§ 3.1 Materiali e metodi
§ 3.1.1 Descrizione del miele impiegato nella prova sperimentale
Il miele impiegato per il nostro studio è stato gentilmente donato dal Sig. Michael thien, apicoltore e vivaista tedesco la cui azienda ha sede nel nord ovest del paese, il Sig. Tien è specializzato nella produzione vivaistica di diverse piante di notevole interesse apistico come ad esempio il Silphium perfoliatum o Evodia daniellii, inoltre produce, tra gli altri, un miele di tiglio a partire da piante della varietà Tilia cordata e non platyphyllos cioè il tipo spontaneo, selvatico, presente in quelle zone come vere e proprie aree boschive.
Si è preferito usare questo miele perché alcune parti della pianta Tilia cordata presentano un maggior contenuto in polifenoli e flavonoidi rispetto alle varietà coltivate comunemente a scopo ornamentale.
Il miele fornito è stato sottoposto preventivamente ad indagine melissopalinologica dal Dr. Cesare Biondi con i seguenti risultati e con questo commento:
“Si tratta di miele di Tiglio con una componente (meno importante) di melata e già all'assaggio si percepisce chiaramente la tipologia di prodotto. Il polline di tiglio, come sai, è fortemente iporappresentato e quindi una percentuale del 6% va benissimo per poterlo considerare un monoflora; si nota, nello spettro, la presenza di pollini che si ritrovano frequentemente nei mieli di melata (graminaceae, mercurualis, artemisia, castenea ecc.; castanea, tra l'altro, accompagna spesso i mieli di Tiglio). Nello spettro ho trovato un paio di granelli che, sulla base di alcune caratteristiche quali grandezza, natura della superficie e forma delle aperture, penso possano essere di Evodia tetradium daniellii. Non sono però
totalmente sicuro perché non ho un campione specifico di polline di E. Danielli in palinoteca (ho solo foto di polline di altre specie di Evodia) e perché i due granelli fondatamente sospetti erano ammassati ad altre strutture.”
Miele analizzato (campione liquido, ambrato):
Specie botanica % di polline nello spettro
Acer P Artemisia 3 Asparagus acutifolius gr 8 Brassica f 6 Castanea 33 Chenopodiaceae P Compositae A 4 Compositae S (Carduus f) 1 Erica P Evodia (?) P Hedera 2 Labiatae M (<25µ) P Labiatae M (>25µ) P Mercurialis 28 Oleaceae P Parthenocissus P Poligonaceae (altre) P Prunus f 1 Rhamnaceae P Robinia 2 Rumex P Salix P Sedum f P
Tilia 6
Trifolium pratense gr P
Trifolium repens gr 5
Umbelliferae H P
Zea P
Elementi di melata diversi
Materiale microcristallino presente
Note:
Per praticità, le percentuali sono arrotondate all’1% P = presenti nello spettro in % molto inferiore all’1%
§ 3.1.2 Selezione e rivitalizzazione dei ceppi batterici utilizzati nella ricerca
I ceppi batterici impiegati per la prova (tutti ceppi depositati presso l’American Type Culture Collection – ATCC) sono stati prelevati dalla ceppoteca del Dipartimento di Scienze Veterinarie dove vengono normalmente stoccati a temperatura di -80 °C e sono i seguenti:
✔ Enterococcus faecalis VAN B V583 E ✔ Enterococcus faecalis ATCC 19433 ✔ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ✔ Escherichia coli ATCC 15325
✔ Staphylococcus aureus ATCC 6539 ✔ Salmonella tiphymurium ATCC 14028
(Tryptone Soy Agar), a 37 °C per 24 ore. Nei casi in cui la crescita non risultasse ottimale con le condizioni precedentemente descritte, viene eseguito un passaggio in terreno liquido Brain Hearth Infusion (BHI) a 37 °C per 24 ore in modo da rendere le colonie adatte alla semina sui rispettivi terreni elettivi o selettivi differenziali.
Nello specifico i terreni utilizzati sono stati:
Tipologia di terreno Ceppo batterico
Kanamicina Aesculina Azide Agar (KAAA) Enterococcus spp.
