BN-PAGE dei complessi multiproteici delle membrane tilacoidali di diverse specie vegetal

Negli ultimi dieci anni il BN-PAGE interfacciato ad una seconda dimensione denaturante è stato il metodo di elezione per l’analisi funzionale di molti complessi multiproteici associati a diversi sistemi membranali. Il sistema più studiato è stato sicuramente quello della catena respiratoria mitocondriale [34]. Decine di studi nel corso degli anni, hanno caratterizzato tutte le subunità costituenti i complessi della membrana mitocondriale, dimostrando profonde differenze funzionali e metaboliche tra piante, batteri e funghi [89]. Il primo lavoro sulle membrane tilacoidali risale invece al 1997 quando, utilizzando il DDM come detergente, Kügler e collaboratori riuscirono a caratterizzare tutti i complessi multiproteici coinvolti nella fotofosforilazione [97]. A seguire, lo stesso protocollo di solubilizzazione è stato sfruttato per lo studio delle membrane fotosintetiche di diverse specie (cianobatteri, alghe, batteri) [98-100]. Con gli anni, oltre al DDM, sono stati sviluppati comunque altri metodi di solubilizzazione. Tra tutti, quello che prevede l’uso della digitonina, un tensioattivo naturale che sembra garantire una maggiore integrità strutturale dei complessi in virtù di una azione più “blanda”, sembra essere l’unico che, nel caso dei tilacoidi, possa garantire dei risultati comparabili a quelli ottenuti con l’uso del DDM [101]. Per i nostri studi l’utilizzo del DDM è stato comunque preferito a quello della digitonina, in quanto, sulla base delle prove da noi realizzate, non sono state riscontrate grandi differenze tra i profili elettroforetici ottenuti con i due metodi di solubilizzazione.

Per dimostrare che il bandeggio elettroforetico di un BN gel di membrane tilacoidali è indipendente dalla specie vegetale, è stato corso un gel in cui sono stati caricati contemporaneamente i tilacoidi estratti da diverse specie vegetali. Il gel in figura 3.1 compara il profilo elettroforetico dei complessi solubilizzati a partire da foglie di spinacio, soia, pomodoro, pisello, riso e mais. Per garantire un’adeguata comparazione, tutti i campioni corsi sono stati estratti, solubilizzati e corsi nelle stesse identiche condizioni sperimentali. L’analisi del gel in figura 3.1 non ha dimostrato differenze sostanziali nel bandeggio, suggerendo che il profilo elettroforetico è indipendente dalla specie prescelta. Per garantire un'identificazione

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inequivocabile di tutti i complessi separati, le bande della linea dello spinacio sono state poi identificate mediante spettrometria di massa tandem (MS/MS)[102]. Contenendo ogni banda uno o più complessi multiproteici, la digestione triptica e l’anali RP-HPLC-ESI-MS/MS ha portato alla contemporanea identificazione di più specie proteiche. La valutazione delle specie proteiche identificate ha permesso il riconoscimento dei complessi originali. La tabella 1 riporta le identificazioni delle 6 bande del gel di figura 3.1.

Figure 3.1. 1D Blue-Native PAGE dei complessi fotosintetici delle membrane tilacoidali estratte dalle specie: spinacio (linea 1), soia (linea 2), pomodoro (linea 3), pisello (linea 4), riso (linea 5) e mais (linea 6). I complessi sono stati solubilizzati utilizzando un rapporto DDM-proteina pari a 4 su ogni linea è stata poi caricata la stessa quantità di detergente (30 µg), valutata con il metodo DC protein assay (Bio-Rad). Il gel è stato solo decolorata e corso in accordo ai protocolli riportati in materiali e metodi. Sulla sinistra del gel sono indicati i complessi identificati in ciascuna banda.

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Tabella 1. Complessi identificati nel 1D BN-PAGE di tilacoidi di spinacio.

Ogni banda contiene uno o più complessi mutiproteici riconosciuti sulla base delle proteine costituenti identificate. Il numero delle bande si riferisce alla figura 3.1.

