2006). La microglia attivata può danneggiare le cellule limitrofe tramite il rilascio di citochine pro-infammatorie, ossido nitrico (NO) e specie reattive dell’ossigeno, oltre a svolgere deposizione di α-sinucleina

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(Croisier et al., 2005) e fagocitosi di neuroni dopaminergici (McGeer et al., 1988).

Accanto alla microglia anche gli astrociti sono coinvolti nella risposta cellulare del SNC in modelli animali di MP. In particolare, è stata dimostrata una attivazione gliale, ma il ruolo specifico degli astrociti nella patogenesi dei disturbi della MP rimane ancora oscuro (Takagi et al., 2007, Chung et al., 2010). La capacità degli astrociti di sintetizzare glutatione, mirata alla neuro protezione e dimostrata in condizioni di stress ossidativo (Desagher et al., 1996), potrebbe essere un meccanismo a favore di neuroni del SNC in degenerazione nella MP. Dato che le cellule gliali dei plessi enterici sono l’equivalente periferico degli astrociti centrali, la gliosi reattiva osservata nel nostro studio è in accordo con i dati soprariportati a livello centrale; pertanto, analoghi meccanismi di neuro-protezione da parte della glia potrebbero essere suggeriti anche a livello del sistema nervoso enterico in corso di MP.

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CONCLUSIONI

Dai risultati ottenuti in questo studio possiamo concludere che il modello di MP sperimentale, indotto tramite iniezioni nigrostriatali di 6-OHDA, è associato con modificazioni neurochimiche funzionali e istopatologiche del compartimento neuromuscolare colico.

Questi dati possono rappresentare il punto di partenza sia per studi volti a comprendere più a fondo i meccanismi fisiopatologici della dismotilità intestinale associata alla MP, che per la messa a punto di nuove strategie terapeutiche volte a migliorare i disturbi digestivi e la qualità della vita del paziente con MP.

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