Pseudomonas Agar Base Pseudomonas aeruginosa
Tryptone Bile X-Glucuronide Escherichia coli
Baird Parker (BP) Staphylococcus aureus
Salmonella-Shigella Agar (SS) Salmonella tiphymurium.
§ 3.1.3 Determinazione del valore di MIC (minima concentrazione inibente) del miele di tiglio nei confronti dei diversi ceppi batterici.
Per la ricerca dell'eventuale attività antibatterica del miele da testare è stato utilizzato il sistema della Minima Concentrazione Inibente (MIC), definita come la concentrazione più bassa del composto in esame in grado di inibire la crescita di un dato microrganismo. Questa è stata valutata nei confronti di ciascun ceppo ATCC rivitalizzato sopracitato. Le concentrazioni di miele testate rientravano in un range compreso tra 0,43 mg/ml (diluizione ottimale per il raggiungimento di una sufficiente fluidità del mezzo) e 0,00042 mg/ml.
L’inoculo batterico è stato standardizzato mediante impiego della scala turbidimetrica di McFarland (punto 0,5 ovvero 1,5x108 batteri), dispensando le colonie batteriche in 2 ml di
soluzione fisiologica sterile fino a raggiungere la torbidità desiderata. Successivamente un campione di miele è stato disciolto in terreno liquido BHI nel rapporto di 0,43 mg di miele/1 ml di BHI. Tale soluzione è stata in seguito filtrata, mediante filtri da siringa da
0,45 μm.
Diluizioni scalari della soluzione contenente il miele sono state eseguite all’interno di micropiastre a 96 pozzetti.
In ogni pozzetto della prima colonna sono stati dispensati 190 μl di miele disciolto in BHI e filtrato Ciascuno di questi pozzetti conteneva quindi la concentrazione di miele più alta da testare (0,43 mg/ml).
Successivamente, usando la pipetta multicanale, sono stati dispensati 95 μl di BHI sterile nei rimanenti pozzetti. L’undicesima colonna è stata riservata al controllo positivo di crescita (BHI con l’inoculo batterico), mentre la dodicesima colonna al controllo negativo (BHI sterile).
Le diluizioni scalari sono state quindi effettuate tramite pipetta multicanale, prelevando 95 μl dai primi pozzetti e dispensandoli nella seconda colonna e procedendo così fino ad arrivare alla colonna riservata al controllo positivo.
Infine, partendo dalla colonna del positivo, sono stati inoculati 5 μl dei differenti ceppi di microrganismi ATCC da saggiare nei rispettivi pozzetti della prima, seconda, quarta, quinta, sesta e ottava riga (vedi foto 11).
Ultimato l’allestimento la micropiastra chiusa con l’apposito coperchio, è stata avvolta in stagnola e incubata a 37 °C in camera umida, per 24 ore, dopo l'incubazione, è stato verificato che in ciascun controllo negativo non vi fosse presenza di crescita microbica e che questa fosse invece presente nei pozzetti riservati al controllo positivo.
E’ stata assunta come Minima Concentrazione Inibente, la concentrazione di miele contenuta nel pozzetto che precedeva la comparsa della torbidità. La prova è stata effettuata in doppio e ripetuta rispettando le medesime condizioni per tre volte in modo da verificare la ripetibilità e assicurarsi così della validità interna della stessa.
CAPITOLO 4 RISULTATI
Il miele di tiglio è risultato avere una azione inibente la crescita di tutti i microrganismi testati ai valori di MIC indicati nella tabella seguente:
Microrganismi Valori di MIC
Enterococcus faecalis VAN B V583 E 0,02687 mg/ml
Enterococcus faecalis ATCC 19433
0,05375 mg/ml
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0,215 mg/ml
Escherichia coli ATCC 15325
0,215 mg/ml
Staphylococcus aureus ATCC 6539
0,05375 mg/ml
Salmonella tiphymurium ATCC 14028 0,1075 mg/ml
Tabella 4: valori di MIC riscontrati per il miele di tiglio nei microrganismi ATCC testati.