Banda 1, 565 kDa:PSI (RCI+LHCI) / PSII core dimer / ATPase

Identificazione Mascot Score Numero di peptidi Mw kDa/pI Numero di accesso NCBI

Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 [Spinacia oleracea] 103 2 83.1 / 6.74 gi|11497525 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A2 [Spinacia oleracea] 121 4 82.4 / 6.72 gi|11497524 Photosystem I reaction center subunit IV, chloroplast precursor (PSI-

E)

109 2 13.3 / 9.99 gi|131178

PSI type III chlorophyll

a/b-binding protein 167 2 29.1 / 8.61 gi|430947

Photosystem II 47 kDa protein [Spinacia oleracea]

119 3 56.2 / 6.16 gi|11497552

ATPase subunit alpha

[Spinacia oleracea] 187 5 55.5 / 5.16 ATPA_SPIOL

ATPase subunit beta

[Spinacia oleracea] 398 9 53.7 / 5.22 ATPB_SPIOL

Banda 2, 453 kDa: PSI core

Capitolo 3 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 [Spinacia oleracea] 245 4 83.1 / 6.74 gi|11497525 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A2 [Spinacia oleracea] 263 5 82.4 / 6.72 gi|11497524 Photosystem I reaction center subunit IV, chloroplast precursor (PSI-

E)

173 3 13.3 / 9.99 gi|131178

Photosystem I reaction center subunit XI, chloroplast precursor (PSI-

L) (PSI subunit V)

121 2 23.0 / 9.70 gi|3914473

Banda 3, 292 kDa: ATPase subunit / PSII core / Cyt b6/f dimer

Identificazione Mascot Score Numero di peptidi Mw kDa/pI Numero di accesso NCBI

Photosystem Q(B) protein (32 kDa thylakoid membrane protein) (Photosystem II protein D1) 165 3 38.8 / 5.29 gi|1709829 Photosystem II 47 kDa protein [Spinacia oleracea] 296 5 56.2 / 6.16 gi|11497552 Photosystem II 44 kDa protein [Spinacia oleracea] 175 3 52.0 / 6.68 gi|11497521 Photosystem II protein D2

[Spinacia oleracea] 145 3 39.5 / 5.46 gi|11497520

Apocytochrome f precursor 128 3 35.4 / 8.34 gi|544122

ATPase subunit alpha

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ATPase subunit beta

[Spinacia oleracea] 478 10 53.7 / 5.22 ATPB_SPIOL

Banda 4, 193 kDa: PSII core less CP43

Identificazione Mascot Score Numero di peptidi Mw kDa/pI Numero di accesso NCBI

Photosystem Q(B) protein (32 kDa thylakoid membrane protein) (Photosystem II protein D1) 251 4 38.8 / 5.29 gi|1709829 Photosystem II 47 kDa protein [Spinacia oleracea] 364 6 56.2 / 6.16 gi|11497552 Photosystem II protein D2

[Spinacia oleracea] 201 4 39.5 / 5.46 gi|11497520

Banda 5, 148 kDa: Trimeric LHCII

Identificazione Mascot Score Numero di peptidi Mw kDa/pI Numero di accessoNCBI

Major chlorophyll a/b binding protein LHCb1.1

[Spinacia oleracea]

134 2 28.4 / 5.16 gi|133917263

Lhcb2 protein [Arabidopsis

thaliana] 167 3 28.7 / 5.48 gi|4741944

Band 6, 85 kDa: Monomeric LHCII

Capitolo 3 LHCB5 (Light harvesting complex of Photosystem II 5); [Arabidopsis thaliana] 228 4 30.1 / 6.00 gi|15235029 LHCB4.2 (Light harvesting complex psii) [Arabidopsis thaliana] 187 3 31.2 / 5.85 gi|15231990

Come riportato in tabella 1 sotto le bande 1 e 3 vi sono più complessi che migrano in contemporanea. Il BN gel è infatti un sistema elettroforetico nativo ad alta risoluzione, ma come tutte le tecniche monodimensionale può essere limitato da fenomeni di comigrazione. La comigrazione può essere dovuta, sia alla massa molecolare dei complessi (per esempio in figura 3.1 la banda 2 a 565 kDa e la banda 3 a 292 kDa contengono entrambe complessi che hanno la stessa massa molecolare apparente), sia ad interazioni deboli aspecifiche che possono instaurarsi durante la migrazione tra complessi di massa molecolare differente. Tale fenomeno riduce notevolmente il numero di complessi identificabili mediante non-gel shotgun

method [102], ma soprattutto complica di molto l’interpretazione dei gels di

seconda dimensione. Infatti ad una valutazione quantitativa, una mappa 2D BN- SDS-PAGE presenta un numero di spots inferiore a quello di una mappa 2D IEF- SDS-PAGE, e questo accade perché le proteine in una 2D BN-SDS-PAGE non sono distribuite su tutta la superficie della mappa, ma bensì su linee verticali derivate direttamente dalla denaturazione delle bande di prima dimensione. Se non ci fosse comigrazione il problema sarebbe di poco conto, ma la comigrazione in prima dimensione, unita alla distribuzione in linee verticali, riduce notevolmente la capacità di identificazione anche delle componenti proteiche dei complessi multiproteici.

