OPN e punteggio MELD

Come riportato in letteratura (Wiesner et al., 2001, 2003) i soggetti con un punteggio MELD <9 hanno una mortalità di circa il 2%, mentre quelli con un punteggio MELD compreso tra 10 e 19 hanno una mortalità del 6,0%, tra 20 e 29 una mortalità del 19,6%, tra 30 e 39 hanno sperimentato una mortalità del 52,6% e per i soggetti con MELD> 40 la stima della mortalità è di circa 71,3% a tre mesi. I pazienti arruolati nello studio non hanno superato il punteggio MELD di 13, e per questo sono stati classificati come: 0 (se donatori), 1 se con (MELD<9) e 2 se con (MELD tra 10-13). Come riportato in Figura 10, l’espressione a livello di mRNA di tutte e tre le isoforme dell’OPN è risultata più alta nei soggetti con HCC in funzione del punteggio MELD.

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Figura 10: Espressione di OPN e delle due isoforme nei donatori e nei riceventi con differente punteggio MELD. a) Profilo trascrittomico di OPN-a; b) Profilo trascrittomico di OPN-b; c) Profilo trascrittomico di OPN-c

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Un risultato simile è stato ottenuto anche per l’espressione dei livelli della trombina (Fig.11a), del collagene IV-dominio 7s (Fig.11b), dell’IL-6 (Fig.11c) e del TNF- (Fig.11d).

Figura 11: a) Profilo trascrittomico della Trombina; b) Profilo trascrittomico

dell’Interleuchina-6; c) Profilo trascrittomico del Collagene IV-dominio 7s; d) Profilo trascrittomico del fattore di necrosi tumorale α

Anche l’espressione a livello di mRNA del gene Notch-1 è risultata significativamente più alta nei pazienti con MELD compreso tra 10 e 13 rispetto a quella osservata per i soggetti donatori e nei pazienti con un punteggio MELD inferiore a 9 (DL: 2,4 ± 0,56, MELD <9: 2,8 ± 1,23, MELD 10-13: 14,8 ± 5,68, p = 0,002 vs MELD 2 e p = 0,003 MELD 1 vs MELD 2). I livelli plasmatici di OPN sono risultati simili nei donatori e nei pazienti con un punteggio MELD <9, ma sono risultati significativamente aumentati nei pazienti con MELD compreso tra 10 e 13, come mostrato nella figura 12a.

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Figura 12: a) livelli plasmatici di OPN; b) livelli tessutali di OPN

I risultati relativi all’estrazione tessutale hanno mostrato un andamento simile a quello ottenuto con gli studi di espressione come mostrato in Figura 12b. Inoltre considerando solo i campioni relativi ai pazienti riceventi è stata osservata una correlazione significativa tra il punteggio MELD ed i livelli plasmatici di OPN (R = 0,63, p= 0,05)

Capitolo 5

CONCLUSIONI

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I risultati del nostro studio hanno riportato un aumento significativo sia della concentrazione plasmatica sia della concentrazione tessutale di OPN nei pazienti affetti da HCC rispetto ai donatori confermando dati recenti della letteratura che proponevano la determinazione dei livelli plasmatici di OPN, in pazienti con HCC, come fattori prognostici dopo resezione o trapianto del fegato (Nagoshi S, 2014; Abu E.L. et al., 2011). Dati della letteratura riportano inoltre che in pazienti con HCC i livelli di OPN plasmatica risultano più alti di quelli dei soggetti con normale funzione epatica o di quella dei pazienti con cirrosi o epatite cronica (Shang S. et al., 2012; Lin F. et al., 2011). L’espressione di OPN è risultata aumentata significativamente nel tessuto epatico di pazienti affetti da HCC (Iqbal J. et al., 2013), ma, nonostante sia noto che l’OPN ha un ruolo importante nella metastasi epatica, il meccanismo molecolare responsabile di questo processo non è ancora chiaro. Recentemente, in un modello in vitro di cellule HCV-HCC è stato dimostrato che l’HCV può indurre espressione e secrezione di OPN attraverso un’alterata omeostasi dei canali del calcio a livello del reticolo endoplasmatico e attraverso un aumento delle specie reattive dell’ossigeno negli organuli mitocondriali (Cao D.X. et al., 2012). Nel nostro studio oltre ad un aumento dell’OPN-a è stato osservato un aumento dell’espressione delle isoforme OPN-b e OPN-c suggerendo l’ipotesi che l’infezione da HCV possa promuovere la formazione delle isoforme di OPN. In letteratura è possibile trovare risultati contrastanti riguardo alla possibile presenza di una o più isoforme di OPN, dimostrando che il risultato può essere influenzato dal tipo di materiale biologico utilizzato. Come riportato in letteratura (Chae S. et al., 2009) l’espressione delle isoforme di OPN può influenzare l’attività migratoria associata alle metastasi in tessuti con HCC rendendo così importante l’osservazione del loro coinvolgimento nello sviluppo della patologia. La correlazione tra l’OPN-a e l’OPN-b insieme alla mancanza di correlazione con l’OPN-c, osservata nei nostri pazienti, potrebbe sostenere l’ipotesi di Chae S. et al. in cui si sostiene che le diverse isoforme possano