CAPITOLO 5 CONCLUSIONI
La tabella 4 riassume i risultati e rende evidente come il miele analizzato risulti attivo nei confronti di tutti i ceppi batterici utilizzati nella prova, in particolare si evidenziano questi fatti:
1. i valori di MIC più bassi (quindi efficacia a diluizioni più alte) si hanno nei confronti di Enterococcus faecalis VAN B V583 E, e di seguito Enterococcus faecalis ATCC 19433;
2. buona efficacia è riscontrata anche nei confronti di Staphylococcus aureus ATCC 6539;
3. minore efficacia è riscontrata nei confronti di Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 15325 e Salmonella tiphymurium ATCC 14028; 4. il miele risulta maggiormente attivo nei confronti dei batteri Gram positivi, meno
sui gram negativi, questo conferma i dati presenti in letteratura (Marco Fidaleo et al.).
Risulta evidente che il miele, oltre ad essere un alimento genuino e naturale, ha anche una serie di peculiarità importanti, il suo studio come prodotto ad attività antibatterica è ancora una strada aperta, com notevoli potenzialità, è ancora da sondare la singola peculiarità di ogni tipologia di miele monoflora, e, considerando che solo nel nostro paese ne sono prodotte 32 varietà differenti, è evidente che il lavoro da compiere è notevole. L'importanza del miele come antibatterico andrebbe inquadrata in un'ottica di utilizzo in alternativa o in concomitanza rispetto alla terapia antibiotica classica, questo per il fatto che sempre più spesso ci troviamo di fronte a batteri che offrono fenomeni di resistenza alle terapie tradizionali.
Bibliografia e fonti.
• “Api e impollinazione” Mauro Pinzauti 2000; • “Le api” Alberto Contessi Edagricole 2010;
• “Conoscere il miele” Istituto Nazionale di Apicoltura, Bologna a cura di Livia Persiano Oddo, Lucia Piana, Anna Gloria Sabatini;
• “I mieli regionali italiani – caratterizzazione melissopalinologica” C.R.A. Istituto Sperimentale per la zoologia Agraria, sezione apicoltura, Roma;
• “Temi di apicoltura moderna” Mauro Pinzauti et al.;
• “The antibacterial activity of honey variation in the potency of the antibacterial activity” Peter C. Molan;
• “Nutraceutical potential of monofloral honeys produced by the Sicilian black honeybees (Apis mellifera ssp. Sicula)” Gian Carlo Tenore, Alberto Ritieni, Pietro Campiglia, Ettore Novellino 2012;
• “Antimicrobial activity of some Italian honey against pathogenic bacteria” Marco Fidaleo, Antonio Zuorro, Roberto Lavecchia 2011;
• “Characterization of Italian honeys (Marche Region) on the basis of their mineral content and some typical quality parameters” Marcelo Enrique Conti, Jorge Stripeikis, Luigi Campanella, Domenico Cucina e Mabel Beatriz Tudino 2007;
• “Le proprietà antibatteriche naturali del miele” S. Bogdanov e P. Blumer Centro di ricerche apicole Berna 2001
• “Antibacterial activity of different natural honeys from Transylvania, Romania.” Vica ML, Glevitzky M, Dumitrel GA, Junie LM, Popa M., 2014
541 www.rsc.org/foodfunction
• “Miele di tiglio – dove api e uomini laboriosi vivono sotto tigli ombrosi” S. Bogdanov, K Bieri, V. Klichenmann, P. Gallmann, F. X. Dillier, Centro di ricerche apicole Berna 2006 • “Guida alla Vegetazione d'Europa” Polunin, O. e M. Walters.1987.
• http://www.mieliditalia.it/ • http://www.bienenbaum.com/. • http://www.agraria.org/ • http://www. evodiahupehensis.com/ • http://www.webmd.com/ • http://www.apitalia.net/ • http://www4.uuninsubria.it • http://www.mielidautore.it/ • http://www.losperonenuovo.it/