3.3.2 2D BN/BN-PAGE di complessi multiproteici delle membrane tilacoidali Nel tentativo di sviluppare un sistema elettroforetico che potesse in qualche

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un sistema bidimensionale era in grado di riuscire in tal senso, abbiamo cominciato valutando l’efficacia dell’unico sistema di elettroforesi bidimensionale nativa sia in prima che in seconda dimensione conosciuto, il 2D BN/BN-PAGE. Tale metodologia è stata anche essa introdotta da Schagger et al. [103] come un’evoluzione del 1D BN-PAGE per meglio comprendere la composizione stechiometrica dei supercomplessi mitocondriali (omo ed etero oligomeri di complessi multiproteici con massa molecolare totale superiore a 505 kDa) e per migliorare la risoluzione elettroforetica totale. La corsa di seconda dimensione è realizzata caricando ortogonalmente, su di un BN gel che differisce da quello di prima dimensione solo nel gradiente di acrilammide, un linea di prima dimensione. Secondo il protocollo originale, inoltre, come detergente di solubilizzazione va utilizzata la digitonina, e basse concentrazioni di un detergente non ionico (0.02% di DDM o 0.3% di Triton X-100) che devono essere aggiunte nel cathode buffer di seconda dimensione [104]. Questa accortezza permette nel gel di seconda dimensione la dissociazione dei supercomplessi (separati con il gel di prima dimensione) nei sub-complessi costituenti, senza indurre la disgregazione di quest’ultimi nelle loro componenti proteiche di base. In questo tipo di elettroforesi bidimensionale tutti i complessi multiproteici sono risolti lungo la diagonale del gel di poliacrilammide. La figura 3.2 mostra la 2D BN/BN-PAGE ottenuta da membrane tilacoidali estratte da spinacio. Il numero di spots ottenuti lungo la diagonale coincide con il numero di bande ottenuto in 1D BN-PAGE, e gli spots visibili al di sotto della diagonale sono stati identificati come sub-complessi ottenuti dalla destabilizzazione dei complessi originali durante la corsa del gel di seconda dimensione. Ad esempio nello spots 1 comigrano come nel gel monodimensionale, il fotosistema I (RCI+LHCI), il dimero del core fotosistema II ([RCII]2) e la CF0-

CF1-ATP sintasi, e nello spot 3 la porzione CF1 dell’ATP sintasi migra insieme a

fotosistema II (RCII+LHCII) e al dimero del citocromo b6/f. Contrariamente a ciò

che accade in una double SDS-PAGE (dSDS-PAGE) [33], in una 2D BN/BN– PAGE gli spots si dispongono lungo la diagonale del gel senza però mostrare quella dispersione in grado di incrementare la capacità risolutiva del sistema, questo perché molto probabilmente i complessi multiproteici più idrofobici non subiscono alcuna migrazione anomala nel gel di seconda dimensione [105]. Questo dimostra

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e spiega perché il 2D BN/BN-PAGE non è in grado di migliorare la risoluzione elettroforetica dei complessi multiproteici rispetto ad un BN gel monodimensionale.

Figure 3.2. 2D BN/BN-PAGE dei complessi fotosintetici delle membrane tilacoidali di spinacio. La seconda dimensione è stata corsa con l’aggiunta di 0.02% DDD nel cathode buffer. L’identificazione degli spot è riportata sopra la figura.