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rispecchiare fasi diverse dello sviluppo di HCC. Nel distretto epatico l’OPN, secreta dalle cellule di Kupffer, è in grado di promuovere la loro infiltrazione nelle zone necrotiche (Miyazaki S. et al., 1999). Nel nostro studio, dove per la prima volta campioni ematici e campioni tessutali epatici degli stessi pazienti sono stati analizzati, una stretta correlazione tra la concentrazione plasmatica e la concentrazione proteica tessutale di OPN è stata rilevata sia nei soggetti donatori che in quelli riceventi, sottolineando una diretta produzione da parte degli epatociti in presenza o meno di HCC. Inoltre è stata notata una riduzione dei livelli plasmatici dell’OPN nei pazienti riceventi 6 mesi dopo il trapianto di fegato. Tali livelli non raggiungono livelli significativi probabilmente a causa del basso numero di pazienti analizzato, ma suggeriscono un ruolo importante dell’OPN nello screening post-trapianto. Nei soggetti studiati in questo lavoro di tesi è stata inoltre valutata, per la prima volta, la concentrazione plasmatica e tessutale dell’OPN come anche l’espressione, a livello di mRNA, delle varie isoforme dell’OPN in funzione della gravità clinica determinata con il punteggio MELD. Sono state ottenute delle differenze significative tra i soggetti donatori e i pazienti riceventi con punteggio MELD compreso tra 10 e 13 indicando che sia le elevate concentrazioni plasmatiche di OPN sia l’aumentata espressione di mRNA del biomarcatore potrebbero indicare una mortalità al terzo mese di circa il 6%. Al contrario le concentrazioni plasmatiche di OPN e i livelli di espressione delle isoforme non erano in grado di discriminare i donatori dai pazienti HCC con punteggio MELD inferiore a 9 sebbene l’espressione delle isoforme di OPN mostrassero un aumento in funzione della gravità clinica che potrebbe suggerire un loro ipotetico ruolo nella progressione dell’epatocarcinoma. Un andamento simile è stato osservato per la trombina i cui livelli di espressione aumentano fino a raggiugere livelli di significatività in pazienti riceventi con MELD inferiore a 9. Per confermare la progressione della patologia sono state osservate le espressioni a livello di mRNA di Notch-1, IL-6, TNF e del Collagene IV-dominio7s che

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sono risultate aumentate in funzione della gravità clinica. La via del segnale Notch-1 sembra essere coinvolta nello sviluppo di HCC. Recentemente è stata osservata una sotto regolazione dell’OPN in seguito all’attivazione di Notch-1, identificando nel’ OPN l’elemento chiave di questo processo (Villanueva A.et al., 2012). La prognosi e la gestione dell’epatocarcinoma sono frequentemente determinate dalla quantità presente nel fegato di fibrosi, che è considerato un elemento avverso per la rigenerazione epatica (Nagasue N. et al., 1987; Murawaki Y. et al., 1994). Recentemente il Collagene IV-dominio 7s è stato riconosciuto come un indicatore biochimico per misurare la cirrosi, la fibrogenesi e la fibrosi. La sua concentrazione sierica è indicativa della severità dell’epatite, della fibrosi epatica, ma anche del grado di danno epatico funzionale (Murawaki Y. et al., 1994). A conferma di quanto detto, anche nel nostro studio è stato osservato un aumento significativo dell’espressione di mRNA del collagene IV-dominio 7s nei soggetti riceventi rispetto ai donatori, espressione che incrementa significativamente in funzione della gravità clinica. In particolare è stata osservata una correlazione significativa tra il collagene IV-dominio 7s, l’OPN e le sue isoforme, confermando l’importante ruolo che l’OPN e le sue isoforme possono assumere in questa patologia. I risultati di questo studio indicano che la concentrazione plasmatica e tessutale di OPN, così come le sue diverse isoforme, sono espresse diversamente nell’epatocarcinoma. Il trend di OPN può essere associato ad un punteggio MELD inferiore sottolineando l’importanza del coinvolgimento di questo biomarcatore nello screening di pazienti ad alto rischio di mortalità come indicato dalla correlazione positiva osservata. La maggiore limitazione di questo studio, oltre al piccolo numero di campioni studiati, è la mancanza di campioni con punteggio MELD maggiore di 13 che non sono stati arruolati in base ai criteri utilizzati nei trapianti di fegato. Nonostante ulteriori studi siano necessari per meglio comprendere il ruolo dell’osteopontina nell’epatocarcinoma i nostri risultati forniscono nuove indicazioni sull’espressione

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dell’osteopontina in pazienti HCV-HCC e potrebbero essere considerati un utile punto di partenza per confermare l’osteopontina come un potenziale biomarcatore per seguire lo sviluppo e la progressione della patologia.

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