Paragone tra le colonne monolitiche e impaccate tramite efficienza

efficienza cromatografica

Un metodo classico per paragonare colonne di differente impaccamento `e tramite lo studio della diversa efficienza cromatografica. Nel lavoro svolto, per la colonna Symmetry gli analiti sono stati iniettati a diverse velocit`a di flusso, da 0.25μL/min a 6μL/min. Per le due colonna monolitiche invece si `e arrivati fino a 10μL/min, e questo `e stato possibile perch´e grazie alla loro struttura presentano una minor resistenza al flusso e anche ad elevate velocit`a non si hanno pressioni eccessive, cosa che con la colonna impaccata invece avviene. Tutti i picchi iniettati sono stati singolarmente fittati con i diversi modelli e per ciascuno si `e scelto il fitting migliore. Dai valori ricavati per il momento primo e il momento secondo centrale sono stati calcolati i valori dell’efficienza cromatografica, H, attraverso l’equazione 2.15. Nella Figura 3.39 sono riportati i valori di H (m) contro i valori della velocit`a lineare u (m/s) per le tre colonne nal caso del composto pi`u ritenuto, il Butilbenzene. Per la colonna Symmetry i dati riportati sono di numero inferiore dato che le alte velocit`a di flusso non sono raggiungibili. Si pu`o vedere dalla figura come le

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 x 10−3 0 0.5 1 1.5x 10 −4 u H Butilbenzene Colonna Symmetry Colonna KGy Colonna ACR

Figura 3.39: Grafico H vs. u per l’Etilbenzene

colonne monolitiche, che presentano una minor resistenza di flusso, abbiano un valore di H maggiore rispetto alla colona impaccata, che invece ha una maggiore resistenza al flusso [93].

I valori di H, posti in grafico contro i corrispettivi valori di velocit`a lineare (u₀), sono stati fittati con il modello di Van Deemter (Equazione 2.3). I valori ricavati per i tre parametri A, B e C sono riportati nella tabella 3.9.

Per quanto riguarda il termine della dispersione Eddy (A), la colonna KGy, quella con il linker di lunghezza minore, presenta il valore pi`u basso in tutti i casi studiati. Il termine di diffusione assiale, B, presenta valori di circa lo stesso ordine di grandezza in ogni caso, e non porta ad una discriminazione sull’efficienza totale delle colonne. Il termine riguardanti gli effetti di trasferimento di massa (C) presenta i valori minori nel caso della colonna impaccata, ad eccezione del caso della Benzaldeide, il composto meno ritenuto. Le colonne monolitiche presentano una bassa resistenza e permettono cos`ı di lavorare con velocit`a di flusso maggiori, il che porta a tempi pi`u brevi, per`o presentano il termine riguardante i trasferimenti di massa con un valore maggiore rispetto alla colonna classica impaccata.

Symmetry ACR KGy

Benzaldeide A (cm) 4.30E-04 3.88E-04 5.89E-06 B (cm2s−1) 2.66E-05 2.93E-06 1.59E-05 C (s−1) 4.50E-03 2.89E-03 5.58E-03 Nitrobenzene A (cm) 3.07E-04 8.34E-04 4.28E-06 B (cm2s−1) 3.27E-05 1.09E-05 2.65E-05 C (s−1) 4.30E-03 5.11E-03 1.78E-02 Etilbenzene A (cm) 3.42E-05 1.30E-04 6.53E-06 B (cm2s−1) 5.92E-05 2.19E-05 2.66E-05 C (s−1) 4.15E-03 7.31E-03 1.94E-02 Butilbenzene A (cm) 5.27E-04 7.63E-04 1.24E-05 B (cm2s−1) 6.62E-05 1.09E-05 2.21E-05 C (s−1) 1.25E-03 5.68E-03 2.65E-02 Tabella 3.9: Dati fitting Van Deemter colonne Symmetry, ACR e KGy

3.5.3

Paragone colonne monolitiche e impaccate tramite metodi

cinetici

I plot di tipo cinetico permettono di paragonare colonne con diverso tipo di impaccamen- to, valutando variabili diverse rispetto al classico grafico di Van Deemter, che considera esclusivamente l’efficienza e la velocit`a lineare [94].

Per permettere una percolazione costante di fase mobile attraverso una colonna cro- matografica si deve mantenere una data pressione, ΔP , legata alle caratteristiche della colonna, della fase mobile e della velocit`a del flusso:

ΔP = μuFL

k_p,F (3.26)

dove μ `e la viscosit`a della fase mobile, u_F `e la velocit`a superficiale, ottenuta dal prodotto della velocit`a lineare u<sub>0</sub>per la porosit`a totale della colonna, L `e la lunghezza della colonna e k<sub>p,F</sub> `e la permeabilit`a della colonna, che nel caso di una colonna impaccata pu`o essere ottenuta dal prodotto tra la porosit`a specifica della colonna k_F per il diametro delle

particelle impaccanti elevato al quadrato. Nel caso di una colonna impaccata la porosit`a specifica della colonna `e legata alla porosit`a esterna dalla seguente equazione:

k_F = ε

3 e

180(1− ε_e)2 (3.27)

la determinazione della porosit`a nelle colonne monolitiche pu`o essere effettuata come nelle colonne impaccate tramite cromatografia ”ISEC”, con l’iniezione di standard di polistirene [86]. Nel caso di colonne monolitiche la permeabilit`a della colonna viene determinata da:

k_p,F = l2 ε

3 e

(1− ε_e)2 (3.28)