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3.3.3 2D N-LP-IEF-BN-PAGE di complessi multiproteici delle membrane tilacoidali

Nel tentativo di sviluppare un nuovo sistema elettroforetico bidimensionale nativo, si è ritenuto opportuno studiare lo stato di carica dei complessi della membrana tilacoidale. A tal fine si è corso un clear-native gel (CN-PAGE, gel non mostrato) un gel nativo monodimensionale che differisce dal BN gel solo per il fatto che i complessi migrano sulla base della propria carica elettrica totale nativa (dato che non vi è alcuna aggiunta di BBC prima della corsa elettroforetica). Tale sistema di risoluzione inferiore a quella del BN, ha permesso la caratterizzazione di 5 bande, indicando che tutti i complessi multiproteici della membrana tilacoidale avevano un punto isoelettrico nativo acido. É ben noto infatti che in un CN-PAGE migrano verso l’anodo solo i complessi che a pH 7 (il pH del gel e di tutti i tamponi) hanno una carica netta negativa, inoltre, se il pI nativo dei complessi risulta inferiore a 5.4, il CN-PAGE mostra una risoluzione elettroforetica paragonabile a quella del BN gel. Quindi il fatto che nel CN-PAGE di membrane tilacoidali fossero presenti 5 bande indicava che il pI dei nostri complessi era inferiore a 5.4. Questi risultati ci hanno spinto a pensare ad un sistema elettroforetico bidimensionale che si basasse in prima dimensione su una IEF nativa in fase liquida (N-LP-IEF) seguita da un BN-PAGE di seconda dimensione (figura 3.3). In questo modo è stato messo a punto un sistema elettroforetico che in prima dimensione sfrutta il pI nativo dei complessi multiproteici ed in seconda dimensione la loro massa molecolare apparente. Questo approccio ricalca in parte dei lavori recenti in cui una IEF denaturante in fase liquida è stata poi seguita da una 2D IEF- SDS-PAGE, per un sistema a tre dimensioni applicabile allo studio di proteomi molto complessi [107-109]. Noi abbiamo pensato di applicare la stesa idea in condizioni non denaturanti.

Sulla base delle indicazioni fornite dal CN-PAGE, la 2D N-LP-IEF-BN- PAGE è stata corsa nell’intervallo di pH 3-5, utilizzando come catolita una soluzione di HEPES 0.25 M e come anolita una soluzione di acido acetico 0.5 M. Prima della solubilizzazione, il campione (le membrane tilacoidali) è stato dializzato per una notte, con il fine di eliminare tutte le specie ioniche che avrebbero potuto interferire con la formazione di un gradiente di pH lineare

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all’interno della camera di focalizzazione. L’interazione di elettroliti con le membrane ioniche del MicroRotafor può infatti ridurre il valore di potenziale elettrico effettivamente applicato, inducendo un’alterazione della linearità del gradiente di pH che porta ad una riduzione della qualità della focalizzazione. Le membrane tilacoidali dializzate sono state poi solubilizzate con DDM [99], per poi essere diluite con glicerolo e una soluzione di carrier anfoliti (pH 3.0-6.0), mantenendo una concentrazione finale di DDM e BisTris rispettivamente dell’1% (p/V) e di 3.0 mM. In accordo con il protocollo originale di BN, l’aggiunta del glicerolo è stata messa in atto per stabilizzare la sfera di idratazione intorno ai complessi multiproteici, incrementandone così la solubilità e la stabilità. L’aggiunta del detergente sino ad un rapporto finale DDM/proteina di 4 (g/g) è stata attuata per aumentare la solubilità dei complessi in corrispondenza del loro pI. La concentrazione del Bis-Tris è stata ridotta al valore di 3 mM (da un valore iniziale post-solubilizzazione di 25 mM) perché per alte concentrazioni (superiori a 4 mM) il gradiente di pH lungo la cella di focalizzazione risultava tamponato al valore di pKa del tampone. Questo riduceva la capacità risolutiva del focusing, facendo sì che diverse frazioni avessero lo stesso valore di pH. Per correre la N-LP-IEF l’aggiunta del BBC non era necessaria (anzi sarebbe stata deleteria), in quanto i complessi multiproteici migrano all’interno del gradiente di pH solo sulla base della propria carica netta totale sino al punto in cui tale carica non diviene nulla (pI). Il cocktail di focalizzazione è stato poi caricato in ogni compartimento della camera di focalizzazione del MicroRotofor e il tutto è stato poi focalizzato per 270 min.alla potenza costante di 1 W. Per evitare la destabilizzazione dei complessi e la possibilità di diffusione degli stessi dalle proprie zone di focalizzazione, la corsa è stata realizzata ad un temperatura costante di 4° C. Dopo il focusing le 10 frazioni del MicroRotofor sono state raccolte separatamente, e dopo aggiunta del BBC (ad una concentrazione finale di 0.5 % p/v), sono state caricata su di un BN gel convenzionale di seconda dimensione. In questa fase l’aggiunta del BBC era necessaria al fine di conferire ai complessi una carica netta negativa che li facesse migrare verso l’anodo. Il gel di seconda dimensione ha presentato tempi di corsa più lunghi rispetto ad un 1D BN-PAGE, probabilmente perché il BBC aggiunto

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dopo la focalizzazione non riesce a spiazzare completamente gli anfoliti carrier anfoliti già legati ai complessi.