Le colonne monolitiche presentano in genere una porosit`a esterna maggiore delle colonna impaccate, che comporta anche un valore di permeabilit`a maggiore. Nella teoria dei plot di tipo cinetico vengono considerate due equazioni principali:

t₀ =  ΔP μ   k_p,Fε_T u2_F  (3.29) N =  ΔP μ   k_p,F u_FH  (3.30) Un metodo utile per confrontare colonne con differente impaccamento si pu`o ottenere tramite dei grafici (chiamati plot tipo Poppe) che pongono in ordinata il log(t₀/N ) e in

ascissa il valore logN [4]. Considerando che la lunghezza della colonna `e equivalente a

L = HN = t₀u₀`e facile capire che questi grafici siano molto simili al plot di H contro u<sub>0</sub>, dato che il log(H/u<sub>0</sub>) `e uguale a log(t₀/N ) [93]. La figura 3.40 riporta i valori per questo

tipo di grafico per le tre colonne studiate nel caso del Butilbenzene. Da questo tipo di grafico si possono vedere gli effetti del diametro delle particelle. Colonne impaccate con particelle pi`u piccole danno separazioni pi`u veloci, ma per un numero maggiore di piatti sevono colonne con particelle pi`u grandi [95].

Dalla figura sembrerebbe che la colonna di tipo impaccato abbia il diametro delle particella di dimensione minore, mentre le due colonne monolitiche presentino un diametro delle particelle molto simile. Per quest’ultimo tipo di colonne la determinazione del d_p`e un punto critico in quanto, avendo un corpo unico all’interno della colonna, non presentano

Figura 3.40: Plot tipo Poppe per Butilbenzene

delle particelle porose classiche, e il valore del diametro deve essere ricavato tramite misure indirette o approssimazioni [96–99].

Lo studio di altri plot di tipo cinetico pu`o essere affrontato considerando altre varia- bili ricavate dalle due equazioni fondamentali della teoria cinetica [95, 100, 101], ma nel nostro caso non sono risultate utilizzabili per discriminare le caratteristiche del diverso impaccamento delle colonne studiate.

3.6

Sviluppo di un metodo analitico per la determi-

nazione quantitativa dello Iomeprolo nel plasma

umano.

Lo studio di un farmaco utilizzato come mezzo di contrasto per l’analisi delle malattie renali, lo Iomeprolo [102], `e stato effettuato su una colonna fenilica, al fine di svilippare un metodo analitico per la sua determinazione quantitativa nel plasma umano. Per la corretta determinazione e quantificazione si `e fatto uso di uno standard interno (Iopromide). E’ stato utilizzato un sistema bidimensionale al fine di purificare il campione da tutte le proteine contenute nel plasma, si `e utilizzata una colonna SPE (solid phase extraction), che riteneva solo le molecole di piccole dimensioni, come l’analita di interesse, mentre non tratteneva le molecole pi`u grandi, grazie ad un particolare impaccamento di tipo RAM (restricted access material) in serie con una colonna analitica [103, 104]. Per la scelta della colonna analitica da utilizzare `e stato effettuato uno studio con un kit di colonne con diverso impaccamento e diversa lunghezza (POPLC- Phase OPtimised Liquid Chromatography). Definendo una fase mobile iniziale con le caratteristiche volute (pH, composizione, forza ionica) si inietta una miscela dei componenti da separare in colonnine impaccate con diversi tipi di particelle (colonna C18 classica, colonna C18 con gruppi amidici, colonna fenilica, colonna con gruppi CN, colonna C30). I dati di ritenzione e selettivit`a ottenuti dalle varie separazioni vengono introdotti in un software che calcola la composizione dell’impaccamento e la lunghezza ottimale della colonna da utilizzare. Nel nostro caso, studiando la separazione dello Iomeprolo e Iopromide, la scelta della fase mobile `e stata una miscela Metanolo (35%) e Acqua di MilliQ (65%) e la colonna indicata dal software per la miglior separazione in questo caso `e una colonna fenilica di lunghezza 250 mm. L’analisi dei componenti `e stata divisa in alcuni step: il frazionamento, che avveniva nella colonna SPE, durante il quale le proteine del plasma venivano eliminate, la fase di trasferimento degli analiti dalla colonna SPE a quella analitica e la fase di separazione. Durante quest’ultima fase la colonna SPE veniva lavata con Metanolo puro e ricondizionata con la fase mobile. Paragonando l’efficienza della colonna POPLC con

una colonna commerciale di simili caratteristiche (impaccamento fenilico ma pi`u corta e con particelle pi`u piccole) si `e deciso di utilizzare la seconda colonna, in quanto presentava una migliore efficienza. Le condizioni sperimentali sono state ottimizzate in fatto di composizione di fase mobile e temperatura. Al fine di validare il metodo sono stati studiati diversi parametri. La selettivit`a `e stata testata con il confronto tra un plasma non trattato e uno trattato con l’analita. I limiti di deteczione e quantificazione sono stati definiti in relazione al noise della linea di base (moltiplicandolo rispettivamente per 3 e per 10). Il recupero `e stato misurato confrontando i valori ottenuti con e senza l’utilizzo della colonna SPE. La linearit`a del metodo `e stata ottenuta da un fitting lineare dei valori di concentrazione calcolati e quelli introdotti. La precisione `e ottenuta considerando i valori della deviazione standard di vari campioni preparati. L’accuratezza del metodo `e stata stimata dalla differenza percentuale tra il valore calcolato e quello vero della concentrazione dei campioni standard.