Da una attenta osservazione della figura 3.3 si capisce come il sistema elettroforetico proposto non presenti ancora una risoluzione elettroforetica ottimale. Ad esempio la banda a 565 kDa nella quale normalmente in un 1D BN-PAGE comigrano 3 complessi (Ctr, figura 3.3) è stata suddivisa dopo la 2D N-LP-IEF-BN- PAGE in 5/6 bande, indicando una scarsa risoluzione della prima dimensione nativa.

3.3.4 2D N-LP-IEF-BN-PAGE di complessi multiproteici delle membrane tilacoidali con 1.5 M urea

Con l’intento di migliorare la risoluzione elettroforetica di prima dimensione (N-LP-IEF) si è pensato di aggiungere un agente caotropico al cocktail di focalizzazione. La scarsa risoluzione era infatti attribuibile ad interazioni deboli (legami idrogeno, forza di Van der Waals e idrofobiche in generale) che venivano ad instaurarsi tra i complessi multiproteici durante la focalizzazione. Solo l’aggiunta di un agente come l’urea, in grado di contrastare la formazione di tali legami poteva migliorare la qualità della separazione (come accade in condizioni denaturanti in

Figure 3.3. Mappa 2D nativa dei complessi fotosintetici delle membrane tilacoidali di spinacio realizzata in prima dimensione con una IEF nativa in fase liquida e in seconda dimensione con un BN gel (2D N-LP-IEF- BN-PAGE). La focalizzazione di prima dimensione è stato realizzata nell’intervallo di pH 3-5. Dalla linea 1 alla linea 10 sono state caricate sul gel di seconda dimensione le 10 frazioni raccolte del MicroRotafor dopo la focalizzazione. Il campione corso nella linea Ctr contiene membrane tilacoidali non focalizzate. Il gel è stato colorato con BluSilver e sono stati focalizzati in tutto 3 mg di proteina.

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Figure 3.4. 1D BN-PAGE di complessi fotosintetici delle membrane tilacoidali di spinacio in presenza di urea. L’urea è stata aggiunta dopo la solubilizzazione dei campioni. La concentrazione finale di urea è riportata sopra ogni linea. Sono stati caricati 30 µg di campione per ogni linea.

una 2D-IEF-SDS-PAGE), permettendo a tutti i complessi di migrare indipendentemente sino al loro pI nativo. Per scegliere una concentrazione adeguata di caotropico in grado di migliorare la risoluzione senza causare la degradazione dei complessi multiproteici, si è deciso di correre un 1D BN-PAGE di membrane tilacoidali in presenza di una concentrazione di urea variabile tra 0 e 5 M. L’urea è stata aggiunta ai campioni dopo la solubilizzazione e prima del caricamento.

Capitolo 3

Il gel in figura 3.4 mostra chiaramente che le linee 3 e 4, con una concentrazione di urea rispettivamente di 1 e 2 M, mostrano lo stesso bandeggio della linea 1, che non contiene urea. Per concentrazioni di urea più alte (linee 5, 6 e 7) si assiste invece ad un progressivo aumento del numero delle bande, interpretabile con uno sfaldamento dei complessi. Si è quindi deciso di correre la N- LP-IEF in presenza di una concentrazione di urea pari a 1.5 M, mantenendo una temperatura di 4° C alla quale l’urea nella cella di focalizzazione del MicroRotofor non sembrava cristallizzare.

La figura 3.5 mostra il risultato della 2D N-LP-IEF-BN-PAGE in cui la focalizzazione è stata realizzata con l’aggiunta di 1.5 M urea al cocktail di focalizzazione. Comparando la figura 3.5 con la figura 3.3 si nota un netto aumento della risoluzione elettroforetica di prima dimensione, dimostrato (ad esempio) dalla presenza di sole 2 bande a 565 kDa (prima in assenza di urea erano 5). Per valutare la riproducibilità della focalizzazione la corsa è stata ripetuta 5 volte, e i valori di pH e di concentrazione proteica di ciascuna frazione del MicroRotofor sono stati graficati rispetto al numero delle frazioni stesse (figura 3.6 A). La deviazione standard delle misure di pH oscillava tra un valore massimo di 0.25 (per la frazione 10) e un valore minimo di 0.09 (per la frazione 6) indicando un buon livello di riproducibilità dell’analisi. La non linearità del gradiente di pH riscontrabile in figura 3.6 A può essere riconducibile alla presenza dell’urea, che aumentando la viscosità del mezzo di focalizzazione può indurre uno shift del pH specialmente nella regione basica. Questo si traduce in una parziale perdita di conducibilità elettrica, che spiega perché in presenza di urea i V·h totali necessari alla completa focalizzazione sono stati superiori che in assenza della stessa. Ciò è dimostrato in figura 3.6 B, nella quale è stato riportato il gradiente di voltaggio registrato in presenza (linea tratteggiata) ed in assenza (linea continua) di urea durante la focalizzazione condotta per 270 min ad una potenza costante di 1W. In presenza di urea il voltaggio di inizio corsa è stato superiore di 30 V e durante la corsa tale divario è andato incrementando proprio a causa della maggiore viscosità del mezzo di focalizzazione.

Il più grande vantaggio del metodo elettroforetico bidimensionale proposto risiede nella possibilità di valutare il valore di pH di ogni singola frazione. Questo

Capitolo 3 . N-LP-IEF-B N-PAGE di com p lessi foto sint etic i delle m e mbrane tilacoidali di spinacio in pre s e n za di 1.5 M urea. L’id entificazio ne delle band e è bella 2. So pra ogni linea è ripo rtata la misu ra d e l p H con l a de vi azio ne stand ard per og ni frazi one ra cco lta dal Mi cro R otafor. L’ide n tificazi on e realizzata attrave rso L C -E SI-MS/MS è la se gue nte: band a 1 (56 5 kDa, pI 4. 49 ± 0.25) A T Pase; b and a 2 (5 65 kDa, pI 4. 62 ± 0.18) PS I HCI) e PSII dimeric co re; ban d a 3 e 4 (453 kDa, pI 4.99 ±0.15, 5.63

±0.25) PSI core; banda

5 (292 kDa, pI 4.62±0.1 8 ) P S II c ore e dimero d e l o b 6

/f; banda 6 (193 kDa, pI 4.62±0.18) PSII

core meno CP-43; bande 7, 8 e 9 (148 kDa, pI 3.85±0.12, 4.01±0.09, 4.31±0. 15) trimeri de lle LhcII; 5 kDa, pI 5.6 3 ±0.25 ) mo n o mero del Cyt b 6 /f; bande 11 e 12 (105 kDa, pI 4,99± 0.15, 5.63±0.25) dim e ro della CP 43; bande 13, 14 and 15 (85 01±0. 09, 4.31±0.1 5 ) antenn e mo nome riche de l PSII.

Capitolo 3

Figure 3.6. Pannello A: valori di pH e concentrazione proteica misurati per ciascuna delle 10 frazioni raccolte dal MicroRotofor dopo il focusing in presenza di urea 1.5 M. Pannello B: comparazione dei gradienti di voltaggio registrati durante la focalizzazione in presenza (linea tratteggiata) ed in assenza (linea continua) di urea.

Capitolo 3

ci ha permesso di misurare il pI nativo dei complessi della membrana tilacoidale, ottenendo dei valori che, in linea con i dati del CN-PAGE, oscillavano tra un minimo di 2.82 (frazione 1) ed un massimo di 5.63 (frazione 10). La tabella 2 riporta la caratterizzazione (per peso molecolare e pI nativi) e le identificazioni di ciascuna banda del gel di figura 3.5. L’identificazione dei complessi è stata realizzata sfruttando il metodo proposto da Fandino e collaboratori. [102]. Come ci si aspettava i complessi che nel 1D BN-PAGE comigravano nella stessa banda, ora, con l’introduzione di una prima dimensione di focalizzazione, sono stati suddivisi in più bande. Questo split ha migliorato anche la qualità delle identificazioni